Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

doi: 10.3791/1734 Published: March 5, 2010

Summary

В этом видео мы продемонстрируем процедуру активации CD40 и расширение мышиных клеток из спленоцитов C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в качестве модели антиген-представляющих клетки (АПК) для изучения индукции иммунитета.

Abstract

Исследование клеток показало, что CD40 активации улучшает их презентации антигена мощности. При стимуляции с интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L), человеческих клеток может быть расширена без трудностей из небольшого количества периферической крови в течение 14 дней до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол поколение мышиных CD40-активированных В-клеток (mCD40B) из спленоцитов делится на две части: часть демонстрирует подготовку мышиной CD40 лиганда (CD40L), выражающая HeLa клетки (tmuCD40L HeLa), который будет использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерных клеток. Часть В описывает фактические мышиной CD40-B культуры.

А. Подготовка фидерных клеток (tmuCD40L HeLa)

TmuCD40L HeLa является сторонником человеческих эпителиальных клеточных линий, которые никогда не должны стать полностью вырожденная. Клетки, таким образом, разделил два раза в неделю. Культивирование в течение более 6 недель не рекомендуется.

  1. Удалить старые среды от первичной культуры с стерильной пипетки и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Аспирируйте PBS после мытья.
  2. Добавить 4 мл 1x трипсина / ЭДТА в 75 см 2 колбы в течение 10-15 минут при температуре 37 ° C. Используйте нежное нажмите, чтобы отделить клетки.
  3. Добавьте 10 мл дикий тип среды и поворота осторожно, чтобы остановить пищеварения трипсином.
  4. Передача клеточной суспензии в 50 мл трубки с стерильной пипетки и спина ячейки вниз на 265 мкг в течение 7 минут.
  5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл дикий тип среды. Граф количества клеток аликвоту суспензии клеток и подготовить три 50 мл трубки с соответствующим количеством клеток:
    1. 2,5 х 10 6 клеток для субкультуры
    2. 0,4 х 10 6 клеток / лунку для облучения используется для мышиного CD40-B культуре клеток
    3. Остальная заморозить (при необходимости).
  6. Спиновые клетки вниз на 265 мкг в течение 7 минут.
  7. Удалить супернатант.
    1. Для субкультивирования: ресуспендирования 2,5 х 10 6 клеток в 10 мл выбор среды в 75 см 2 колбы культуры клеток (плотность клеток 2,5 х 10 5 клеток / мл) и инкубировать клетки при 37 ° C с 5% CO 2. Сплит клетки два раза в неделю.
    2. Для мышиного CD40-B культуре клеток: Вам нужно 2,4 х 10 6 клеток на один 6-луночный планшет. Ресуспендируют tmuCD40L клетках HeLa в дикий тип среды с плотностью 0,2 х 10 6 клеток / мл и облучать их на 78 Гр. Пластина 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать их при температуре 37 ° C с 5% CO 2. Используйте этот подготовленные пластины для В-клеток при стимуляции tmuCD40L HeLa клетки приверженцем (по крайней мере 4 часа: проверять соблюдение использованием микроскопа; не ждать более 24 ч до начала В-клеточной стимуляции). (Продолжить с Б.)

Б. мышей CD40-B культуре клеток

I. Подготовка спленоцитов для стимуляции CD40 (день 0):

Обратите внимание: перед тем как продолжить констатировать, что фидерных клеток являются приверженцем. Всегда добавляйте свежие решения мышиного интерлейкина-4, β-меркаптоэтанол и циклоспорин в питательную среду непосредственно перед употреблением.

