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Immunology and Infection

Modelo murino de CD40-ativação de células B

doi: 10.3791/1734 Published: March 5, 2010

Summary

Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ativação CD40-e expansão de células B murino de esplenócitos de camundongos C57BL / 6, que pode ser usado como um modelo de células apresentadoras de antígenos (APC) para estudar a indução de imunidade.

Abstract

A investigação sobre células B CD40 mostrou que melhora a sua capacidade de ativação apresentação de antígenos. Quando estimuladas com interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L), células B humano pode ser expandido sem dificuldades a partir de pequenas quantidades de sangue periférico dentro de 14 dias para grandes quantidades de altamente pura CD40 células-B (> 10

Protocol

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O protocolo para a geração de células CD40 de murino ativado B (mCD40B) de esplenócitos é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação do ligante CD40 de murino (CD40L) expressando células HeLa (tmuCD40L HeLa), que será utilizado como placa obrigado células alimentadoras. Parte B descreve a real cultura CD40-B murinos.

A. Preparação de células alimentadoras (tmuCD40L HeLa)

O HeLa tmuCD40L é uma linha de células epiteliais humanas aderente, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado.

  1. Remova o meio de idade a partir da cultura primária com uma pipeta estéril e lavar as células com 10 mL de PBS 1x. Aspirar o PBS após a lavagem.
  2. Adicionar 4 mL de 1x Tripsina / EDTA em um frasco de 75 cm 2 por 10-15 minutos a 37 ° C. Use tocando suave para retirar as células.
  3. Adicionar 10 mL de meio de tipo selvagem e giratória suavemente para parar a digestão com tripsina.
  4. Transferir a suspensão de células em um tubo de 50 mL com uma pipeta estéril e girar a células para baixo a 265 xg por 7 minutos.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de tipo selvagem. Conte o número de células de uma alíquota da suspensão de células e preparar três tubos de 50 mL com o número adequado de células:
    1. 2,5 x 10 6 células para subcultura
    2. 0,4 x 10 6 células / poço de irradiação utilizadas para a cultura de células murinas CD40-B
    3. restante para congelar (se necessário).
  6. Spin the células para baixo a 265 xg por 7 minutos.
  7. Remover o sobrenadante.
    1. Para subcultura: ressuspender 2,5 x 10 6 células em 10 mL de médio seleção em um frasco de 75 centímetros de cultura de células 2 (densidade celular de 2,5 x 10 5 células / mL) e incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2. Dividir as células duas vezes por semana.
    2. Para a cultura de células murinas CD40-B: Você precisa de 2,4 x 10 6 células para uma placa de 6 poços. Ressuspender as células HeLa em meio tmuCD40L tipo selvagem, a uma densidade de 0,2 x 10 6 células / mL e irradiar-los em 78 Gy. Placa de 2 mL da suspensão de células em cada poço e incube-os a 37 ° C com 5% de CO 2. Utilize este placas preparado para a estimulação de células B, quando as células HeLa são tmuCD40L aderente (pelo menos 4 horas: verificar a aderência do uso do microscópio, não espere mais de 24 h para iniciar a estimulação de células B). (Continue com B.)

B. murino CD40-cultura de células B

I. Elaboração de esplenócitos para CD40-estimulação (dia 0):

Por favor note: antes de continuar determinar que as células de alimentação são aderentes. Sempre adicionar novas soluções de murino imediatamente interleucina-4, β-mercaptoetanol e ciclosporina A para o meio de crescimento antes do uso.

  1. Dissecar baço de camundongos C57BL / 6 (haplótipo H-2b) e lavá-la duas vezes em 10-20 mL DMEM suplementado com Gentamicina [15μg/mL], transferindo-o com uma ponta de pipeta 10 ml de um tubo para outro. Evitar a transferência de contaminantes (por exemplo, o cabelo) do mouse. Mince baço por passagem através de um filtro de células (100μm) e enxaguar com outra peneira de 10 mL de meio. Spin down esplenócitos a 265 xg por 7 min em temperatura ambiente, ressuspender-los em 7ml muCD40-B médio de células, e os linfócitos separado por centrifugação Ficoll densidade. Para fazê-lo células da camada em 5 mL Mouse-Pancoll (pré-aquecido em temperatura ambiente) em um tubo de 15 ml e centrifugar a 450 xg por 30 min sem freio à temperatura ambiente.
  2. Empate fora de a maioria da camada superior, deixando intacta a camada de linfócitos na interface. Transferência de camada de linfócitos a um tubo de 50 mL frescos, lave uma vez com 30mL DMEM com Gentamicina [15μg/mL] para baixo, girando a 265 xg por 7 min para remover outras células. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de mCD40-B médio de lavar roupa. Determinar o número de células em uma alíquota da suspensão de células. Determine o número de células por contagem uma alíquota da suspensão de células.
  3. Spin para baixo a quantidade necessária de células em 265 xg por 7 minutos. Para uma placa de 6 poços 5 x 10 6 células / poço são necessários, portanto, 30 x 10 6 células por placa.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender os linfócitos em 1,25 x 10 6 células / mL em mCD40-B meio de cultura fresco suplementado com 1 U / mL de IL-4 como fator de crescimento, 100 mM β-mercaptoetanol e 0,63 mcg / mL A ciclosporina para prevenir conseqüência de células-T (concentrações indicados referem-se a um meio de cultura mL!).
  5. Retire o sobrenadante da placa de 6 poços de pré-incubados com células HeLa tmuCD40L.
  6. Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de linfócitos (1,25 x 10 6 células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
  7. Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2. No dia 3 reculture as células (Continue com II.1.).

