Summary
Este vídeo vai demonstrar como obter hemócitos (células sangüíneas) a partir do Hawaiian bobtail lula,
Abstract
Estudos sobre o papel do sistema imunológico na mediação de sinalização molecular entre bactérias benéficas e os seus anfitriões têm, nos últimos anos, fez contribuições significativas para a nossa compreensão da co-evolução dos eucariotos com sua microbiota. A associação simbiótica entre o havaiano bobtail lula,
Protocol
- Prepare 500 mL de 0,22 M esterilizada por filtração, a água do mar artificial (FSW; salinidade 35 ppt). Filtro de água do mar artificial ou natural através de um filtro de 0,22 micron M para remover partículas e bactérias.
- Anestesiar um adulto Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes), colocando em uma solução 2% de etanol na FSW. Colocar o animal na anestesia por aproximadamente 10 minutos. A lula deixará de natação e não responder ativamente ao toque. Respiração contínua, indicado pelo movimento do manto, ea atividade chromatophore ainda deve ser observado.
- Lugar squid com o lado ventral para cima em uma bandeja padrão de cera dissecção. Submergir o animal com FSW contendo 2% de etanol.
- Usando um padrão de 200 mL pontas de pipeta, retirar o funil e manto para expor os principais vasos sanguíneos localizados cefálica entre os dois olhos.
- Usando uma seringa estéril mL 1 com 26,5 calibre da agulha, punção do vaso sangüíneo cefálico e retirar entre 50-100 mL de hemolinfa. Coloque o hemolinfa em um tubo de 1,5 mL estéril no gelo.
Nota: Se um animal servirá como um doador de múltiplos vezes, apenas retirar 10-20 mL de hemolinfa a qualquer momento. Devolver o animal para um tanque de água do mar normal. O animal irá reviver dentro de 30 min. - Hemócitos de colheita recente são lavadas e re-suspenso em 500 ml de solução Ringer Squid s (S-Ringers; 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 e 10 mM tampão HEPES, pH 7,5).
- Hemócitos concentrações são determinadas por hemocitômetro, e cerca de 2.000 células são adicionadas ao lamínulas câmaras de vidro, e permitiu a aderir ao vidro por 10 min em temperatura ambiente. Neste densidade, o hemócitos formar uma monocamada uniforme sobre a superfície da lâmina de vidro.
- Observar bacteriana ligação a hemócitos host, hemócitos são expostos a uma cepa bacteriana fluorescente etiquetado como o Vibrio fischeri ES114 e / ou Vibrio harveyi B392, cada um contendo um repórter fluorescente verde. V. fischeri ES114 e V. harveyi B392 são cultivadas para log-mid fase em uma água do mar triptona media (SWT) a 28 ° C em um agitador orbital. A densidade óptica a 600nm é medido espectrofotometricamente para determinar a densidade de células. As bactérias são peletizadas por centrifugação (5.000 rpm por 5 min), o sobrenadante é descartado, eo pellet é ressuspenso em S-Ringers.
- 100.000 células bacterianas são adicionados a cada câmara de bem para que existem 50 bactérias por hemócitos em média. Os hemócitos misturas / bactérias são incubadas em solução Ringer S-s a 25 ° C durante 1 h, um tempo determinado para produzir o nível máximo de ligação.
- O citoplasma dos hemócitos são então marcadas com fluorescência 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) e, em seguida, lavados em S-Ringers para visualizar as células.
- Hemócitos corados com bactérias associadas são vistos por fluorescência utilizando um estereoscópio Zeiss Descoberta V20 fluorescente ou um microscópio Leica SP2 do laser confocal espectral, e enumerou sobre toda a superfície da célula animal.
Resultados representante
Porque hemolinfa cefalópode contém hemocianina e hemoglobina extracelular não, sobre a oxigenação, a hemolinfa ficará azul escuro. Uma média de ~ 5000 hemócitos por mL de hemolinfa serão obtidos utilizando este método. Após a adesão ao lamínulas septadas e coloração fluorescente, o hemócitos deve aparecer brilhante fluorescente vermelha e amoeboid em forma. Para adesão bacteriana, V. fischeri irá aderir mal ao hemócitos (1-2 células bacterianas por célula do sangue), enquanto V. harveyi irá aderir fortemente (10-15 células bacterianas por hemócitos).
Figura 1. Adulto Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes mostrando a posição dos vasos sanguíneos cefálica.
Figura 2. Resultados da exposição hemócitos de Vibrio fischeri (A) e Vibrio harveyi (B). Vermelho, Cell Rastreador Orange; Green, GFP-rotulados bactérias.
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Discussion
Estudos sobre o papel do sistema imunológico na mediação de sinalização molecular entre bactérias benéficas e os seus anfitriões têm, nos últimos anos, fez contribuições significativas para a nossa compreensão da co-evolução dos eucariotos com sua microbiota. O sistema squid / vibrio provou-se como um sistema modelo tratável para responder a perguntas fundamentais neste campo 2,3,5,6,8. A luz de órgãos do Euprymna squid scolopes permite a colonização exclusivamente pela bactéria Vibrio fischeri luminosa. Porque os tecidos que abrigam as bactérias permanecem em contato com água do mar, a lula não deve apenas promover a simbiose específicas, mas também continuar a excluir outras bactérias. Estudos têm revelado que continuou macrófagos-like hemócitos provavelmente desempenham um papel importante no estabelecimento e manutenção dessa associação 1,4,7. Porque o host squid não tem imunidade adaptativa, a especificidade incrível encontrado nesta associação devem ser total ou parcialmente mediado pelo sistema imune inato. Uma investigação recente dessas células sanguíneas revelaram que hemócitos isolado de E. scolopes reconhecer e fagocitar V. fischeri e não-simbiótica de bactérias diferencialmente e que a colonização provavelmente leva a um tipo de "tolerância imunológica" dos simbiontes 4. Este protocolo irá demonstrar como obter sucesso destas células de sangue de lula adulta e testar a sua capacidade de se ligar bactérias.
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Acknowledgments
Fontes de financiamento: Universidade de Connecticut Research Foundation e do Departamento de Biologia Molecular e Celular para SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid de Pesquisa e H. e R. Antonio Majorie
Romano de Pós-Graduação Educação Fellowship para AJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
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