沉淀和拉下化验

Biochemistry

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Summary

联合沉淀 (CoIP) 和下拉法是密切相关的方法, 以确定稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。这些方法与沉淀有关, 这是一种将靶蛋白与游离蛋白抗体结合的方法。在 CoIP, 抗体结合蛋白本身绑定到另一个不与抗体结合的蛋白质, 这是一个分离过程, 保存蛋白质-蛋白质复合物。下拉法的区别是, 亲和标记的诱饵蛋白取代抗体, 亲和层析是用来分离蛋白蛋白复合物。

这个视频解释 CoIP, 下拉化验, 并在实验室的实施。包括用于纯化和分析束缚蛋白的试剂、仪器和仪器, 涵盖了每种技术的 step-by 步骤协议。此外, 该视频的应用部分描述了一个研究 myxovirus 蛋白如何抑制流感核的过程, 通过下拉法对钙调素的作用进行了调查, 并对表征瞬态蛋白相互作用。

蛋白质-蛋白质相互作用在多种生物功能中起着重要作用。大多数蛋白质-蛋白质相互作用和它们的生物效应尚待确定。联合沉淀, 或 CoIP, 和下拉法是两个密切相关的方法, 以确定稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。这段视频将介绍这两种化验方法的原理、它们的一般实验室程序以及这些技术的应用。

CoIP 和下拉法是沉淀的变种, 一种从复杂溶液中选择性分离蛋白质种类的方法。在沉淀的实验中, 特定于靶蛋白的抗体被允许在样本中形成免疫复合物。然后, 在一个坚实的支持, 通常蛋白质 a 绑定到一个琼脂珠的复合。任何未捕获的蛋白质都被离心步骤除去。然后从抗体和固体支持中释放蛋白质, 在减少 SDS 页样本加载缓冲中沸腾。

沉淀是以同样的方式进行的, 除了完整的蛋白质复合物被捕获到坚实的支持。抗体与靶蛋白结合在一起, 这反过来又绑定到另一种不被抗体靶向的蛋白质。在沉淀中, 蛋白质复合体从抗体和固体支持中通过沸腾在减少 SDS 页样本加载缓冲区中释放出来。

下拉式测定类似于 co-immunoprecipitation, 与抗体相反, 只在使用 "诱饵" 蛋白时有所不同。通过分子生物学技术, 这种诱饵蛋白的设计与亲和力标签, 如一系列的组氨酸残留物。这些亲和标记在 "Chromatography-based 生物分离" 中描述。然后在固定的亲和配体上捕获该蛋白质。捕获的蛋白质, 然后孵化的样本, 其中含有蛋白质, 形成配合 "诱饵"。蛋白质复合体是从亲和性支持中释放出来的, 其方法是用含有竞争性分析物的溶液进行洗涤, 其特定于 "诱饵" 蛋白上的标签。下拉法有助于确认 co-immunoprecipitation 预测的蛋白质相互作用, 以及发现未知的蛋白质相互作用。

现在, co-immunoprecipitation 和下拉分析的原理已经讨论过了, 让我们看看他们的实验室程序。

首先让我们讨论 co-immunoprecipitation。对一系列的离心管, 添加了以下内容: PBS 缓冲剂和50% 蛋白 a-琼脂的溶液, 一种与抗体结合的树脂蛋白复合物。离心管被旋转以确保适当的分布, 然后用额外的 PBS 缓冲液冲洗树脂。细胞裂解物, 含有所需的蛋白质, 和2微克的抗体被添加到离心管, 和混合物是旋转1小时在4° c。这些珠子是用离心法颗粒的, 上清液被丢弃, 珠子 re-washed 三次, 用缓冲器除去 non-bound 蛋白。含有抗体-蛋白质复合物的念珠在减少 sds 页样本加载缓冲, 用于从抗体中去除复合物, 并通过 sds 页和免疫进行分析。

现在我们将讨论下拉化验的程序: "诱饵" 蛋白是用适当的亲和标记在质粒中表达的。在达到对数相生长后, 细胞被裂解, 然后离心。悬浮亲和-琼脂珠, 捕获生物素标记的 "诱饵" 蛋白, pipetted 成一个离心管。然后离心的珠子和上清小心地被抽走。然后用缓冲器、离心和清液去除珠子。

含有假定的 "猎物" 蛋白的细胞, 其对 "诱饵" 蛋白有亲和力, 可通过离心来收获。然后将上清液添加到含有该树脂的离心管中, 并在4° c 下孵育 3 h 在振动筛上。然后将树脂离心, 上清液除去, 树脂洗净以除去 non-bound 蛋白。将洗脱缓冲液添加到树脂中, 并在室温下孵育30分钟的混合物。然后对树脂进行离心, 用免疫分析了含有所需络合物的上清液。

现在我们已经复习了程序, 让我们来看看 co-immunoprecipitation 和下拉分析的一些有用的应用。

沉淀可有助于更好地理解酶的作用机制。Myxovirus, 或 Mx-, 抗性蛋白抑制广泛的病毒, 包括甲型流感, 其机制是不太了解。沉淀用于研究小鼠 Mx1 蛋白与流感核的相互作用。

下拉式分析在研究第二信使的作用方面证明是有用的, 它们是从细胞环境中传达信号的蛋白质。它们是信号通路的一个组成部分, 其中多种蛋白质相互作用以响应环境的提示。钙离子作为次级信使通过结合钙调素, 这反过来, 绑定到多种蛋白质, 调解多种类型的生物反应。如果没有钙, 这种蛋白质就不能结合到钙质钙调素。

在钙离子存在或缺乏的情况下, 进行了下拉试验, 以测试蛋白质是否能结合到调钙素。

共沉淀和下拉法通常用于分析稳定或强蛋白相互作用, 但不是瞬态的。最近的发展, 下拉测定, HaloTag, 简化了研究的瞬态蛋白相互作用;HaloTag 是一种基因编码的蛋白质融合标签, 融合到感兴趣的蛋白质, 能够化学反应与代固体支持。如果需要功能分析, 蛋白质复合物, 减去标签, 在其整体可以通过孵化与烟草蚀刻病毒蛋白酶分离。

你刚刚看了朱庇特的视频 co-immunoprecipitation 和下拉化验。本视频介绍了这两种方法的原理、一般的实验室程序以及它们的一些应用。

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Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生物化学精要. 沉淀和拉下化验. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

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