Summary
神经诱导是在大脑形成的第一步。它是一种机制，使恒胜的节点（组织者），指示相邻的组织采用了神经的命运，即会引起神经系统。本视频演示了在鸡胚神经诱导实验。
Abstract
鸡胚是一个有价值的工具，在早期胚胎发育的研究。其透明度，可获得性和易于操纵，使其为研究神经系统的形成和最初的图案的理想工具。本视频演示了如何移植到主机组织者组织，恒胜小号节点的方法是，（在鸡胚的组织者）被嫁接到一个主机主管外胚层。主办移植指示覆NA已经组织采取通过神经诱导信号的神经命运。这一机制被称为神经诱导，并构成了脊椎动物的大脑和脊髓的形成初始步骤。这种方法实质上是公认的在小鸡的神经诱导分子的特性。本视频演示了在神经诱导实验的不同步骤，首先，德纳胚胎explanted和寄托一道菜。然后，主机胚胎准备为新的文化。移植是切除和移植到主机领域的透明带保证金。主机是培养18-22小时。大会是固定的，为进一步应用（例如原位杂交）处理。这种方法最初设计由沃丁顿
Protocol
一，原理概述：
本视频演示了在不同的步骤检测在鸡胚神经诱导。首先，主机的胚胎是explanted在新的文化[NI1]。然后，德纳胚胎是在生理盐水和恒胜的节点（在鸡的“组织者”）explanted与荧光染料DII标记[NI2]。恒胜的节点是从德纳胚胎切除[NI3]和主机的胚胎移植到[NI4，NI5]。主机的胚胎，然后长达22小时，培养后，期间德纳组织诱导异位轴在主机领域opaca [NI6]。 [网联科技]以下文化，主机胚胎是固定的，民建联存在的光氧化处理：通过这种化学反应，德纳源性细胞，FITC荧光下出现红色光氧化[NI7前，变成褐色与民建联以下反应。原位杂交胚胎处理与神经标记[网联科技];主机派生组织已形成存在德纳移植神经组织。这个组织显示为蓝色。
1：准备新的文化的主机的胚胎
- 这一神经诱导实验协议，已培养汉堡和汉密尔顿第3阶段的鸡蛋开始 +（或HH3） 。这些鸡蛋已经奠定了他们一边在一个潮湿的孵化器孵育13小时。
- 准备新的文化（步骤3.1至5.5 9）主机胚胎。
- 主机胚胎表面覆盖200μL生理盐水。这将有利于以后的转移和定位德纳移植。
- 最后，盖一个倒置的猎鹰35毫米培养皿大会。
2：Explanting德纳胚胎在盐水
- 打开攻壳钳和删除所有周围的壳壳件，蛋。拆下外壳的顶部和丢弃。
- 删除与钳厚白蛋白，粗钳倾斜卵黄囊使胚胎朝上。
- 用细剪刀，切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。从蛋黄用勺子取出胚胎，并在含有PBS菜的地方。
- 使用镊子，从区带分离德纳胚胎。
- 德纳胚胎转移到Sylgard盖菜含有PBS。
3：标签，切除和移植德纳移植
- 使用微电极拉马，拉50μL玻璃microcapillary移液器。在显微镜下，削减微量用细镊子的尖端。放置在培养皿中的微管内衬的plasteline剪彩。
- 准备染料溶液，将被用于标签移植前移植：carbocyanine染料DII（1,1' - 双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐）：首先，准备在1毫升一个DII股票在0.5％的无水乙醇。这个股票可以被存储在- 20C在黑暗中。在水浴42℃，混合预热40μLDII股票360μl0.3M蔗糖。水浴温度是必要的，以防止DII和形成不溶性晶体的沉淀。简要自旋对一个小型spectrafuge的解决方案（5-10秒）。 DII的解决方案现在已经可以使用。
- 使用驱虫针，安全德纳胚胎Sylgard盖菜的底部。
- 回到填补DII微量。通过运用柔和的压力使用吸引器管组装，适用于小的DII丸恒胜的节点。确保整个恒胜的节点标记。
- 使用microcapillary吸管或microdissecting刀，切恒胜的节点（“组织者”，德纳移植）。
- 标记的腹侧和胭脂红移植后结束。这将确保移植是适当的步骤4.3背腹方向定位。
- 使用200μL吉尔森移液器，转让主机胚胎移植。
4：保护主机胚胎移植和培养
- 从主机胚胎中取出生理盐水，确保移植仍然定位在与主持人现场靠近。
- 使用microcapillary吸管或microdissecting刀，在该地区的透明带/地区opaca边界地区的一个小切口（80 -100μm的），在恒胜的节点主机胚胎水平。
- 使用一个microcapillary吸管或microdissecting刀，位置嫁接，使腹侧方对你和后部面临的是平行的主机胚胎相当于地区。
- 去除剩余的生理盐水，并处理81-22小时（步骤6.1至6.6 9）为新的文化的主机胚胎。
- 主机的胚胎，然后在4 ° C（7.1至7.7 9步骤）固定过夜。
