Dosage de l'induction neurale dans l'embryon de poulet

Summary

L'induction neurale est la première étape dans la formation du cerveau. C'est un mécanisme par lequel le nœud de Hensen (organisateur), instruit les tissus adjacents à adopter un destin neuronal, c'est à dire de donner naissance au système nerveux. Cette vidéo montre un essai pour l'induction neurale dans l'embryon de poulet.

Abstract

L'embryon de poulet est un outil précieux dans l'étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, l'accessibilité et la facilité de manipulation, en font un outil idéal pour étudier la formation et la structuration initiale du système nerveux. Cette vidéo montre comment tissu organisateur du greffon dans un hôte, une méthode par laquelle le nœud de Hensen s (l'organisateur de l'embryon de poulet) est greffé à un ectoderme compétente d'accueil. La greffe organisateur instruit recouvrant na avez tissus d'adopter un sort via des signaux neuronaux induisant neurones. Ce mécanisme est appelé l'induction neurale, et constitue la première étape dans la formation du cerveau et la moelle épinière chez les amniotes. Cette méthode est essentiellement utilisée pour la caractérisation des molécules induisant putatifs neurale chez le poulet. Cette vidéo montre les différentes étapes de l'essai pour l'induction neurale; d'abord, l'embryon n'est Donnor explantés et épinglé sur un plat. Ensuite, l'embryon d'accueil est préparé pour une nouvelle culture. Le greffon est excisée et transplanté à la marge d'hôte zone pellucide. L'hôte est cultivée pendant 18 à 22 heures. L'ensemble est fixé et traitées pour d'autres applications (par exemple, hybridation in situ). Cette méthode a été initialement conçu par Waddington

Protocol

I. Schéma Aperçu:

Cette vidéo montre les différentes étapes de test pour l'induction neurale dans l'embryon de poulet. Tout d'abord, l'embryon hôte est explanté dans la culture Nouveaux [NI1]. Ensuite, l'embryon n'est Donnor explantés dans une solution saline et le nœud de Hensen (l '«organisateur» dans chiches) est étiqueté avec fluorescentes DiI colorant [NI2]. Nœud de Hensen est excisé de l'embryon Donnor [NI3] et transplantés dans l'embryon hôte [NI4, NI5]. L'embryon hôte est ensuite mis en culture pendant 22 heures, période après laquelle le tissu Donnor a induit un axe ectopique dans la zone d'accueil opaca [NI6]. Après la culture, l'embryon d'accueil est fixe et traitées pour photooxydation en présence du DAB: Par cette réaction chimique, les cellules dérivées Donnor, qui apparaissent en rouge sous la fluorescence FITC avant photooxydation [NI7], deviennent bruns réaction suivante avec DAB [NI8]. L'embryon est ensuite traitée par hybridation in situ avec un marqueur neuronal [NI8]; tissu hôte dérivés a formé le tissu neural, en présence de la greffe Donnor. Ce tissu apparaît en bleu.

1: Préparation de l'embryon hôte pour la culture néo-

1. Ce protocole induction neurale test commence avec des oeufs qui ont été incubés à la Hamburger & Hamilton étape 3 ⁺ (ou HH3 ^+). Ces œufs ont été incubés mis de leur côté dans un incubateur humide pendant 13 heures.
2. Préparer l'embryon hôte pour nouvelle culture (étapes 3.1. À 5,5 ^9).
3. Couvrez la surface de l'embryon hôte avec 200 ul salines. Cela facilitera le transfert tard et le positionnement de la greffe Donnor.
4. Enfin, la couverture de l'assemblée avec un Falcon 35 inversé mm boîte de culture.

2: explantation de l'embryon dans une solution saline Donnor

1. Ouvrez l'œuf en tapant sur la coquille avec une pince et enlever des morceaux de la coquille, tout autour de la coquille. Retirer haut de coquille et jetez-les.
2. Retirez l'albumine épaisse avec une pince, et de l'inclinaison du sac vitellin avec des pinces grossières pour que l'embryon tournée vers le haut.
3. Avec des ciseaux fins, découpez un carré de vitellus autour de l'embryon. Retirez l'embryon du jaune avec une cuillère, et les placer dans un plat contenant du PBS.
4. En utilisant des pinces, détacher l'embryon de la zone pellucide Donnor.
5. Transfert Donnor embryon à un plat recouvert Sylgard contenant du PBS.

