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Neuroscience

在昆虫单感器记录果蝇按蚊 doi: 10.3791/1725 Published: February 17, 2010

Summary

在使用单一感器录音昆虫气味的嗅觉感官神经元的电生理反应,可测。在这个视频文章,我们将演示如何执行单一飞醋的触角感器录音(。

Abstract

昆虫的嗅觉寻找食物,配偶,天敌和产卵场所3,。昆虫的嗅觉感觉神经元(OSNs)被称为感受器的感觉毛,其中包括嗅觉器官表面封闭。每个感器的表面覆盖着微小的孔隙,通过气味传递和化解感器淋巴液的液体,沐浴安置在一个给定的感器OSNs的感官树突。通过OSN树突表达气味受体(OR)的蛋白质,它在昆虫气味门控离子通道4,5的功能。互动的ORs要么增加气味或减少通过OSN基础射速。这在动作电位形成的神经元活动体现的质量,强度和时间特征的气味6,7的第一个代表性。

鉴于方便地访问这些感觉毛,它可以执行从单一OSNs引入感器淋巴结记录电极,参比电极放置在昆虫的眼睛或身体的淋巴结外的录音。在果蝇 ,一至四个OSNs感器的房子,但每个OSN通常会显示一个特征的尖峰幅度。穗排序技术使人们有可能分配扣球个别OSNs的反应。这种单一感器记录(SSR)技术监控潜在OSNs 1,2,8受体活性产生的尖峰电脉冲感器淋巴液和参比电极之间的区别。在尖峰数量变化的气味代表的气味编码在昆虫细胞的基础。这里,我们描述的制备方法,目前在我们的实验室用来执行对果蝇和按蚊的SSR,并显示在感器特定方式的气味引起的代表痕迹。

Protocol

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1。气味稀释

  1. 大多数气味溶于石蜡油。然而,DMSO或乙醇也可以被用来作为对特定气味的替代溶剂。准备适当稀释(例如1:10体积:体积,V:V)从纯粹的玻璃小瓶气味。大多数的气味稀释,在室温下稳定,但极易挥发的化合物,它是更好的每周工作稀释。每个感器的响应,以不同浓度范围内不同的气味。对于果蝇 ,一个有用的查表的,适当的浓度,使用一个给定的感器,可以发现在6,7。

    对于视频实验中,我们用石蜡油作为溶剂的控制和醋酸甲酯(10 -6 V:v在石蜡油)和1 -辛烯-3 - (10-7 V:v在石蜡油果蝇和按蚊录音,分别为。
  2. 用剪刀,切成3毫米× 5厘米条层析纸,使他们适合巴斯德吸液管内。
  3. 移液器30μL的滤纸条上所需的气味,玻璃吸管插入。切〜3厘米的空气管路,插入吸管的开口端,关闭它的连接器。连接器是用来密封吸管,然后将连接到一个空气泵空气管路时,时间,在实验过程中提供的气味。

2。气味输送系统

  1. 使用的小钻,切10毫升塑料血清移液器(如在4毫升),并创建两个孔(例如,在-1.5 mL和-0.5毫升商标)将用来存放移液器含有的气味。插入一个200μL枪头刺耦合,并引入到10毫升吸管的钝端的耦合。吸管将被用作气味交付系统的一部分。
  2. 附加磁性支架上的吸管,用吸管钳和附近的显微镜,它的位置。

3。锐化电极

  1. 为了加强电极,准备0.5米的氢氧化钾溶液(KOH)和过滤器以去除细颗粒物(如:采用45微米过滤器)。 20毫升的注射器和一个小孔(直径为2毫米),墙上贴着一针针尖(从尖〜1厘米),在其中插入电线(图1A)。
  2. 填充注射器,用0.5 M KOH和打击,在显微镜下它的立场上,使针尖放置在视野(图1B,C),。到注射器上墙(图1B)的小孔,插入电线,确保导线是不能直接在注射器入口前。此线连接到直流电源(例如野生Heerbrugg MTR32,见方法)或交流电源(如野生Heerbrugg - LEP 990018)极的阴极。连接到显微镜右侧的手动显微电极支架轴,并附加电缆与鳄鱼夹的电极支架轴的基础。连接电缆的直流电源或交流电源(图1A)的另一极阳极。
  3. 插入电极支架的钨丝(约5厘米长),并且将它附加到电极支架轴操纵。设置为6 V的电源,插入注射器反复磨练线的一角,小心监控,在显微镜下在这个过程中的提示(图1C)。要得到一个理想的录音的电极,其长度在溶液中的90%,为1分钟,并慢慢地将其拉出。然后插入只有约50%的电极,以进一步薄30秒,并重复削尖(〜10倍)的导线尖端。

