קבלת Hemocytes מן הוואי Bobtail קלמארי Euprymna scolopes והתבוננות דבקותם חיידקים סימביוטיים שאינן הסימביוטי

Summary

וידאו זה יהיה להדגים כיצד להשיג hemocytes (כדוריות דם) של הוואי bobtail דיונון,

Abstract

מחקרים לגבי תפקידה של המערכת החיסונית בתיווך איתות מולקולרי בין חיידקים מועילים המארחים שלהם, בשנים האחרונות, תרומה משמעותית להבנת האבולוציה המשותפת של אאוקריוטים עם החיידקים שלהם. הקשר הסימביוטי בין הוואי bobtail דיונון,

Protocol

1. הכן 500 MLS של 0.22 פילטר מעוקרים ים מלאכותי מיקרומטר (FSW; מליחות 35 ppt). ים מלאכותי או טבעי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרון מיקרומטר להסיר חלקיקים וחיידקים.
2. הרדימי אחד מבוגר הוואי bobtail דיונון (Euprymna scolopes) על ידי הצבת בפתרון 2% אתנול FSW. מניחים את החיה הרדמה למשך כ 10 דקות. דיונון תחדל שחייה לא יהיה פעיל להגיב למגע. הנשימה המשך, שמסומן על ידי התנועה של המעטפת, ופעילות chromatophore עדיין צריך להיות שנצפו.
3. המקום דיונון עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה על מגש שעווה רגילה לנתיחה. להטביע את חיה עם FSW המכיל אתנול 2%.
4. שימוש אחד רגיל 200 טיפים פיפטה μl, למשוך בחזרה את המשפך ואת המעטפת כדי לחשוף את כלי הדם הראשי cephalic ממוקם בין שתי העיניים.
5. באמצעות מזרק סטרילי 1 מ"ל עם מחט 26.5-מד, לנקב את כלי הדם cephalic ולסגת בין 50-100 μl של hemolymph. מניחים את hemolymph בצינור סטרילי 1.5 מ"ל על הקרח.
   הערה: אם חיה ישמש פעמים תורם רבות, רק לסגת 10-20 μl של hemolymph בכל זמן נתון. מחזירים את החיה טנק מי ים רגילים. חיה יהיה להחיות בתוך 30 דקות.
6. Hemocytes שנאספו טרי נשטפים מחדש תלויה μl 500 של פתרון קלמארי של Ringer (S-האצבעות; 530 mM NaCl, KCl 10 mM, 25 מ"מ MgCl _2, 10 mM CaCl ₂ ו - 10 mM חיץ HEPES, pH 7.5).
7. ריכוזים Hemocyte נקבעים על ידי hemocytometer, וכ 2,000 תאים מתווספים תלושי החדרים מכסה זכוכית, ואפשר לדבוק הזכוכית של 10 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה צפיפות, hemocytes הטופס monolayer אחיד על פני השטח את השקופית זכוכית.
8. כדי לצפות חיידקי מחייב hemocytes המארח, hemocytes נחשפים זן חיידקי שכותרתו fluorescently כגון Vibrio fischeri ES114 ו / או Vibrio harveyi B392, שכל אחת מהן מכילה כתב פלואורסצנטי ירוק. V. fischeri ES114 וו ' harveyi B392 גדלים לשלב יומן אמצע ב tryptone מי ים מדיה (SWT) על 28 מעלות צלזיוס שייקר מסלולית. צפיפות אופטית ב 600nm נמדדת spectrophotometrically לקבוע צפיפות התאים. חיידקים הם pelleted ידי צנטריפוגה (5000 סל"ד במשך 5 דקות), supernatant הוא מושלך, ואת גלולה מחדש תלויה S-האצבעות.
9. 100,000 תאים חיידקיים מתווספים קאמרית כל כך טוב כי יש 50 חיידקים לכל hemocyte בממוצע. Hemocyte / תערובות חיידקים מודגרת בפתרון של S-Ringer במהירות של 25 ° C עבור 1 שעה, זמן נקבע להניב את מרב מחייב.
10. הציטופלסמה של hemocytes אז הם מוכתמים fluorescently עם CellTracker אורנג' 0.005% (Invitrogen) ולאחר מכן לשטוף S-האצבעות כדי להמחיש את התאים.
11. Hemocytes ויטראז עם חיידקים הקשורים נתפסים על ידי הקרינה או באמצעות גילוי Zeiss stereoscope V20 פלורסנט או מיקרוסקופ SP2 לייקה לייזר ספקטרלי confocal, ומנה מעל פני השטח של התא החי.

נציג תוצאות

מכיוון hemolymph תכשיטים hemocyanin מכיל תאית ולא המוגלובין, על חמצון, hemolymph יהפוך לכחול כהה. הממוצע של ~ 5000 hemocytes לכל μl של hemolymph יושג באמצעות שיטה זו. לאחר עמידה מחליק לכסות החדרים ואת מכתים ניאון, hemocytes אמור להופיע במאור אדום fluorescently ו amoeboid בצורת. עבור הידבקות חיידקים, V. fischeri תדבק גרוע hemocytes (1-2 תאים חיידקיים לכל תא דם) תוך V. harveyi תדבק מאוד (10-15 תאים חיידקיים לכל hemocyte).

באיור 1. למבוגרים הוואי bobtail דיונון Euprymna scolopes מראה המיקום של כלי דם cephalic.

איור 2. תוצאות של חשיפה hemocyte כדי Vibrio fischeri (א) ו Vibrio harveyi (B). אדום, כתום Cell Tracker, ירוק, GFP שכותרתו חיידקים.

Discussion

מחקרים לגבי תפקידה של המערכת החיסונית בתיווך איתות מולקולרי בין חיידקים מועילים המארחים שלהם, בשנים האחרונות, תרומה משמעותית להבנת האבולוציה המשותפת של אאוקריוטים עם החיידקים שלהם. מערכת דיונון / Vibrio הוכיחה את עצמה כמערכת מודל ממושמע כדי לענות על שאלות היסוד בתחום זה ^2,3,5,6,8. אור איבר של Euprymna דיונון scolopes היתרי קולוניזציה באופן בלעדי על ידי החיידק המאיר Vibrio fischeri. מאחר ורקמות שהבית חיידקים נשארים במגע עם מי ים, דיונון צריך לא רק לטפח את הסימביוזה ספציפיים, אלא גם להמשיך להוציא חיידקים אחרים. לימודי המשך חשפו כי macrophage כמו hemocytes סביר לשחק תפקיד חשוב בהקמת ותחזוקה של קשר זה ^1,4,7. מכיוון מארח דיונון חסר חסינות אדפטיבית, הספציפיות מדהים נמצא קשר זה חייב להיות מלא או חלקי מתווכת דרך מערכת החיסון המולדת. החקירה האחרונה של תאים אלה בדם עולה כי hemocytes מבודד E. scolopes להכיר phagocytose V. fischeri ולא חיידקים סימביוטיים דיפרנציאלי והקולוניזציה כי סביר מוביל לסוג של "סובלנות חיסונית" של symbionts ^4. פרוטוקול זה יהיה להדגים כיצד הצלחת להשיג את התאים האלה מהדם דיונון בוגר ולבדוק את יכולתם להיקשר חיידקים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155411
26.5 G 1ml latex-free insulin syringe	BD Biosciences	C34551
Cell Tracker Orange	Invitrogen	C34551
SteREO Discovery V20 Microscope	Carl Zeiss, Inc.
SP2 Confocal Microscope	Leica Microsystems