3: L'étiquetage, l'excision et la transplantation de la greffe Donnor

1. Utiliser un extracteur de microélectrodes, tirer 50 pipettes en verre ul microcapillaire. Sous le microscope, couper la pointe de la micropipette l'aide de pinces fines. Micropipette Placer dans un plat de Pétri bordée d'un ruban de plastiline.
2. Préparer la solution de teinture qui sera utilisé pour étiqueter le greffon avant la transplantation: carbocyanine colorant DII (1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate): Premièrement, préparer un stock de DiI de 1ml l'éthanol absolu à 0,5%. Ce stock peut être conservé à-20C dans le noir. Dans un bain-marie réglé à 42 ° C, le mélange préchauffé 40 ul d'actions DiI à 360μl 0.3M sucrose. La température du bain d'eau est nécessaire afin d'éviter la précipitation du DII et la formation de cristaux insolubles. Centrifuger brièvement la solution sur un Spectrafuge mini (pour les 5-10 secondes). La solution Dii est maintenant prêt à utiliser.
3. Utilisant des broches d'insectes, sécuriser l'embryon Donnor sur le fond du plat Sylgard couverts.
4. Retour-remplir la micropipette avec DII. En appliquant une légère pression en utilisant un tube aspirateur, d'appliquer un petit bolus d'DiI au nœud de Hensen. Assurez-vous que le nœud de Hensen ensemble est étiqueté.
5. En utilisant une pipette ou un couteau microcapillaire microdissecting, couper le nœud de Hensen («organisateur», greffe Donnor).
6. Marquer la face ventrale et l'extrémité postérieure de la greffe avec du carmin. Cela permettra d'assurer que la greffe est positionnée avec bonne orientation dorso-ventrale à l'étape 4.3.
7. En utilisant une pipette 200 pl Gilson, le transfert de la greffe à l'embryon hôte.

4: Sécurisation de la greffe et la culture de l'embryon hôte

1. Retirer la solution saline de l'embryon hôte, en veillant à la greffe reste positionné à proximité avec le site hôte.
2. En utilisant une pipette ou un couteau microcapillaire microdissecting, faire une petite incision (80-100 microns) dans la zone pellucide / aire région frontière opaca, au niveau du nœud de Hensen de l'embryon hôte.
3. En utilisant une pipette ou un couteau microcapillaire microdissecting, la position de la greffe de telle sorte que la face ventrale dirigée vers vous et l'extrémité postérieure est parallèle à la région équivalent dans l'embryon hôte.
4. Retirer salines restants, et le processus de l'embryon hôte pour nouvelle culture de 81 à 22 h (étapes 6.1 à 6.6 ^9).
5. L'embryon hôte est alors fixé une nuit à 4 ° C (étapes 7.1 à 7.7 ^9).

e "> 5: Photooxidise la greffe en fluorescence

1. Sous une hotte, préparer une solution DAB travaillant dans un tampon Tris: Dissoudre substrat DAB (3,3 '-diaminobenzidine tétrachlorhydrate) dans un tampon Tris (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4) à 500μg/ml; garder solution dans l'obscurité, sur la glace.
2. Laver l'embryon à deux reprises dans du PBS pendant 5 mn chacun et une fois dans un tampon Tris pendant 5 mn.
3. Transfert de l'embryon à une diapositive cavité en verre contenant 1 ml de tampon Tris.
4. Remplacer la solution tampon Tris avec 1,5 ml DAB solution. Eliminer Eppendorf pointe dans un seau contenant une solution javellisée à 10% pour décontaminer DAB. Placer une lamelle sur le dessus de la diapositive cavité.
5. Sous FITC (isothiocyanate de fluorescéine) de fluorescence, concentrer l'objectif du microscope sur le greffon (cellules Donnor sera apparaissent en rouge fluorescent) et d'exposer à la fluorescence FITC jusqu'à ce que toutes les cellules fluorescentes rouges sont devenues brunes (ce qui arrive comme un résultat de DII fluorochrome étant photoconverted d'insolubles cristaux bruns, par une exposition à onde d'excitation FITC (488nm), en présence de DAB. Ce processus prend entre 20 mn et 2 heures.
6. Après l'achèvement de la réaction de photooxydation, enlever la lamelle à l'aide de pinces fines. Transfert embryon à un flacon à scintillation en verre de 20 ml contenant PBTw (ou PBS avec 0,1% de Tween-20).
7. Désactiver DAB à partir lamelle de verre et faites glisser la cavité par une incubation dans une solution javellisée à 10%.