    电极尖端应足够细,进入了感​​器,但没有这么细,弯曲,当它触动它在录音(步骤6和7)。虽然看解剖显微镜下的电极尖端,而它被削尖,是一个很好的迹象,其厚度仅看它记录在高倍显微镜下将给出一个明确的想法,一个给定的电极是否适合用于记录。

4。昆虫准备: 果蝇天线

  1. 构建一只苍蝇抽吸。剪下一块空气管路足够长的时间挂在你的脖子,舒适(约90 - 120厘米)。剪下200μL枪头的尖端和管的一端插入。在另一端,位置1〜1.5厘米× 1.5厘米的网状片,以便它创建了一个物理屏障,但并不妨碍空气管流出。剪下1毫升枪头和管开放的顶部位置更广泛的提示,阻断之间的网格。这部分将用于拿起和操纵成人醋蝇(图2)。
  2. 以载玻片,放置了一块大约在长边的中间牙科用蜡。它positio顶部NA玻璃盖略微倾斜向上(〜30),确保蜡是不是直接放在最上面的一部分,这将防止在显微镜下可视化飞醋。拉玻璃电极垂直拉拔。其尖端应薄且具有足够的灵活性,以适应在第二和第三的触角段之间,并保持录音天线稳定。另一块蜡玻璃电极的位置,放在玻璃盖的一侧,远远不够,笔尖的时候,降低到达角落的玻璃盖(图3A)。
  3. 工作所需的基因型成蝇瓶或小瓶,拿起一个成年人的飞醋,使用飞抽吸​​。虽然女性通常是因为他们的更大的大小,男性也可以使用。 1毫升的小费上放置一个200μL枪头,以避免逃跑的飞行。吹入管,使飞对200μL枪头年底推。修剪刀片的枪头远离苍蝇本身几毫米宽的一端,然后插入一些蜡,以防止飞打了退堂鼓。在显微镜下,再次下调头附近的飞醋,注意不损害动物。有了一个小吸头,推蜡力飞头,使眼睛的一半左右,从尖(图3B)挤出。确保它的腿不出来为好,否则可能会移动和干扰录音。
  4. 山飞一块蜡,其头部朝上,并将其放置在前面的玻璃盖的幻灯片上。将头微微对玻璃的一角,使触角延伸和休息上的玻璃。下之间的第二次和第三次的触角段(图3B)的玻璃毛细管的尖端。
  5. 天线的不同部分会进入到不同类型的感受器。根据特定的实验需要,天线将需要面向不同的,允许访问到不同类型的感受器。要记录在我们的例子从大basiconic感器的阿里斯塔向下压在玻璃上(图3B)。

5。昆虫准备: 按蚊上颌触须

  1. 使用电动吸引器(图2E),40至60 3-5天(混合男性和女性)老蚊子收集的小塑料箱(图2F)。蚊子应该已经在正常条件下饲养,在昆虫的孵化器或insectary即在25-28℃,湿度70-80%。将冰〜15分钟的小动物的塑料保持架,直到它们被寒冷的麻醉。动物一旦停止移动,只有4-6动物转移的阶段,在显微镜下在任何一个时间内,保持其余的动物,在程序上冰。虽然女性通常是因为他们对CO 2的敏感性,男性也可聘用。选择女性或男性的蚊子,其天线结构(羽毛般的女性,男性长丝)来看,并删除它们的翅膀和腿,用细镊子固定。保持在一个小塑料杯,他们在底部的湿纸,以防止他们从desiccating。
  2. 把两条双面胶带(〜1厘米的长度),在该中心,并在载玻片两侧平行于对方(〜1厘米),(图3C)。用细镊子,地方对中央磁带之一蚊子解剖显微镜下,侧身把它坚持它的身体和一只眼睛,在磁带上。调整这样既触须延伸到磁带上(图3D)平行的位置上颌骨的触须。弦细(如人的头发)放置在基地和触须(图3D)的尖端修复上颌骨的触须。端磁带存储作为弦细,而中央的磁带需要被替换后,每一个记录(图3C)。