- 通风柜下，准备一个DAB工作液：Tris缓冲液溶解民建联基板（3,3' - 二氨基tetrahydrochloride）在500μg/ml的Tris缓冲液（100MM的Tris - HCl，pH值7.4）;保持在黑暗的解决方案，在冰上，。
- 胚胎洗5分钟，两次在PBS每一次在Tris缓冲液为5分钟。
- 将胚胎含有Tris缓冲液1毫升的玻璃腔幻灯片。
- 更换Tris缓冲液，用1.5毫升民建联溶液。处理的Eppendorf提示中含有10％的漂白粉溶液，以净化民建联桶。将盖玻片上腔幻灯片的顶部。
- FITC（异硫氰酸荧光素）的荧光下，专注于移植（德纳细胞会出现红色荧光）显微镜的目标，直到所有的红色荧光细胞变成褐色（这DII的结果发生，暴露FITC荧光的荧光被photoconverted不溶性的棕色晶体，曝光FITC的激发波长（488nm）在民建联存在。，这个过程需要20分钟和2小时之间。
- 氧化反应完成后，用细镊子取出盖玻片。胚胎转移到玻璃20毫升闪烁瓶中，含PBTw（或0.1％Tween - 20的PBS）。
- 从盖玻片和玻璃腔滑停用民建联在10％的漂白粉溶液孵化。
6：处理的胚胎在原位杂交技术，摄影和切片
- 继续进行原位杂交（步骤3.7至6.5 9），孵化的胚胎只辛标记探针。
- 继续拍摄（步骤8.2 9）和切片（8.3和8.4 9步骤）。
代表性的成果
在下面的例子神经诱导实验，德纳移植诱导表达从主机派生组织的神经标记无尾。在这个特殊的例子中，我们评估收购胚胎地区一般不会有“组织者”的能力的神经诱导能力：德纳移植在其中的“组织者”的地区已经从德纳胚胎手术去除阶段的胚胎起源3 +德纳胚胎以下消融，是允许在新的文化发展，直到洞已愈合，并已形成一个结构类似恒胜的节点。这种结构与DII标记，从德纳胚胎切除，嫁接面积透明带/地区opaca主机胚胎的边界。新的文化，形成一个微型轴相邻主机胚胎：这种微型轴组成的红细胞杆（德纳派生）和一个头状结构（主机派生）：在（a），德纳衍生DiI标记FITC荧光显微镜下，细胞内固定前。这些德纳源性细胞增殖，形成一个微型的脊索，出现红细胞杆。 （二）以下光转化DII，这些德纳源性细胞出现棕黄色。 [转载]从6德纳移植诱导的神经组织形成从主机，这个组织包括大脑前体，因为它们的表达显示标记原位杂交无尾以下。
注：在此过程中，我们用DiI标记的细胞，以区别于神经诱导德纳组织（红色/棕色）派生的“神经元”的组织（蓝色）的主机。而不是使用小鸡派生，DiI标记德纳移植，有些作者还使用德纳从鹌鹑胚胎，而不是小鸡的组织[如6]。这种替代的方法也可以让宿主组织，以区别于德纳。在这种情况下，移植（德纳组织）源于鹌鹑蛋代替鸡蛋。从协议中省略以下步骤4.5，主机是与特定的抗体，鹌鹑组织（QCP1）和步骤3.1到3.4和5.1至5.7整装免疫组织化学处理。这种替代过程中的一个例子如下所示：在这种情况下，我们使用相同的实验程序，在A，B，但我们用鹌鹑衍生德纳组织（表达QCPN抗体[棕色]所示）：再生从鹌鹑胚胎衍生的节点，引起泛神经标记Sox2基因在宿主的表达[转载]从6：
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Discussion
本视频演示了不同的步骤执行检测神经诱导，这种检测基本上是公认的在小鸡的神经诱导分子的特性，因此可以使用一个广泛的应用， 范围从胚胎 micromanipulations 1-4，; 6日至揭开新的信号级联反应，7,8，所有旨在了解初步形成大脑和神经系统的其余步骤。
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Acknowledgments
DP是从国家药物滥用研究所露丝Kirschstein奖1F32 DA021977 - 01A1收件人。这项工作是支持的玛格丽特M. Alkek基金会RHF。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Micr–lectrode puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
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- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
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- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