II. Subcultura de células mCD40B (dia 3 e, em seguida, duas vezes por semana):

  1. Colheita aglomerado de células mCD40B por vigorosamente pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL e piscina-los em um tubo de 50 mL.
  2. Girar em 265 xg por 7 minutos e substituir completamente o sobrenadante com mCD40-B médio de lavar roupa. Contando a quantidade de células de uma alíquota, gire a células para baixo a 265 xg por 7 minutos. Ressuspender as células em mCD40B mCD40-B meio de cultura a uma concentração de 0,75 x 10 6 células / mL.
  3. Adicionar novas soluções de murino interleucina-4 em uma concentração de 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol β-M e 0,63 mcg / mL ciclosporina A ao meio.
  4. Remover o sobrenadante de uma placa de 6 poços de pré-incubados com células irradiadas tmuCD40L HeLa.
  5. Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de células mCD40B (0,75 x 10 6 células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
  6. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2.
  7. Novamente subcultura as células a cada 3-4 dias para acabar com alta pureza murino células CD40-B ativadas após um total de 14 dias.

C. Resolução de problemas: O que se CD40-B células não crescem?

  1. Você tem verificado para CD40 ligante expressão de células de alimentação?
  2. São a placa-bound células alimentadoras usado para a estimulação com mais de 24 horas?
  3. Existe uma contaminação com micoplasma?
  4. Foi a solução interleucina-4 utilizada para a suplementação recém descongeladas e que teve a atividade biológico adequado?
  5. Foi β-mercaptoetanol e ciclosporina A adicionado na concentração correta?

Figura 1-A
Figura 1a.

Figura 1 b
Figura 1b.

Figura 1 d
Figura 1d.

Figura 2
Figura 2.

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Discussion

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Modificações deste protocolo são possíveis, especialmente quanto à origem do estímulo-CD40 e do tipo de estirpe do rato utilizado, rendendo também na geração eficiente de células CD40 de murino B ativadas. Ahmadi et al. têm mostrado resultados semelhantes para fibroblastos de rato transfectadas com murino CD40 ligante. Nesta apresentação contexto de xeno-antígeno pode ser excluída com certeza, mas estudos intensivos em matéria de segurança e toxicidade in vivo não deu sinais de inflamação ou auto-imunidade reação neste cenário com células transfectadas HeLa. No entanto, a melhor alternativa representa um murino solúvel CD40 ligante com a ativação e proliferação de atividade, ao mesmo tempo, que é a nosso conhecimento não disponíveis comercialmente.

Este protocolo também funciona para linfócitos de ratos 129S2/SvPas (haplótipo H-2b), mas ainda não foi avaliada por linhagens de camundongos ainda mais até o momento. Além disso as diferenças de ajuste de densidade celular, a concentração de citocinas, a duração da ciclosporina A de tratamento, meios de cultura celular e pratos também podem levar a eficiente CD40-ativação de células B de camundongos com taxas de proliferação similar. No entanto, um intenso trabalho tem sido gasto na otimização deste sistema maximizando as taxas de ativação e proliferação, resultando no atual sistema.

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Disclosures

Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes nacionais e europeus de manter laboratório animal. Referindo-se a lei alemã de bem-estar dos animais, os animais foram controlados regularmente pelas autoridades competentes.

Acknowledgments

Pedimos gentilmente agradecer ao Dr. Clemens Wendtner para fornecer tmuCD40-Ligand-linha celular HeLa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
2. Feeder cell selection medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
Hygromycin B, 0.2 mg/mL
3. mCD40-B washing medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
4. mCD40-B culture medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
MEM, 0.1mM (1x)
FBS, 10%
B. Miscellaneous Reagents:
RPMI 1640 Invitrogen REF 21875
D-MEM Invitrogen REF 41965
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen REF 11140
Hygromycin B PAA Laboratories Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, (11), 2757-2765 (1997).
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  4. Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
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Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).More

Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

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