Co-inmunoprecipitación y el ensayo de Pull-Down
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Overview
Co-inmunoprecipitación (CoIP) y ensayos de pull-down son métodos de cerca relacionados para identificar las interacciones proteína-proteína estable. Estos métodos están relacionados con inmunoprecipitación, un método para la separación de una proteína diana ligada a un anticuerpo de proteínas independientes. En CoIP, una proteína anticuerpo está obligado a otra proteína que no se une con el anticuerpo, esto es seguido por un proceso de separación que conserva las proteínas complejas. La diferencia en los ensayos de pull-down es que cebo etiqueta de afinidad proteínas sustituir los anticuerpos, y cromatografía de afinidad se utiliza para aislar los complejos de proteínas.
Este video explica CoIP, ensayos de pull-down y su aplicación en el laboratorio. Un protocolo paso a paso de cada técnica está cubierto, incluyendo reactivos, aparatos e instrumentos utilizados para purificar y analizar proteínas encuadernadas. Además, la sección de aplicaciones de este video describe un procedimiento para estudiar cómo las proteínas myxovirus inhiben la nucleoproteína de la gripe, una investigación sobre el papel de los iones del calcio en calmodulina por medio de un análisis descendente y un ensayo modificado de desplegable para caracterizar las interacciones transitorias de proteínas.
Las interacciones proteína-proteína juegan un papel importante en una amplia variedad de funciones biológicas. La mayoría de las interacciones proteína-proteína y sus efectos biológicos tiene todavía ser identificado. Co-inmunoprecipitación, o CoIP y ensayos de pull-down son dos métodos estrechamente relacionados para la identificación de las interacciones proteína-proteína estable. Este video cubre los principios de los dos ensayos, sus procedimientos de laboratorio general y aplicaciones de estas técnicas.
CoIP y ensayos de pull-down son variantes de inmunoprecipitación, un método para aislar selectivamente a una especie de proteína de una solución compleja. En un experimento de inmunoprecipitación, un anticuerpo específico para una proteína de la blanco se permite para formar un complejo inmune con ese objetivo en la muestra. El complejo es capturado en un soporte sólido, normalmente proteína un límite a un grano de sefarosa. Cualquier proteínas capturadas no se retiran por pasos de centrifugación. La proteína se libera luego del anticuerpo y el soporte sólido por ebullición en la reducción de buffer de muestra-cargamento SDS-PAGE.
Co-inmunoprecipitación se realiza de la misma manera, excepto que los complejos de la proteína intacta son capturados sobre el soporte sólido. El anticuerpo se une a la proteína diana, que, a su vez, está ligada a otra proteína que no está dirigida el anticuerpo. Como inmunoprecipitación, el complejo de la proteína se libera del anticuerpo y el soporte sólido por ebullición en la reducción de tampón de carga de SDS-PAGE.
Ensayos de pull-down son similares a la co-inmunoprecipitación, difiriendo sólo en el uso de una proteína “cebo”, frente a un anticuerpo. A través de técnicas de biología molecular, esta proteína cebo está diseñada con una etiqueta de afinidad, como una serie de residuos de histidina. Estas etiquetas de afinidad se describen en “separaciones de biomoléculas basados en cromatografía.” La proteína es capturada en un ligando de afinidad inmovilizado específico para la etiqueta. La proteína capturada luego se incuba con una muestra que contiene las proteínas que forman complejos con el “cebo”. El complejo de la proteína se libera con el apoyo de la afinidad por lavado con una solución que contiene un analito competitivo específico para la etiqueta de la proteína “cebo”. Ensayos de pull-down son útiles para confirmar las interacciones proteína predichas por la co-inmunoprecipitación y para descubrir las interacciones entre proteínas desconocidas.
Ahora que se han discutido los principios de co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down, echemos un vistazo a sus procedimientos de laboratorio.
