Demostramos nuestro enfoque a la búsqueda de posibles elementos potenciadores de los genes de desarrollo regulado y la evaluación de su función a través de la transgénesis mosaico de pez cebra.
Abstract
La finalización de la secuencia del genoma humano, junto con la de muchas otras especies, ha puesto de relieve el desafío de atribuir funciones específicas a la no codificación de secuencias. Una de las funciones destacadas llevadas a cabo por la fracción no codificantes del genoma es la de regular la transcripción de genes, sin embargo, no existe ningún método eficaz para predecir ampliamente cis-elementos reguladores de la secuencia primaria del ADN. Hemos desarrollado un protocolo eficaz para evaluar funcionalmente posibles elementos reguladores cis-a través de la transgénesis de pez cebra. Nuestro enfoque ofrece ventajas significativas sobre las técnicas de cultivo celular basada en los genes de desarrollo importantes, ya que proporciona información sobre la regulación genética espacial y temporal. Por el contrario, es más rápido y menos costoso que experimentos similares en ratones transgénicos, y que habitualmente se aplica a las secuencias aisladas del genoma humano. Aquí demostramos nuestro enfoque a la selección de los elementos de prueba sobre la base de la secuencia de conservación y el protocolo para las secuencias de la clonación y la microinyección en embriones de pez cebra.
Protocol
1. Selección y la clonación de secuencias conservadas para las pruebas Primero hay que identificar las posibles secuencias reguladoras de las pruebas funcionales. Contamos con la conservación de una secuencia evolutiva como un criterio para seleccionar las secuencias, y la mayoría utilizan a menudo el PhastCons algoritmo, que es accesible como una pista en la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Sin embargo, hay muchos otros algoritmos disponibles para evaluar la secuencia de co…
Discussion
Hemos demostrado el método utilizado en nuestro laboratorio para el análisis eficiente de los potenciadores del potencial uso de la transgénesis de pez cebra. Muy a menudo, se utiliza este método para buscar tejido-específica potenciadores asociados con genes humanos. A pesar de la falta de homología de secuencia más evidente de la época entre los humanos y los peces secuencias no codificantes, nos encontramos con que este enfoque suele tener éxito en la identificación de los potenciadores de los genes de inte…
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Paula Roy para la cría de peces de excelente, y Steve Ekker para el tipo de regalo el plásmido pDB600. Estos estudios fueron financiados por una donación a San Francisco de NHGRI.