B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델
Summary
이 비디오에서는, 우리는 CD40 – 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.
Abstract
B 세포에 관한 연구는 CD40 활성화들은 항원 프레 젠 테이션 능력을 향상하는 것으로 나타났습니다. 인터루킨 – 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극을 때, 인간의 B 세포는 고도로 순수 CD40 – B 세포 (매우 큰 금액을 14 일 이내에 말초혈 소량의 어려움없이 확장 가능> 10<sup> 9</sup건강한 기증자뿐만 아니라 암 환자에서 환자마다> 전지)<sup> 1-4</sup>. CD40 – B 세포 중요한 림프절 유도 분자를 표현하고 T 세포를 유도할 수<em> 체외에서</em<sup> 5</sup>. 또한 그들은 효율적으로 T 세포, 프로세스와 현재의 항원을 차지<sup> 6,7</sup>. CD40 – B 세포는 주요 순진하지에만 표시뿐만 아니라 메모리 T 세포를 확장했다<sup> 8,9</sup>. 따라서 CD40 – 활성 B 세포 (CD40 – B 세포)의 대체 소스로 연구되었습니다 단백질 stimulatory 항원 제시 세포 기반 immunotherapy1, 5,10를위한 세포 (APC)를. CD40 – B 세포가 생체내 효과적인 T 세포 반응을 유도하고 우리가 murine CD40 – 활성 B 세포의 생성을위한 세포 배양 시스템을 확립 기본 메커니즘을 연구 여부를 진학하기 위해서는. splenocytes를 사용하거나 CD40 – 정품 인증 C57BL / 6 마우스에서 B 세포를 정화, 최적의 조건은 다음과 같이 확인되었습니다 : C57BL / 6 마우스 (haplotype H – 2B) lymphocytes의 splenocytes의 시작은 밀도 기울기 원심 분리와 헬라와 함께 공동 양식에 의해 정화 아르 재조합 murine CD40 리간드 (tmuCD40L 헬라)를 표현 세포<sup> 11</sup>. 세포 3-4일 모든 recultured하고 같은 CD40L, 인터루킨 4와 같은 주요 구성 요소는 – 메르 캅 토 에탄올과 시클 로스 포린 A은 보충함 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 인간 CD40 – B 세포 (그림 1A, B)에 APC – 표현형 유사한 완벽하게 활성화 murine CD40 – B 세포 (mCD40B)을 구하는 방법을 보여줍니다. CD40 – 자극은 세포 배양 후 14 일 이내에 신속한 가지 고도 순수 (> 90%) CD19 + B 세포의 확장 (그림 1C, D)에 연결됩니다. 비 transfected 세포와 오염을 방지하려면 transfectants에 murine CD40 리간드 표현 (그림 2) 정기적으로 제어되어야한다. Murine CD40 – 활성 B 세포는 체외에서 생체내의 APC로 함수 자신의 잠재력을 조사하기 위해 B – 세포 활성화와 차별화뿐만 아니라 공부를하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은 종양에 대한 치료 또는 예방 접종을 수립을위한 유망한 도구를 대표하고 안전과이 방법의 immunogenicity에 관한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
이 프로토콜의 수정은 특히도 murine CD40가 활성화된 B 세포의 효율적인 세대에 항복, CD40 – 자극 및 사용 마우스 변형의 유형의 기원에 대해 가능합니다. 아마디 외. CD40 – 리간드와 transfected murine 마우스 섬유아 세포에 대한 유사한 결과를 보여주었다. 외부의 항원이 맞는 프레 젠 테이션에서 확실하게 제외하지만, 보안 및 생체내의 독성에 관한 집중 연구는 인간의 transfected 헬라 세포를 사용?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 친절 tmuCD40 – 리간드 – 헬라 세포 라인을 제공 클레멘스 박사 Wendtner 감사합니다.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
References
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