Obtention hémocytes de l'Hawaiian Bobtail Squid Scolopes Euprymna Et en observant leur adhésion aux bactéries symbiotiques et non symbiotiques

Summary

Cette vidéo vous montrera comment obtenir des hémocytes (cellules sanguines) de l'Hawaiian calmars bobtail,

Abstract

Les études concernant le rôle du système immunitaire dans la médiation de la signalisation moléculaire entre les bactéries bénéfiques et leurs hôtes ont, ces dernières années, apporté une contribution significative à notre compréhension de la co-évolution des eucaryotes avec leur microflore. L'association symbiotique entre les calmars Hawaiian Bobtail,

Protocol

1. Préparer 500 ml de 0,22 um, stérilisée par filtration d'eau de mer artificielle (FSW; salinité 35 ppt). Filtre d'eau de mer artificielle ou naturelle à travers un filtre de 0,22 micron um pour éliminer les particules et les bactéries.
2. Anesthetize un adulte Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes) en le plaçant dans une solution à 2% d'éthanol dans FSW. Placez l'animal dans l'anesthésie pendant environ 10 minutes. Le calmar cessera de natation et ne sera pas répondre activement au toucher. La respiration continue, indiquée par le mouvement du manteau, et l'activité devrait encore chromatophore être observées.
3. Placez calmars avec la face ventrale vers le haut sur un plateau de dissection de cire standard. Immerger l'animal avec FSW contenant 2% d'éthanol.
4. L'utilisation d'un standard de 200 embouts de pipette ul, tirez l'entonnoir et le manteau pour exposer le vaisseau sanguin principal céphalique située entre les deux yeux.
5. En utilisant une seringue de 1 mL stérile avec aiguille de calibre 26,5, de percer le vaisseau sanguin céphalique et de retirer entre 50-100 ul d'hémolymphe. Placez l'hémolymphe dans un tube de 1,5 ml stériles sur la glace.
   Remarque: Si un animal servira une fois donateurs multiples, ne retirer que 10 à 20 pl d'hémolymphe à un moment donné. Retour de l'animal à un réservoir d'eau de mer normale. L'animal va revivre dans les 30 min.
6. Hémocytes fraîchement récoltées sont lavées et remises en suspension dans 500 ul de solution de Ringer Squid s (S-Ringer; 530 mM NaCl, 10 mM de KCl, 25 mM _MgCl2, 10 _mM de CaCl2 et 10 mM de tampon HEPES, pH 7,5).
7. Les concentrations hémocytaires sont déterminées par hématimètre, et environ 2.000 cellules sont ajoutées aux fiches chambrée couvercle en verre, et autorisés à adhérer au verre pendant 10 min à température ambiante. A cette densité, les hémocytes former une monocouche uniforme sur la surface de la lame de verre.
8. Pour observer des bactéries se liant à hémocytes hôte, les hémocytes sont exposés à une souche bactérienne marqué par fluorescence tels que Vibrio fischeri ES114 et / ou Vibrio harveyi B392, contenant chacun un journaliste verte fluorescente. V. fischeri ES114 et V. harveyi B392 sont cultivés à la mi-phase log dans une eau de mer tryptone médias (SWT) à 28 ° C dans un agitateur orbital. La densité optique à 600nm est mesurée par spectrophotométrie pour déterminer la densité cellulaire. Les bactéries sont culottées par centrifugation (5000 rpm pendant 5 min), le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans S-Ringer.
9. 100 000 cellules bactériennes sont ajoutés à chaque chambre ainsi donc qu'il ya 50 bactéries par hémocytes en moyenne. Les hémocytes / mélanges de bactéries sont incubées dans la solution S-Ringer s à 25 ° C pendant 1 h, un temps déterminé pour obtenir le niveau maximum de la liaison.
10. Le cytoplasme des hémocytes sont ensuite colorés avec fluorescence CellTracker 0,005% d'Orange (Invitrogen) puis lavé à S-Ringers de visualiser les cellules.
11. Hémocytes souillé avec des bactéries associées sont considérées par fluorescence en utilisant soit un Zeiss Découverte V20 stéréoscope fluorescente ou d'un microscope Leica SP2 laser confocale spectrale, et énuméré sur toute la surface de la cellule animale.

Les résultats représentatifs

Parce que l'hémolymphe céphalopodes contient hémocyanine extracellulaire et non l'hémoglobine, sur l'oxygénation, l'hémolymphe deviendra bleu foncé. Une moyenne de ~ 5000 hémocytes par ul d'hémolymphe seront obtenus en utilisant cette méthode. Après l'adhésion aux lamelles chambrée et une coloration fluorescente, les hémocytes devrait apparaître vives fluorescence rouge et en forme amiboïde. Pour l'adhésion bactérienne, V. fischeri adhèrent mal à la hémocytes (1-2 cellules bactériennes par des cellules sanguines), alors que V. harveyi va adhérer fortement (10-15 cellules bactériennes par hémocytes).

Figure 1. Adulte Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes montrant la position des vaisseaux sanguins céphalique.

Figure 2. Résultats de l'exposition aux hémocytes Vibrio fischeri (A) et Vibrio harveyi (B). Rouge, Cell Tracker orange, vert, GFP-étiquetée bactéries.

Discussion

Les études concernant le rôle du système immunitaire dans la médiation de la signalisation moléculaire entre les bactéries bénéfiques et leurs hôtes ont, ces dernières années, apporté une contribution significative à notre compréhension de la co-évolution des eucaryotes avec leur microflore. Le système squid / vibrion a fait ses preuves en tant que système modèle souple pour répondre aux questions fondamentales dans ce domaine ^2,3,5,6,8. La lumière de l'organe de scolopes calmars Euprymna permet la colonisation exclusivement par la bactérie Vibrio fischeri lumineuse. Parce que les tissus qui la maison du bactéries restent en contact avec l'eau de mer, les calmars doivent non seulement favoriser la symbiose particulière, mais aussi continuer à exclure les autres bactéries. Poursuite des études ont révélé que de type macrophage hémocytes jouent probablement un rôle important dans l'établissement et le maintien de cette association ^1,4,7. Parce que l'hôte calmars manque l'immunité adaptative, la spécificité étonnante trouvé dans cette association doit être complètement ou partiellement médiée par le système immunitaire inné. Une enquête récente de ces cellules sanguines ont révélé que les hémocytes isolés de E. scolopes reconnaître et phagocyter V. fischeri et non-symbiotique des bactéries différemment et que la colonisation entraîne probablement une sorte de «tolérance immunitaire» de l'symbiotes ^4. Ce protocole fera la démonstration de comment réussir à obtenir ces cellules sanguines à partir de calmars adultes et de tester leur capacité à lier les bactéries.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155411
26.5 G 1ml latex-free insulin syringe	BD Biosciences	C34551
Cell Tracker Orange	Invitrogen	C34551
SteREO Discovery V20 Microscope	Carl Zeiss, Inc.
SP2 Confocal Microscope	Leica Microsystems