الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

Summary

على microfluidics الرقمية هي تقنية تتميز التلاعب قطرات منفصلة (~ NL -- مل) على مجموعة من الأقطاب الكهربائية من تطبيق الحقول الكهربائية. انها مناسبة تماما للاضطلاع ، المتسلسل السريع ، المنمنمة الآلي فحوصات البيوكيميائية. هنا ، نحن تقرير منصة قادرة على أتمتة العديد من خطوات التجهيز البروتين.

Abstract

وقد برزت البروتيوميات السريرية والانضباط جديد مهم ، واعدا لاكتشاف المؤشرات الحيوية التي من شأنها أن تكون مفيدة للتشخيص المبكر والتشخيص للمرض. في حين أن الأساليب تختلف البروتين سريرية على نطاق واسع ، وهي سمة مشتركة هي الحاجة إلى (ط) استخراج البروتينات من السوائل غير متجانسة للغاية (أي مصل الدم كله ، الخ) و (ب) تجهيز البيوكيميائية واسعة النطاق قبل التحليل. هنا ، نحن تقرير رقمية جديدة على microfluidics (DMF) الأسلوب يستند دمج عدة خطوات المعالجة المستخدمة في البروتيوميات السريرية. وهذا يشمل استخراج البروتين ، resolubilization ، والحد ، والهضم ألكلة الأنزيمية. الرقمية على microfluidics هو الميكروسكيل معالجة السوائل التقنية التي يتم التلاعب قطرات نانولتر - ميكروليتر الحجم على سطح مفتوح. يتم وضع قطرات على رأس مجموعة من الأقطاب الكهربائية التي تكون مغلفة بطبقة عازلة -- عندما يتم تطبيق الجهد الكهربائي على الحبرية ، والرسوم تتراكم على جانبي عازلة. هذه الاتهامات بمثابة مقابض الكهروستاتيكية التي يمكن استخدامها للسيطرة على الموقف الحبرية ، ويتحامل سلسلة من الأقطاب الكهربائية في سلسلة ، ويمكن إجراء قطرات على الاستغناء ، ونقل ، دمج ، مزيج ، والانقسام على السطح. لذلك ، DMF مادة طبيعية ملائمة لنقل ، متسلسلة السريع ، ومتعددة الخطوات ، المنمنمة فحوصات البيوكيميائية الآلي. هذا يمثل تقدما كبيرا على الأساليب التقليدية (التي تعتمد على pipetting اليدوي أو الروبوتات) ، ولديه القدرة على أن تكون أداة مفيدة جديدة في البروتيوميات السريرية.

ساهم ميس J. جبرايل ، فيفيان N. وقا ، وستيف شيه CC بالتساوي على هذا العمل.

عنوان سيرجيو LS فريري الحالي هو في جامعة العلوم في فيلادلفيا يقع في 600 شارع 43 جنوب ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا 19104.

