Summary
Нейронные индукции является первым шагом в формировании мозга. Это механизм, посредством которого узел Гензена (организатор), инструктирует соседних тканей принять нейронных судьба, то есть привести к нервной системе. Это видео демонстрирует тест для нейронных индукции в куриных эмбрионах.
Abstract
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для изучения формирования и начального структурирование нервной системы. Это видео демонстрирует, как привить ткани организатор в хозяина, метод, которым узел Хэнсен с (организатором в куриных эмбрионах) прививают на хост компетентных эктодермы. Организатор трансплантата инструктирует вышележащих наивны ткани принять нейронных судьбу через нервные сигналы вызывающих. Этот механизм называется индукции нервной и представляет собой первый шаг в формировании головного и спинного мозга в амниот. Этот метод в основном используется для характеристики предполагаемых нейронных молекул вызывающих у куриных. Это видео демонстрирует различные этапы анализа нейронных индукции; Во-первых, эмбрион является Donnor эксплантированных и возлагали на блюдо. Затем хозяин эмбрион готов к новой культуре. Трансплантат вырезали и пересаживаются на хост маржа области pellucida. Хост культивировали в течение 18-22 часов. Сборка фиксируется и обрабатывается для дальнейшего применения (например, в гибридизация). Этот метод был первоначально разработан Уоддингтон
Protocol
I. Схема Обзор:
Это видео демонстрирует различные этапы анализа нейронных индукции в куриных эмбрионах. Во-первых, хозяин эмбрион эксплантированных в Нью-культуры [NI1]. Затем эмбрион Donnor является эксплантированных в солевом растворе и узел Гензена ("Организатор" на куриных) помечается флуоресцентной краской DII [Ni2]. Узел Гензена это вырезали из эмбриона Donnor [Ni3] и пересаживаются на хост эмбриона [NI4, NI5]. Хост эмбрион затем культивировали в течение до 22 часов, после чего период ткани Donnor побудило внематочной оси в принимающей области opaca [NI6]. После культурой, принимающей эмбрион является фиксированной и обработаны для фотоокисления в присутствии DAB: По этой химической реакции, Donnor клеток, полученных, которые появляются красные под флуоресценции FITC до фотоокисления [NI7], становятся коричневыми следующие реакции с DAB [NI8]. Эмбрионов затем обрабатывается на месте для гибридизации с нейронных маркером [NI8]; хост производные ткани образуются нервной ткани в присутствии трансплантата Donnor. Эта ткань появляется синий.
1: Подготовка принимающей зародыш новой культуры
- Этот протокол анализа нейронных индукции начинается с яйца, которые были инкубированы к Гамбургер & Hamilton этапе 3 + (или HH3 +). Эти яйца были инкубированы положил на их стороне во влажном инкубаторе в течение 13 часов.
- Подготовка хоста эмбриона Новая культура (шаги 3,1. 5,5 9).
- Обложка поверхности хост эмбриона с 200 мкл физиологического раствора. Это будет способствовать последующей передачи и расположение трансплантата Donnor.
- Наконец, крышка сборка с перевернутой Сокол 35 блюдо культуры мм.
2: культивирующий в искусственной среде эмбриона Donnor в физиологическом растворе
- Открытое яйца, нажав на оболочку с пинцетом и удаление части корпуса, по всей оболочке. Удаление верхней части корпуса и выбросьте.
- Удалить толстые альбумина с щипцами, и наклон желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
- Использование тонких ножниц, вырезать квадратный желточного мешка вокруг эмбриона. Удалить из эмбриона желток с ложкой, и место в блюдо с PBS.
- Использование щипцов отсоедините эмбриона Donnor из области pellucida.
- Передача Donnor эмбриона Sylgard покрыты блюдо с PBS.
3: Маркирование, иссечение и пересадка трансплантата Donnor
- Использование микроэлектрода съемник, потяните 50 мкл стекла микрокапиллярных пипеток. Под микроскопом, разрезать кончик микропипетки с использованием тонких щипцов. Место микропипетки в чашке Петри выложены лента plasteline.
- Подготовка раствора красителя, который будет использоваться для обозначения трансплантата перед трансплантацией: карбоцианиновых красителя DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат): Во-первых, подготовить запас DII в 1 мл абсолютного этанола на уровне 0,5%. Этот запас можно хранить при температуре-20С в темноте. В водяной бане установлена на уровне 42 ° С, смешать нагретого 40 мкл фондовом DII для 360μl 0.3M сахарозы. Температура водяной бани необходимо для того, чтобы предотвратить выпадение DII и образования нерастворимых кристаллов. Кратко спина решение на spectrafuge мини (в течение 5-10 секунд). Решение DII готов к использованию.
- Использование насекомых булавками, безопасный эмбриона Donnor на дне Sylgard закрытые сосуды.
- Вернуться заполнения микропипетки с DII. Применяя мягкое давление использованием сборки аспиратор трубки, нанесите небольшое болюс DII к узлу Гензена. Убедитесь, что весь узел Гензена обозначена.
- Использование микрокапиллярных пипетки или microdissecting ножом, вырезать узел Гензена ("Организатор", Donnor трансплантата).
- Марк брюшной стороне и заднем конце трансплантата с кармином. Это гарантирует, что трансплантат позиционируется с надлежащим дорзо-вентральной ориентации в шаге 4.3.
- Использование пипетки Gilson 200 мкл, передачи трансплантата к хост эмбриона.
4: Обеспечение трансплантата и культивирование эмбрионов хост
- Удалить солевые принимающих эмбриона, убедившись, что взяточничество остается расположены в непосредственной близости с хост-сайта.
