Summary
Neurale inductie is de eerste stap in de vorming van de hersenen. Het is een mechanisme waarmee Hensen's node (organisator), instrueert aangrenzend weefsel aan te nemen een neurale lot, dat wil zeggen om aanleiding te geven aan het zenuwstelsel. Deze video toont een test voor neurale inductie bij kippenembryo.
Abstract
Het kuiken embryo is een waardevol instrument in de studie van de vroege embryonale ontwikkeling. De transparantie, toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, maken het een ideale tool voor het bestuderen van de vorming en de eerste patroonvorming van het zenuwstelsel. Deze video laat zien hoe om te enten organisator weefsel in een gastheer, een methode waarmee Hensen s node (de organisator in het kippenembryo) is geënt op een host bevoegde ectoderm. De organisator transplantaat instrueert bovenliggende na weefsel hebben om een lot te nemen via neuraal neurale inducerende signalen. Dit mechanisme wordt aangeduid als neurale inductie, en vormt de eerste stap in de vorming van de hersenen en het ruggenmerg in amnioten. Deze methode wordt hoofdzakelijk gebruikt voor het karakteriseren van vermeende neurale induceren van moleculen in chick. Deze video toont de verschillende stappen in de test voor neurale inductie, Ten eerste is de donnor embryo is geëxplanteerd en gespeld op een schotel. Dan is de gastheer embryo voorbereid op nieuwe cultuur. De ent is uitgesneden en getransplanteerd naar de host gebied pellucida marge. De gastheer is gekweekt voor 18-22 uur. De montage is vast en verwerkt voor verdere toepassingen (zoals in situ hybridisatie). Deze methode is oorspronkelijk bedacht door Waddington
Protocol
I. Schematisch overzicht:
Deze video toont de verschillende stappen in de test voor het neurale inductie bij kippenembryo. Ten eerste is de gastheer embryo geëxplanteerd in New cultuur [NI1]. Dan is de donnor embryo is geëxplanteerd in een zoutoplossing en Hensen's knooppunt (de "organisator" in het kuiken) is voorzien van fluorescerende kleurstof Dii [NI2]. Hensen De knoop is uitgesneden uit de donnor embryo [NI3] en getransplanteerd naar de host embryo [NI4, NI5]. De gastheer embryo wordt vervolgens gekweekt tot 22 uur, na welke termijn het donnor weefsel heeft een buitenbaarmoederlijke as in het ontvangende gebied geïnduceerde opaca [NI6]. Na de cultuur, is de gastheer embryo vaste en verwerkt voor foto-oxidatie in de aanwezigheid van DAB: Door deze chemische reactie, donnor afgeleide cellen, die rood weergegeven onder FITC fluorescentie voorafgaand aan de foto-oxidatie [NI7], bruin worden volgende reactie met DAB [NI8]. Het embryo wordt vervolgens verwerkt voor de in situ hybridisatie met een neurale marker [NI8]; gastheer zijn afgeleid weefsel heeft gevormd zenuwweefsel in de aanwezigheid van de donnor graft. Dit weefsel verschijnt blauw.
1: Voorbereiden van de gastheer embryo voor nieuwe cultuur
- Deze neurale inductie assay protocol begint met eieren die zijn uitgebroed naar Hamburger & Hamilton fase 3 + (of HH3 +). Deze eieren zijn uitgebroed gelegd op hun kant in een vochtige incubator voor 13 uur.
- Bereid de gastheer embryo voor Nieuw-cultuur (stappen 3.1. Tot 5,5 9).
- Bedek het oppervlak van de gastheer embryo met 200 pi zoutoplossing. Dit zal later worden overgedragen en positionering van de donnor graft.
- Tot slot, bedek het geheel met een omgekeerde Falcon 35 mm cultuur schotel.
2: Explanting de donnor embryo in een zoutoplossing
- Open het ei door te tikken op de shell met een tang en het verwijderen van stukken van de schil, rondom de shell. Verwijder de bovenkant van de schelp en gooi deze weg.
- Verwijder de dikke albumine met een tang, en kantel de dooierzak met grof tang, zodat de embryo naar boven wijst.
- Met behulp van fijne schaar, knip een vierkant van dooierzak rond het embryo. Verwijder het embryo uit de dooier met een lepel, en plaats in een schotel met PBS.
- Met behulp van een tang, maak de donnor embryo uit de buurt pellucida.