6。记录果蝇

  1. 幻灯片下放置在低倍率的显微镜和天线位置大致在中间领域的视野(FOV)(图4B)(图4A)。轻轻放下,使参比电极电极位于飞和记录电极靠近天线(图4C)眼睛附近。增加在中间的视野(图4D)的放大倍率和重新定位的天线。
  2. 广场的气味传递给设备密切飞的头,指着在天线。
  3. 在低倍率(图4C),参比电极插入飞的眼睛。下而不触及其表面上的天线顶端的记录电极。
  4. 切换到高放大倍率,控制与显微记录电极,并把它插入到选定感器(图4D)。沿感器长度的任何一点是录制好的​​。一旦感器内,电极可推更远(有时所有的方式通过)以获得更好的信噪比。一旦电极感器,可以检测细胞的自发活动。

7。录音按蚊

  1. 放置在低倍率(10倍)的视野和头顶部的中间位置,大约在上颌骨的触须的显微镜下的载玻片(图4E)。旋转舞台,直到在直角与记录电极的触须。
  2. 调整电极的高度,使参比电极定位略高于眼睛的蚊子和记录电极附近的上颌骨的触须。
  3. 将气味传送装置,使其尽可能接近的触须。
  4. 参比电极插入眼睛,在较低的放大倍率(10倍),并切换到更高的放大倍率(100X),触须(图4F)的记录电极插入PEG感器。一旦电极感器,可以检测细胞的自发活动。

8。代表性的成果

根据感器和录音质量,可以区分不同数量的嗅觉神经元在一个单一的跟踪。 果蝇在大basiconic感器,例如,2至4尖峰幅度不同的细胞应该会出现在录制过程中,10

我们的视频实验中果蝇AB2感器显示两个细胞,一个细胞(图5,蓝色的尖峰)和B细胞(图5,绿色尖峰) 。石蜡油(图5A)申请的过程中无论是细胞被激活,而只有在一个细胞响应10-6稀释醋酸甲酯(图5B )。

按蚊的上颌触须,沟槽PEG感器包含三个单元格,但只有两个很容易受到歧视(图5C,蓝色和绿色的峰值,分别)。在视频实验中,我们显示的B细胞如何响应一个10-7稀释1 -辛烯-3 -醇(图5D )。

图1
图1。电极卷笔刀
(二)(A)一般查看电极机设备。的注射器,注射器开幕电极尖端含有0.5 M KOH(左)用于增强电极(右)。(c)关闭。

图2
图2。如何准备飞抽吸和蚊子吸气泵
(A)启动材料:。。空气线塑料管,两个切割枪头,和网状(二)(四)一旦完成飞抽吸(三)年底,是用来捕捉醋蝇的详细细节飞抽吸另一端(E)电动吸引蚊子收集由一个主体和一个可拆卸的塑料保持架(F)可拆卸的蚊子塑料保持架。

图3
图3。准备录制一个飞醋( 果蝇 )和疟疾的蚊子( 按蚊
(二)(一)飞行装醋的图片前,它定位在显微镜下幻灯片上。特写玻璃毛细管保持在天线的飞醋头(C)一种通过蚊子传播的图片上安装幻灯片(d)关闭蚊子头长鼻和磁带上的触须坚持。

图4
图4。录制从飞醋( 果蝇 )和疟疾的蚊子( 按蚊
(一)电设置(B)的飞行准备关闭安装在显微镜上。请注意各自的位置,记录电极(左),气味传送系统(中间移液器),和记录电极(右)(C)下10倍的目标动态图像(D)飞天线100X的目标;大basiconic感器(箭头),(五)非感官毛(箭头)之间穿插的10X查看记录安装一只蚊子(F)的蚊子的触须和PEG感器(箭头)高倍镜视野。 。

图5
图5。从果蝇的录音和按蚊
(一) 果蝇的AB2感器房子两个感觉神经元;。一个单元格(蓝色尖峰)和B细胞(绿色尖峰)(二 )10-6醋酸甲酯的应用过程中的A和B 细胞 (C) PEG 按蚊感器设有两个感觉神经元的一个单元格(蓝色尖峰)和B细胞(绿色尖峰)(四)10-7 1 -辛烯-3 -醇PEG感器的应用。