Protocol

الجزء 1 : تصنيع الأجهزة

1. ركائز الزجاج النظيفة في حل سمكة البيرانا (3:1 اضرب حامض الكبريتيك : 30 ٪ بيروكسيد الهيدروجين). مغادرة ركائز في حل سمكة البيرانا لمدة 10 دقيقة مع التحريض المتكرر.
2. بعد شطف في الماء (DI) منزوع الأيونات وتجفيف الغاز مع ركائز ₂ N ، وضع ركائز داخل غرفة شعاع الالكترون لترسيب الكروم (سمك من 250 نانومتر).
3. ليذوى الركيزة الكروم المغلفة ، وشطف في الأيزوبروبانول ثم يخبز على طبق ساخن لمدة 5 دقائق في 115 درجة مئوية.
4. تجفيف ورئيس ركائز مع hexamethyldisilazane (HMDS) بواسطة طلاء الجانبية (30 ق ، 3000 دورة في الدقيقة). تدور معطف مرة أخرى (باستخدام معلمات متطابقة) مع مقاومة للضوء S1811 شيبلي.
5. قبل خبز الركيزة على طبق ساخن (100 درجة مئوية ، 2 دقيقة) ، ثم نمط مقاومة للضوء عن طريق التعرض لأشعة (UV) فوق البنفسجية لمدة 5 ليالي من خلال الضوئية الرئيسية.
6. تطوير ركائز للأشعة فوق البنفسجية التي تتعرض لها من المطور شيبلي MF 321 لمدة 3 دقائق وتغسل في مياه DI. بعد الخبز على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
7. حفر الكروم كشفها بواسطة تخبط في ضوئي لمدة 30 ثانية. الكروم شطف المياه في دي ، ثم تزج في متجرد AZ300T لمدة 10 دقيقة لإزالة مقاوم الضوء المتبقية. شطف في الماء والجافة DI بالغاز ₂ N.
8. ودائع 2-5 ميكرومتر Parylene - C (وهو بوليمر عازل) بواسطة ترسب الأبخرة الكيميائية تؤثر على نمط الركيزة الكروم. إيداع 50 نانومتر من تفلون - AF (لجعل سطح مسعور) التي تدور حل طلاء (1 ٪ بالوزن / بالوزن في Fluorinert FC - 40) في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. بعد الخبز على طبق ساخن (160 درجة مئوية و 10 دقيقة).
9. لتشكيل الصفيحة العلوية ، ومعطف ملف. الامم المتحدة منقوشة الإنديوم أكسيد القصدير (ITO) والزجاج ركائز 50 نانومتر تفلون ، بالعربية ، على النحو الوارد أعلاه
10. بعد خبز كل من ركائز على طبق ساخن (160 درجة مئوية و 10 دقيقة).

الجزء 2 : تعيين جهاز المتابعة والتنفيذ

1. في أجهزة ميكروفلويديك الرقمية تعمل في تكوين "اثنين من لوحة" ، يتم وضع قطرات بين ¹ ركيزة القاع (مع أقطاب منقوشة) والركيزة الأولى (مع واحدة القطب ، متجاورة شفافة ، وشكلت عادة من ITO).
2. لضبط الجهاز حتى إزالة الطلاء البوليمر من منصات الاتصال ركيزة أسفل عن طريق كشط لطيف مع مشرط. يتعرض الزوجان لمنصات الركيزة القاع برصيد 40 دبوس الموصلات (الشكل 1A).
3. السلطة على كمبيوتر يشغل LABVIEW (الصكوك الوطنية ، أوستن ، تكساس) ، منزل بنيت مربع عنصر التحكم (يضم مجموعة من عالية الجهد التبديلات التي يتم التحكم فيها بواسطة إشارات من DaqPad الصكوك الوطنية) ، ومولد وظيفة ، ومكبر للصوت . مربع الكمبيوتر / السيطرة يسهل على المستخدم التحكم تطبيق _RMS V 100 / 18 كيلو هرتز إشارات إلى الجهاز عن طريق وصلات من 40 دبوس.
4. تجميع الجهاز عن طريق وضع قطعتين من الشريط على الوجهين (140 ميكرون سمك الكل) على حواف الركيزة القاع وكاملة مع الشرائح ITO unpatterned (الصفيحة العلوية).
5. لتهيئة نظام التحكم ، تشغيل برنامج المعايرة LABVIEW (مكتوبة في المنزل) لمعايرة تحكم التغذية المرتدة.
6. تحميل العينة والكواشف في الخزانات المناسب (انظر القسم 3 أدناه) ، وأرفق بها في إطار الركيزة الأولى (تفلون المغلفة الجانب لأسفل). إرفاق موصل الأرض إلى أعلى الركيزة.
7. تحميل رمز يشتغل في LABVIEW (مكتوبة في المنزل) وتنفيذ برنامج لبدء يشتغل الحبرية.