6: Processus de l'embryon pour l'hybridation, la photographie in situ et de sectionnement

1. Procéder à l'hybridation in situ (étapes 03.07 à 06.05 ^9), l'incubation de l'embryon pour seulement DIG sonde marquée.
2. Procéder à photographier (étape 8.2 ⁹⁾ et de sectionnement (étapes 8.3 et 8.4 ^9).

Les résultats représentatifs

Dans l'exemple suivant de dosage induction neurale, la greffe est indiquée Donnor induire l'expression de l'Anourie marqueur de neurones à partir de tissus de l'hôte dérivés. Dans cet exemple particulier, nous avons évalué l'acquisition de la capacité de provoquer neurones des régions embryonnaires qui normalement n'ont pas «organisateur» des capacités: la greffe Donnor provient d'un embryon dans lequel l '«organisateur» région a été enlevée chirurgicalement de l'embryon au stade Donnor 3 ^+. Après l'ablation, l'embryon Donnor on laisse se développer dans la nouvelle culture, jusqu'à ce que le trou a guéri et une structure ressemblant à nœud de Hensen a formé. Cette structure est ensuite étiqueté avec DII, excisés de l'embryon Donnor et greffé à la zone pellucide / zone de la frontière opaca d'un embryon hôte. Suite à la nouvelle culture, un axe miniature est formé à côté de l'embryon hôte: cet axe miniatures se compose d'une tige de globules rouges (Donnor dérivés) et une structure de tête de type (hôte dérivés): Dans (A), Donnor dérivés DiI étiquetés cellules sont présentés avant la fixation sous microscopie à fluorescence FITC. Ces cellules Donnor dérivés ont proliféré pour former une miniature notochorde, qui apparaît comme la tige de globules rouges. (B) photoconversion suite de DII, ces cellules dérivées Donnor apparaissent brun. La greffe a Donnor induit la formation de tissu neural de l'hôte: ce tissu est constitué de précurseurs pour le cerveau, tel que révélé par leur expression dans les cas suivants marqueur Anourie hybridation in situ [tiré à part de 6].

Remarque: Dans cette procédure, nous avons utilisé des cellules DiI étiquetés afin de différencier les tissus neuraux induisant Donnor (rouge / marron) de l'hôte dérivés "neurones" tissu (bleu). Au lieu d'utiliser un poussin dérivés, Dii greffons étiquetés Donnor, certains auteurs utilisent aussi des tissus provenant d'embryons Donnor cailles au lieu d'chiches [par exemple, 6]. Cette méthode alternative permet également de différencier Donnor du tissu hôte. Dans ce cas, la greffe (tissu Donnor) provient d'oeufs de caille au lieu d'œufs de poule. Après l'étape 4.5, l'hôte est transformé pour l'immunohistochimie monter l'ensemble avec un anticorps spécifique à la caille des tissus (QCP1) et les étapes 3.1 à 3.4 et 5.1 à 5.7 sont omises de ce protocole. Un exemple de cette procédure alternative est indiqué ci-dessous: Dans ce cas, nous avons utilisé la même procédure expérimentale que dans A, B, mais nous avons utilisé la caille dérivées des tissus Donnor (comme indiqué par l'expression d'anticorps QCPN [brun]): Le régénérée noeud provenant d'embryons de caille a induit l'expression de marqueurs pan-neuronal Sox2 dans l'hôte [tiré à part de 6]:

Discussion

Cette vidéo montre les différentes étapes à effectuer un essai pour l'induction neurale; Ce dosage est essentiellement utilisé pour la caractérisation de molécules induisant putatifs neurale chez le poulet, et peut donc être utilisé pour une large variété d'applications, allant de micromanipulations embryologique ^{1-4; 6} à démêler nouvelles cascades de signalisation ^7,8, toutes visant à la compréhension de l'étape initiale de la formation du cerveau et du reste du système nerveux.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH3+ (14 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Hybridization Incubator	Equipment	Robbins Scientific, SciGene	M1000	Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker
Marsh Automatic Incubator	Equipment	Lyon	RX
Pyrex dish
Watchmaker’s glass 50mm	Tool	VWR international	66112-060
Glass rings	Tool	Physical Plant facility		cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13	blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
DiI	Reagent	Invitrogen	D-282
Aspirator tube assembly	Tool	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Micr–lectrode puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Culture chamber	Tool	Pioneer Plastics	030C
Microcapillary tube	Tool	Sigma-Aldrich	P1049-1PAK
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam	Tool	Fine Science Tools	26002-20	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base		Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)		Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA		Electron Microscopy Sciences	15710