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Discussion

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用于生物识别的食物来源,潜在的队友,和食肉动物的嗅觉线索。嗅觉感觉神经元(OSNs)之间的外部刺激,并进一步处理信息的大脑中心的第一个接力中心。在果蝇按蚊 ,OSNs方便,可以监视他们的电活动而刺激的气味喷。

单感器记录(SSR)技术的解释,该视频已被广泛应用于从OSNs记录和研究它们的电反应,大量的气味6, 7。嗅觉受体(ORS)6,11和口服补液盐映射到特定地点的果蝇天线9,12,13 deorphanization的SSR技术分析体内特定的ORs的电生理特性的有力工具,作为第一个一步了解了外部嗅觉世界是如何翻译成电信号通过其OSNs,并最终被动物感知。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Paraffin oil Odors Fluka 76235
High purity odors (>98%) Odors Sigma-Aldrich Methyl acetate
#296996
1-octen-3-ol
#74950
Filter paper strips Odors Fisher Scientific 05-714-1 Chromatography paper
Connectors Odors Cole-Parmer EW-06365-40 1/16x1/8"
Glass vials Odors Agilent Technologies 5182-0556
Air line plastic tubing Odor Delivery Python Products 500PAL
1 serological pipette Odor Delivery Corning 4101 10 mL
Plastic tubing Odor Delivery Cole-Parmer EW-06418-0 0.050"x0.090"OD
Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes Odor Delivery Fisher Scientific 13-678-20A 5-3/4 inches
Programmable stimulus controller Odor Delivery Syntech CS-55
Anti-vibration table Electrophysiology Equipment TMC 63533 36”Wx30”Dx29”H
Faraday cage Electrophysiology Equipment TMC MI8133303
Inverted microscope Electrophysiology Equipment Nikon Instruments E600FN ECLIPSE Recording microscope
10x and 100x objectives Electrophysiology Equipment Nikon Instruments 10x Plan Fluor 100x L Plan
Dissecting microscope Electrophysiology Equipment Nikon Instruments EZ645 electrode sharpening/insect prep microscope
Magnetic stands Electrophysiology Equipment Newport Corp. MODEL 150
IDAC Electrophysiology Equipment Syntech IDAC-4
Acquisition software Electrophysiology Equipment Syntech Autospike
1 macromanipulator Electrophysiology Equipment Narishige International MN-151 Joystick manipulator
Used for positioning reference electrode
1 micromanipulator Electrophysiology Equipment EXFO PCS-6000 Used for positioning recording electrode
Crocodile clip Electrophysiology Equipment Pomona AL-B-12-0
Electric cable Electrophysiology Equipment Pomona B-36-0 Test Cable Assembly
2 electrode holders Electrophysiology Equipment Syntech N/A Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode
AC probe Electrophysiology Equipment Syntech N/A Universal single ended probe (10xAC)
Tungsten electrodes Electrophysiology Equipment Microprobes M210 straight tungsten rods, 0.005x3
Potassium hydroxide Electrophysiology Equipment Sigma-Aldrich 221473
Syringe Electrophysiology Equipment BD Biosciences 301625 20 mL
Power supply Electrophysiology Equipment Wild Heerbrugg e.g MTR32
Vertical puller Insect prep Narishige International PB-7
Razor blade Insect prep VWR international 55411-050
Dental wax Insect prep Patterson 091-1503
Microscope slide Insect prep Fisher Scientific 12-550A
Cover glass Insect prep Fisher Scientific 12-541A 18X18 #1.5
Polypropylene mesh Insect prep Small Parts, Inc. CMP-0500-B
Glass electrode Insect prep Frederick Haer and Co. 27-32-0-075 Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm
Double-sided tape (3M) Insect prep 3M MMM6652P3436 Double-sided tape (3M)
Forceps Insect prep Fine Science Tools 021x0053 Dumont #5 Mirror Finish Forceps
Small plastic cup Insect prep VWR international 89009-662 7 x 5.7 (23/4 x 21/4)
Electric aspirator Insect prep Gempler’s RHM200

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References

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在昆虫单感器记录<em>果蝇</em><em>按蚊</em
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Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725, doi:10.3791/1725 (2010).More

Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725, doi:10.3791/1725 (2010).

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