Aorta-ring-analys

Summary

Angiogenes, är groning av blodkärl från redan existerande kärl, i samband med både naturliga och patologiska processer. Här visar vi en aorta-ring-analys som gör att angiogena potentiators och hämmare vara direkt läggas till aorta ringar i kultur. Groning och neovessel utväxt kan bestämmas genom att kontrollera aorta ringar under en period på 6-12 dagar.

Abstract

Angiogenes, är groning av blodkärl från redan existerande kärl i samband med både naturliga och patologiska processer. Olika angiogenes analyser innebär studiet av enskilda endotelceller i kultur villkor (1). Den aorta ringen-analysen är en angiogenes modell som bygger på orgel kultur. I denna analys, angiogena fartyg växa från ett segment av aorta (modifierad från (2)). Kortfattat, mus aorta exciderad, är fettlager och adventitia bort, och ringar ca 1 mm i längd är beredda. Individuella ringar är så inbäddade i en liten fast kupol av källaren matris extrakt (BME), gjuten inuti enskilda brunnar i en 48-brunnar. Angiogena faktorer och hämmare av angiogenes direkt kan läggas till ringar och en blandad co-kultur av aorta ringar och andra typer av celler kan användas för att studera parakrina angiogena effekter. Groning observeras genom inspektion under ett stereomikroskop under en period på 6-12 dagar. På grund av den stora variationen som orsakas av ojämnheter i aorta segment experiment i 6-plicates rekommenderas starkt. Neovessel utväxt övervakas under hela experimentet och avbildas med fas mikroskopi och supernatanter samlas in för mätning av relevanta angiogena och anti-angiogena, celldöd markörer och nitrit.

Protocol

En dag före försöket:

1. Låt BME (reducerad tillväxtfaktor, Cultrex, Trevigen) att tina på is eller vid 4 ° C, en gång tinas håller på is för att förhindra åter stelnar.

Dag av experiment:

1. Möss (6-7 veckor) ska bedövas och avblodas ut.
2. Ta bort aorta i en petriskål fylld med kallt sterilt PBS.
3. Utför mekanisk rensning från omgivande fettvävnad. Observera undvika uttorkning av Aorta när som helst.
4. Med hjälp av en kirurgisk kniv, skiva Aorta jämnt i 1 mm ringar. Snittet måste vara enhetlig och ren.
5. Överföring ringar till frisk kall PBS och hålla på is hela tiden.
6. Använda nedkylda pipettspetsar, lägga till varje brunn i en 48-brunnar en rundad droppe 150 ml kallt BME. Låt BME släppa stelna vid 37 ° C i 20-30 minuter.
7. Placera en aorta ring i mitten längst upp på varje kupol. Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
8. På toppen av varje ring lägga till en extra 150 ml BME. Inkubera 20-30 minuter vid 37 ° C.
9. Förbered medium: mänskliga endotelceller serum fritt medium (GIBCO, Carlsbad, CA) kompletterat med 2% FCS, 50 enheter / ml penicillin och 50 mikrogram / ml streptomycin (Cellgro).
10. Till varje brunn 500 ml medium som innehåller antingen:
    1. Experimentell prover.
    2. Positiv kontroll: endotelceller tillväxt komplettera (EKG, slutlig koncentration 200 mikrogram / ml, BD Biosciences).
    3. Negativ kontroll: Medium ensam.
11. Inkubera plattan vid 37 ° C i 12 dagar, fotograferar ringar mellan dag 6 och 12 enligt standard faskontrast stereoskop.
12. Tillval: Samla supernatanterna.

Anmärkningar:

1. Håll sterila förhållanden hela tiden.
2. Undvik bubblor i BME.

Discussion

Aorta-ring-analysen är ett bra verktyg på vägen att utvärdera angiogena samt anti-angiogena faktorer. Fartygen som växer ut från aorta ringar rekrytera glatta muskelceller och pericyter att associera med endotelceller röret, vilket innebär att de är anatomiskt liknar neovessels in vivo. Dessutom håller musen aorta ringen analys fördelen av den stora förekomsten av transgena verktyg tillgängliga för denna art. Men det finns flera nackdelar med aorta ringen analysen. Först sker fartyg utväxt in vivo från mikrokärl och inte från stora fartyg som stora kroppspulsådern. För det andra inkonsekvens i hanteringen av ringarna och mängden omgivande vävnad kvar på fartyget kan påverka fartygets utväxt. Ringar från olika artärer eller olika möss åldrar och stammar kan också störa den angiogena svar. Och slutligen, förekommer angiogena fartyg utväxt i tre dimensioner, vilket gör det icke-ideala att fotografera och kvantifiera. Sammantaget när de utförs med tillräcklig intern kontroll och med flera upprepar, är denna analys relativt enkel, icke-dyr, mycket informativ och signifikant bättre endotelceller kulturer i dess biologiska komplexiteten och relevans.