Primero hablemos de co-inmunoprecipitación. A una serie de tubos de microcentrífuga, se añade lo siguiente: tampón PBS y una solución de 50% de la proteína A-sefarosa, un complejo de resina-proteína que se une al anticuerpo. Los tubos del microfuge se rotan para asegurar la adecuada distribución, y luego la resina se lava con buffer PBS adicional. Lisado, que contiene la proteína deseada, de la célula y 2 μg de anticuerpo se añaden a los tubos de microcentrífuga y se gira la mezcla por 1 h a 4 ° C. Los granos son peleteados por centrifugación, el sobrenadante se descarta y los granos re lavaron tres veces con tampón para eliminar proteínas sin límite. Los granos que contiene el complejo anticuerpo-proteína son en la reducción de buffer de muestra-cargamento SDS-PAGE, para el retiro del complejo de los anticuerpos y para el análisis por SDS-PAGE y el immunoblotting.
Ahora vamos a discutir el procedimiento para los ensayos de pull-down: la proteína de “cebo” se expresa en un plásmido con la etiqueta de afinidad adecuada. Después de alcanzar el crecimiento de la fase logarítmica, las células son sometidas a lisis y luego centrifugadas. Granos de la estreptavidina-sefarosa suspendidos, que capturan la biotina etiquetado proteína de “cebo”, se pipetea en un tubo de microcentrífuga. Los granos entonces se centrifugaron y el sobrenadante cuidadosamente removido por aspiración. Los granos entonces se lavan con buffer, centrifugado y el sobrenadante eliminado.
Las células que contienen la proteína supuesta del “presa”, que tiene una afinidad para la proteína de “cebo”, se cosechan por centrifugación. El sobrenadante es añadido al tubo de microcentrífuga conteniendo la resina y se incubó a 4 ° C por 3 h en un agitador. La resina es centrifugado, retirar el sobrenadante y lava la resina para eliminar proteínas sin límite. Tampón de elución se agrega a la resina, y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador. La resina entonces se centrifuga y el sobrenadante que contiene el complejo deseado es analizado por immunoblotting.
Ahora que hemos analizado los procedimientos, Veamos algunas de las aplicaciones útiles de co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down.
Co-inmunoprecipitación puede ser útil en la comprensión del mecanismo de acción de enzimas. Proteínas de resistencia myxovirus, o Mx, inhiben una amplia gama de virus, incluyendo influenza A, para que el mecanismo es mal entendido. Co-inmunoprecipitación se utilizó para estudiar la interacción entre el ratón proteína Mx1 y nucleoproteína de la gripe.
Ensayos de pull-down han demostrado ser útiles en el estudio de los efectos de los segundos mensajeros, que son proteínas que comunican una señal del entorno celular. Son un componente de una vía de señalización donde múltiples proteínas interactúan en respuesta a señales ambientales. Los iones de calcio actúan como mensajeros secundarios al unirse a la calmodulina, que a su vez, se une a una gran variedad de proteínas, mediando muchos tipos de respuestas biológicas. Sin el calcio, la proteína no puede unirse a la calmodulina.
Co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down generalmente se utilizan para el análisis de las interacciones de la proteína estable o fuerte, pero no transitoria. Un desarrollo reciente en los ensayos de pull-down, HaloTag, ha simplificado el estudio de las interacciones transitorias de proteínas; HaloTag es una etiqueta de fusión de proteínas codificadas genéticamente, fusionada a la proteína de interés, capaces de reaccionar químicamente con un soporte sólido de haloalkane. Si se desea el análisis funcional, la proteína compleja, menos la etiqueta, en su totalidad podría entonces ser aislada por incubación con tabaco etch proteasa de virus.
Sólo has visto video de Zeus de co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down. Este video describe los principios de los dos métodos, los procedimientos de laboratorio general y algunas de sus aplicaciones.
¡Gracias por ver!
Procedure
Disclosures
Transcript
Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.
CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.
Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.
Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a “bait” protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in “Chromatography-based Biomolecule Separations.” The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the “bait”. The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the “bait” protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.
Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let’s look at their laboratory procedures.
First let’s discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.
Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The “bait” protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged “bait” protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.
Cells containing the putative “prey” protein, which has an affinity for the “bait” protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.
Now that we’ve reviewed the procedures, let’s look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.
Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes’ mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.
Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can’t bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.
Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions; HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.
You’ve just watched JoVE’s video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.
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