الجزء 3 : نموذج تحضير والكاشف

1. إعداد العازلة العمل (البنك الدولي) : 100 مم TrisHCl (الرقم الهيدروجيني 7.8) وPluronic 0.08 ٪ F127 ث / ضد
2. حل البروتين (ق) التي يتم تحليلها في الضفة الغربية وماصة العينة إلى خزان 1 (R - 1) على الجهاز ، كما هو مبين في الشكل 1B.
3. إعداد مرسب ، حمض حمض التريكلوروسيتيك 20 ٪ (TCA) في مياه DI ، وماصة إلى R - 2.
4. يعد غسل العازلة ، والكلوروفورم 70/30 / أسيتونتريل (ACN) ، وماصة إلى R - 4.
5. إعداد resolubilizing العازلة ، 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (8.0 درجة الحموضة) و 0.08 ٪ Pluronic F127 ث / ت ، وماصة إلى R - 5.
6. حل اختزال ، تريس (2 - carboxyethyl) الفوسفين (TCEP) ، في 10 مليمتر في الضفة الغربية وماصة في R - 6.
7. حل وكيل مؤلكل ، iodoacetamide (IAM) ، في 12 مم في الضفة الغربية وماصة في R - 7.
8. حل التريبسين في البنك الدولي على التركيز على قدم المساواة to1 / 5 من تركيز العينة البروتين الكلي (انظر 3.1 أعلاه) وماصة في R - 8.

الجزء 4 : المعالجة الرقمية للنموذج ميكروفلويديك

1. ويتم تنفيذ الإجراء التالي تلقائيا عن طريق كتابة رمز LABVIEW في المنزل. ويعرف حجم قطرات الاستغناء عن الخزانات من أبعاد الأقطاب (في هذه الحالة ، يتم الاستغناء قطرات ~ 600nL).
2. الاستغناء عن قطرة من العينة التي تحتوي على البروتين من R - 1 ، وقطرة من مرسب من R - 2 (الشكل 2 ، الإطار 1). قطرات دمج اثنين والسماح للقطيرة مجتمعة لاحتضان لمدة 5 دقائق ، مما أدى إلى ترسب الأسبوعيةoteins على السطح (الشكل 2 ، اطارات 2-3). تحفيز وطاف بعيدا عن البروتين عجل إلى خزان النفايات ، R - 3 (الشكل 2 ، الإطار 4).
3. الاستغناء three قطرات من غسل العازلة R - 4 وطردهم عبر البروتين عجل إلى خزان النفايات ، R - 3 (الشكل 2 ، الإطار 5).
4. السماح للتعجل لتجف ، والاستغناء بقطرة من resolubilizing العازلة من R - 5 للبروتين. تسمح المخزن المؤقت لاحتضان لمدة 20 دقيقة حتى يعجل قد حلت (الشكل 2 ، الإطار 6).
5. الاستغناء بقطرة من مختزل من R - 6 ودمجه مع قطرات العينة. مزيج قطرة يجمعهما التي تحرك ذلك عبر 6 أقطاب في نمط دائري. يسمح الحبرية لاحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب (الشكل 3 ، اطارات 1-2).
6. الاستغناء بقطرة من عامل مؤلكل من R - 7 ودمجها مع قطرات العينة ، تليها خلط (كما في 4.5). يسمح الحبرية لاحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب ، محمية من الضوء (الشكل 3 ، اطارات 2-3).
7. الاستغناء بقطرة من التربسين من R - 8 ، ودمج ذلك مع قطرات العينة ، تليها خلط (كما في 4.5). يسمح الحبرية لاحتضان لمدة 3 ساعات في غرفة 37 في ترطيب على طبق ساخن (الشكل 3 ، اطارات 3-4) درجة مئوية.

الجزء 5 : بعد تجهيز وإعداد العينات

1. إزالة الركيزة أعلى وإخماد ردة فعل الهضم عن طريق إضافة 0.6 مل من حمض trifluoroacetic 2.5 ٪ في الماء.
2. تنقية تطفئ ناتج التفاعل باستخدام ZipTips C18 (ميليبور ، فالجهاز يبث اشعة تماثل ، MA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
3. تمييع تنقية العينة في الماء DI إلى الحجم النهائي 100 مل.