- Overdracht donnor embryo tot een Sylgard overdekte schotel met PBS.
3: Labeling, weg te snijden en het transplanteren van de donnor transplantaat
- Met behulp van een micro-elektrode trekker, trekt 50 ul glas microcapillaire pipetten. Onder de microscoop, knip het uiteinde van de micropipet met fijne pincet. Plaats micropipet in een petrischaaltje bekleed met een lint van plasteline.
- Bereid de kleurstof oplossing die zal worden gebruikt om het transplantaat voorafgaand aan de transplantatie label: carbocyanine kleurstof DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat): Ten eerste, bereiden een voorraad van Dii in 1 ml absolute ethanol op 0,5%. Deze voorraad kan worden achtergelaten bij-20C in het donker. In een waterbad bij 42 ° C, meng voorverwarmd 40 ul DII voorraad 360μl 0,3 M sucrose. Het waterbad temperatuur is noodzakelijk om precipitatie van DII en de vorming van onoplosbare kristallen te voorkomen. Kort draaien de oplossing op een mini spectrafuge (5-10 seconden). De Dii oplossing is nu klaar voor gebruik.
- Met behulp van insecten pinnen, veilig de donnor embryo aan de onderkant van de Sylgard schaaltje met deksel.
- Back-fill de micropipet met DII. Door het toepassen van lichte druk met behulp van een afzuiger binnenband, breng dan een kleine bolus van DII naar knooppunt Hensen's. Zorg ervoor dat de gehele Hensen het knooppunt is gelabeld.
- Met behulp van een microcapillaire pipet of een microdissecting mes, snijden Hensen's node ("organisator", donnor graft).
- Markeer de ventrale zijde en achterste einde van het transplantaat met karmijn. Dit zal ervoor zorgen dat het transplantaat wordt geplaatst met de juiste dorso-ventrale oriëntatie in stap 4.3.
- Met behulp van een 200μl Gilson pipet het transplantaat op de host embryo.
4: Beveiliging van de graft en het kweken van de gastheer embryo
- Verwijder de zoutoplossing uit gastheer embryo, zorg ervoor dat het transplantaat blijft geplaatst in de nabijheid van met host site.
- Met behulp van een microcapillaire pipet of een microdissecting mes, maak een kleine incisie (80-100 urn) in het gebied pellucida / gebied opaca grensgebied, op het niveau van knooppunt Hensen van gastheer embryo.
- Met behulp van een microcapillaire pipet of een microdissecting mes, de positie van de graft, zodat buikzijde gezicht naar u toe en het achterste einde loopt parallel aan vergelijkbare regio in gastheer embryo.
- Verwijder de resterende zoutoplossing, en verwerken de host embryo voor Nieuw cultuurfonds voor 81-22 uur (met stappen 6,1 tot 6,6 9).
- De gastheer embryo wordt vervolgens 's nachts vast op 4 ° C (stappen 7,1 tot 7,7 9).
- Onder zuurkast, bereiden een DAB-werkende oplossing in Tris buffer: Los DAB substraat (3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride) in Tris buffer (100mm Tris-HCl, pH 7,4) op 500μg/ml, houd oplossing in donker, op het ijs.
- Was het embryo twee keer in PBS voor 5 minuten per stuk en een keer in Tris-buffer voor 5 mn.
- Overdracht van het embryo tot een glas holte slide met 1 ml Tris-buffer.
- Vervang de Tris-buffer oplossing met 1,5 ml DAB-oplossing. Gooi Eppendorf tip in een emmer met 10% bleekmiddel oplossing om DAB saneren. Plaats een dekglaasje op de top van holte schuiven.
- Onder FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) fluorescentie, de doelstelling van de microscoop focus op de graft (donnor cellen fluorescerende rode verschijnen) en FITC fluorescentie totdat alle fluorescerende rode cellen zijn bruin (dit gebeurt als gevolg van de Dii bloot fluorochroom wordt photoconverted tot onoplosbare kristallen bruin, door blootstelling aan FITC excitatie golflengte (488nm) in de aanwezigheid van DAB. Dit proces duurt tussen 20 minuten en 2 uur.
- Na voltooiing van de foto-oxidatie reactie, verwijder de dekglaasje met fijne pincet. Transfer embryo om glas een 20 ml flacon met scintillatie PBTw (of PBS met 0,1% Tween-20).