- Использование микрокапиллярных пипетки или microdissecting нож, сделайте небольшой надрез (80-100 мкм) в области pellucida / области opaca пограничной области, на уровне узла Гензена принимающих эмбриона.
- Использование микрокапиллярных пипетки или microdissecting ножа, положение трансплантата, так что брюшная сторона лица по отношению к вам и задним концом параллельно эквивалент региона в принимающих эмбриона.
- Удалите оставшийся солевой раствор, и процесс хоста эмбриона для новой культуры 81-22 ч (шаги 6,1 до 6,6 9).
- Хост эмбрион затем фиксировали в течение ночи при 4 ° С (шаг 7,1 до 7,7 9).
- Под вытяжным шкафом, подготовить DAB рабочего раствора в трис-буфер: растворить DAB субстрата (3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride) в трис-буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4) в 500μg/ml; держать раствор в темноте, на льду.
- Вымойте эмбриона дважды в PBS в течение 5 млн каждый и один раз в трис-буфере в течение 5 мин.
- Передача эмбриона предметное стекло полость, содержащую 1 мл трис-буфера.
- Замените решение Tris буфера с 1,5 мл раствора DAB. Утилизировать Эппендорф чаевые в емкость, содержащую 10% гипохлоритом натрия для того, чтобы обеззараживать DAB. Место покровное на вершине лункой.
- Под FITC (флуоресцеин изотиоцианата) флуоресценции, фокус цель микроскоп на трансплантата (Donnor клетки появится флуоресцентный красный) и подвергать флуоресценции FITC, пока все флуоресцентные эритроциты стали коричневый (это происходит в результате DII флуорохромом быть photoconverted в нерастворимые кристаллы коричневого, под воздействием FITC длины волны возбуждения (488nm) в присутствии DAB. Этот процесс занимает от 20 мин до 2 часов.
- После завершения реакции фотоокисления, удалить покровное с использованием тонких щипцов. Передача эмбриона к стеклу 20 мл сцинтилляционный флакон, содержащий PBTw (или PBS с 0,1% Твин-20).
- Отключить DAB от покровного стекла и лункой путем инкубации в 10% гипохлоритом натрия.
6: Процесс эмбриона в гибридизация, фотографии и секционирования
- Продолжайте в гибридизация (шаги 3,7 до 6,5 9), инкубации эмбрион для DIG только меченым зондом.
- Приступить к съемке (шаг 8,2 9) и секционирования (шаги 8,3 и 8,4 9).
Представитель Результаты
В следующем примере анализа нейронных индукции, привитые Donnor показано индуцируют экспрессию нейронных Бесхвостые маркер от хоста производные ткани. В данном конкретном примере, мы оценили приобретение нейронных способность вызывать эмбриональных регионах, которые обычно не имеют "организатор" способности: взяточничество Donnor происходит из эмбриона, в котором «организатор» регион был удален хирургическим путем из эмбриона на стадии Donnor 3 +. После абляции, эмбрион Donnor это позволило разработать в Нью-культуры, пока отверстие зажила и структуру, напоминающую узел Гензена сформировался. Эта структура затем помечены DII, вырезали из эмбриона Donnor и привитые к области pellucida / области opaca границу принимающей эмбриона. После Нового культуры, миниатюрные оси образуется рядом с хост эмбриона: это миниатюрная ось состоит из стержня эритроцитов (Donnor производные) и головы-подобной структуры (хост производные): В (А), Donnor полученных DII помечены Клетки показано до фиксации под FITC флуоресцентной микроскопии. Эти Donnor клеток, полученных получили широкое распространение в форме миниатюрной хорды, которая выглядит как стержень эритроцитов. (B) после фотопревращения DII, эти Donnor клеток, полученных появляются бурые. Трансплантата Donnor побудило формирование нервной ткани от хоста: эта ткань состоит из прекурсоров для мозга, как показали свое выражение для маркера Бесхвостые следующем месте в гибридизации [перепечатана из 6].
Примечание: В этой процедуре, мы использовали DII меченые клетки для того, чтобы дифференцировать нейронных вызывающие Donnor ткани (красный / коричневый) от хоста производные "нейронных" ткани (синий). Вместо использования куриных получены, DII помечены трансплантата Donnor, некоторые авторы также использовать Donnor ткани основе перепелиных эмбрионов вместо куриных [например, 6]. Этот альтернативный метод также позволяет дифференцировать Donnor из тканей хозяина. В этом случае трансплантат (Donnor ткани) происходит от перепелиные яйца вместо куриных яиц. Следующим шагом 4.5, хост обрабатывается для всей иммуногистохимии крепление с антитела, специфичные для перепелов ткани (QCP1) и шаги 3,1 до 3,4 и 5,1 до 5,7, опускаются из протокола. Примером этого альтернативной процедуры приведен ниже: В данном случае мы использовали ту же экспериментальную процедуру, как в A, B, но мы использовали перепелов полученных Donnor ткани (как показал выражение QCPN антител [коричневый]): регенерировать узел основе перепелиных эмбрионов побудило выражение пан-нейронных маркер Sox2 в хост [перепечатана из 6]:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это видео демонстрирует различные этапы в проведении анализа нейронных индукции; Этот анализ в основном используется для характеристики предполагаемых нейронных молекул вызывающих у куриных, и таким образом может быть использован для широкого спектра применений, начиная от эмбриологических micromanipulations 1-4; 6 к разгадке новых сигнальных каскадов 7,8, все, направленных на понимание первым шагом в формировании мозга и остальные нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DP является получателем Рут Kirschstein премии 1F32-01A1 DA021977 из Национального института по злоупотреблению наркотиками. Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Micr–lectrode puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