الجزء 6 : قداس الطيف

1. تقييم العينة المجهزة على نانو HPLC تزاوج مطياف الكتلة جنبا إلى جنب. استخدام نظام HPLC هنا هو من تقنيات Eksigent ومجهز مع عمود فخ (3 مم. الخرز C18 ، 150 × 2.5 ميكرومتر معرف سم) وعمود فصل عكس المرحلة (3 ديا ميكرون. الخرز C18 ، 75 ميكرومتر معرف س 15 سم). مطياف الكتلة المستخدمة هنا هي من LTQ الحرارية فيشر العلمية.
2. تحميل عينة 2 ميكرولتر على العمود في فخ 5μL/min في مرحلة النقالة تضم أسيتونتريل 5 ٪ في الماء. فصل العينة على عكس المرحلة العمود في 0.5μL/min باستخدام الانحدار الخطي أسيتونتريل من 20 ٪ إلى 80 ٪ خلال أسيتونتريل 25 دقيقة. متابعة تشغيل في أسيتونتريل 80 ٪ لمدة 10 دقيقة.
3. تحليل نطاقات يبلغ حجمه قبالة العمود بواسطة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب. وذكرت في عمل هنا ، هو عينات شاطف في مطياف الكتلة عبر باعث nanoelectrospray (20 ميكرومتر مدبب معرف إلى معرف ميكرومتر 10) من NewObjective.
4. التعرف على البروتينات في عينة البحث باستخدام برنامج قاعدة بيانات مثل SEQUEST. في هذا العمل ، كنا إصدار SEQUEST تأسست في Bioworks v3.01 (الحرارية فيشر العلمية) ، والبروتينات التي تم تحديدها كان عشرات من احتمال أقل من 03 - 1.0E (أي ما يعادل 99.9 ٪ فاصل الثقة) ، وتسلسل في التغطيات لا يقل عن 30 ٪ (الشكل 4).

الشكل 1 (أ) صورة جهاز DMF تزاوج إلى 40 دبوس وصلات ليشتغل الحبرية الآلي. (ب) التخطيطي لجهاز تحديد المواقع المسيئة للعينة والكواشف اللازمة لworkup البروتين.

الشكل 2. إطارات من فيلم يصور الاستخراج الآلي وتنقية جيش صرب البوسنة في TCA 20 ٪ (مرسب) و 70/30 أسيتونتريل ٪ كلوروفورم / (شطف الحل). في الإطار 6 ، redissolved البروتين عجلت في قطيرة من 100 ملي بيكربونات الأمونيوم.

الشكل 3. الإطارات من الفيلم توضح الحد متسلسلة ، الألكلة ، وهضم قطرات من البروتين resolubilized. في هذا الشكل ، ولون الكواشف مع الأصباغ وضوح ، في الممارسة ، والكواشف ليست ملونة.

chromatogram MS الرقم 4. عينة من زلال مصل بقري معالجتها من قبل على microfluidics الرقمية. وقد تم تحديد 25 الببتيدات متميزة (99.9 ٪ فاصل الثقة) المقابلة تغطية سلسلة من 44 ٪.

Discussion

عدم وجود نموذج موحد المناولة والتجهيز في وجود قيود البروتيوميات الرئيسية للحقل. بالإضافة إلى ذلك ، التقليدية مناولة الحاويات يشمل عينة macroscale متعددة ونقل الحل الذي يمكن أن يؤدي إلى فقدان العينة والتلوث. وهناك حل محتمل لهذه المشاكل هو تشكيل نظم متكاملة لمعالجة الاعتماد على عينة على microfluidics الرقمية ¹ (DMF). في الأعمال السابقة ، فقد تبين أن تكون مفيدة DMF لإزالة الملوثات غير المرغوب فيها بكفاءة في غير المتجانسة التي تحتوي على البروتين الحلول. كان ² وبالمثل ، أظهرت DMF لتكون متوافقة مع تكامل تجهيز الحل التدريجي متعددة الخطوات (الحد من الفقر ، والهضم ألكلة) بشأن متكامل الجهاز. ³ وهنا ، وقد أثبتت لدينا نظام متكامل تماما مع التحكم الآلي لاستخراج قطرة البروتين عن طريق الترسيب تليها الحل التدريجي التجهيز. علينا التكهن أنه إذا اعتمدت على نطاق واسع مثل هذه الأساليب ، يمكن أن يكون الخطأ البشري المتأصلة في تجهيز العينات البروتين القضاء إلى حد كبير ، مما أدى إلى تحليلات أفضل للتكرار. وباختصار ، فإننا نقترح أن DMF لديه القدرة لكونها مفيدة لقطاع عريض من التطبيقات ، كما يمكن أن تتكرر الظروف بالضبط في أي مختبر في العالم.