- Deactiveren DAB uit dekglaasje en glas holte schuiven door het incuberen in 10% bleekwater oplossing.
6: Verwerk de embryo voor in situ hybridisatie, fotografie en snijden
- Ga verder met in situ hybridisatie (stappen 3,7 tot 6,5 9), het incuberen van het embryo voor maar DIG gelabelde probe.
- Ga verder met fotograferen (stap 8.2 9) en snijden (stappen 8.3 en 8.4 9).
Representatieve resultaten
In het volgende voorbeeld van neurale inductie test, is de donnor graft getoond induceren de expressie van de neurale marker staartloze vanaf host afgeleid weefsel. In dit specifieke voorbeeld, hebben we de overname van neurale inducerende vermogen van embryonale regio's die normaal gesproken niet "organisator" vermogens: het donnor transplantaat afkomstig van een embryo waarin de "organisator" regio operatief is uit de donnor embryo verwijderd op het podium 3 +. Na de ablatie, is het donnor embryo mag ontwikkelen in New cultuur, tot het gat is genezen en een structuur die lijkt op Hensen's knooppunt heeft gevormd. Deze structuur is vervolgens gelabeld met DII, uitgesneden uit de donnor embryo en geënt op gebied pellucida / gebied opaca grens van een gastheer embryo. Na New cultuur, is een miniatuur-as gevormd grenzend aan de gastheer embryo: deze miniatuur as bestaat uit een staaf van rode cellen (donnor afgeleid) en een kop-achtige structuur (host afgeleid): In (A), donnor-afgeleide DII gelabeld cellen zijn voorafgaand aan de fixatie opgenomen onder FITC fluorescentie microscopie. Deze donnor-afgeleide cellen hebben zich verspreid naar een miniatuur notochord, die wordt weergegeven als staaf van rode bloedcellen te vormen. (B) Na photoconversion van Dii, deze donnor-afgeleide cellen verschijnen bruin. De donnor transplantaat heeft geleid tot de vorming van neurale weefsel van de gastheer: dit weefsel bestaat van precursoren voor de hersenen, zoals blijkt uit de uitdrukking voor de marker staartloze volgende in situ hybridisatie [herdruk van 6].
Opmerking: In deze procedure hebben we gebruikt DII gelabelde cellen om neurale inducerende donnor weefsel (rood / bruin) te onderscheiden van gastheer afgeleid "neuraal" weefsel (blauw). In plaats van het gebruik van afgeleide een kuiken, Dii gelabeld donnor graft, sommige auteurs ook gebruik maken van donnor weefsel afgeleid van kwartel embryo's in plaats van Chick [bijv. 6]. Deze alternatieve methode maakt het ook mogelijk om donnor onderscheiden van gastheerweefsel. In dit geval het transplantaat (donnor weefsel) is afkomstig uit kwarteleitjes in plaats van kippeneieren. Volgende stap 4.5, de gastheer is verwerkt voor ganse berg immunohistochemie met een antilichaam dat specifiek is voor weefsel (QCP1) en stappen 3,1 kwartels 3,4 en 5,1 tot 5,7 zijn weggelaten uit het protocol. Een voorbeeld van deze alternatieve procedure is hieronder weergegeven: In dit geval gebruikten we dezelfde experimentele procedure als in A, B, maar we gebruikten kwartel-afgeleide donnor weefsel (zoals blijkt uit de uitdrukking van QCPN antilichaam [bruin]): Het geregenereerde knooppunt afgeleid van kwartel embryo heeft geleid tot de uitdrukking van de pan-neurale marker Sox2 in de ontvangende [herdruk van 6]:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video toont de verschillende stappen bij het uitvoeren van een test voor neurale inductie, Deze test wordt hoofdzakelijk gebruikt voor het karakteriseren van vermeende neurale induceren van moleculen in chick, en kan dus worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen, variërend van embryologische micromanipulations 1-4; 6 tot en met het ontrafelen van nieuwe signaleringscascades 7,8, alle gericht op het begrip van de eerste stap in de vorming van de hersenen en de resterende zenuwstelsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DP is ontvanger van Ruth Kirschstein Award 1F32-01A1 DA021977 van het National Institute on Drug Abuse. Dit werk werd ondersteund door de Margaret M. Alkek Stichting RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Micr–lectrode puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