  1. Рассеките селезенки C57BL / 6 мышей (гаплотип H-2b) и мыть дважды в 10-20 мл DMEM дополнен гентамицин [15μg/mL] путем переноса его с кончика пипетки 10 мл из одной галереи в другую. Избегайте передачи загрязняющих веществ (например, волосы) мыши. Фарш селезенки, пропуская ее через ячейки сетчатого фильтра (100 мкм) и промыть фильтр с еще 10 мл среды. Спином вниз спленоцитов в 265 мкг в течение 7 минут при комнатной температуре, ресуспендируют их в 7 мл muCD40-B клеточной среде, так и отдельные лимфоциты путем центрифугирования плотности Ficoll. Для этого слой клеток на 5 мл Mouse-Pancoll (предварительно нагретой при комнатной температуре) в 15 мл и трубки центрифуги при 450 мкг в течение 30 минут без тормоза при комнатной температуре.
  2. Слить большую часть верхнего слоя, оставляя нетронутой лимфоцитов слой на границе раздела. Передача лимфоцитов слой свежей 50 мл трубки, мыть один раз с 30 мл DMEM с гентамицин [15μg/mL] за счет остановки на 265 мкг в течение 7 минут, чтобы удалить другие клетки. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 10 мл mCD40-B средний стирки. Определить номер ячейки в аликвоту клеточной суспензии. Определить число клеток путем подсчета аликвоты клеточной суспензии.
  3. Спином вниз необходимое количество клеток в 265 мкг в течение 7 минут. Для 6-луночный планшет 5 х 10 6 клеток / лунку необходимо, таким образом, 30 х 10 6 клеток на чашку.
  4. Удалить супернатант и ресуспендируйте лимфоцитов на 1,25 х 10 6 клеток / мл в mCD40-B свежей питательной среды с добавлением 1 ЕД / мл интерлейкина-4 в качестве фактора роста, 100 мкМ β-меркаптоэтанол и 0,63 мкг / мл циклоспорин для предотвращения результатом Т-клеток (С учетом концентрации относятся к одной среды культуры мл!).
  5. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с клетками HeLa tmuCD40L.
  6. Аккуратно добавить 4 мл лимфоцитов подвески (1,25 х 10 6 клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
  7. Инкубируйте планшет при 37 ° C с 5% CO 2. На 3-й день reculture клеток (Продолжить с II.1.).

II. Субкультура клеток mCD40B (день 3, а затем два раза в неделю):

  1. Урожай mCD40B клетка кластера энергично пипетирования вверх и вниз с 10 мл пипетки и бассейном их в 50 мл трубки.
  2. Спином вниз на 265 мкг в течение 7 минут и полностью заменяют собой супернатант с mCD40-B средний стирки. При подсчете количества ячейки аликвоту, спина ячейки вниз на 265 мкг в течение 7 минут. Ресуспендируют mCD40B клеток в mCD40-B культуральной среде при концентрации 0,75 х 10 6 клеток / мл.
  3. Добавьте свежие решения мышиной интерлейкина-4 в концентрации 1 ЕД / мл, 100 мкМ β-меркаптоэтанол и 0,63 мкг / мл циклоспорина в среду.
  4. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с облученным tmuCD40L клетках HeLa.
  5. Аккуратно добавить 4 мл суспензии mCD40B ячейки (0,75 х 10 6 клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
  6. Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO 2.
  7. Снова субкультуры клетки каждые 3-4 дней, чтобы закончить с высокой чистоты мышиной CD40 активированных В-клеток после общей сложности 14 дней.

C. Устранение неисправностей: Что делать, если CD40-B клетки не растут?

  1. Проверяли ли Вы для CD40 лиганд выражение фидерных клеток?
  2. Являются ли пластинчатый питатель связаны клетки, используемые для стимуляции старше 24 часа?
  3. Есть ли загрязнение микоплазмой?
  4. Был интерлейкина-4 раствор, используемый для добавки свежей талой и сделал это есть соответствующее биологической активности?
  5. Был β-меркаптоэтанол и циклоспорин добавили в правильной концентрации?

Рисунок 1
На рисунке 1а.

На рисунке 1 б
На рисунке 1б.

Рисунок 1 г
Рис 1d.

Рисунок 2
Рисунок 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Модификации данного протокола возможны, особенно в отношении происхождения CD40-стимул и тип мыши напряжение используется, также уступая в эффективной генерации мышиной CD40-активированных В-клеток. Ахмади соавт. показали аналогичные результаты для мышиных фибробластов, трансфицированных мышиной CD40-лиганд. В этом контексте презентации ксено-антиген может быть исключен с уверенностью, но интенсивные исследования в области безопасности и токсичности в естественных условиях не подавали признаков воспаления или автоматической реакции иммунитета в данной ситуации с использованием человеческих трансфицированных клеток HeLa. Тем не менее, лучшая альтернатива представляет растворимый мышиный CD40-лиганд с активацией и пролиферирующие активности, в то же время, что, насколько нам известно, не на коммерческой основе.

Этот протокол также работает для лимфоцитов у мышей 129S2/SvPas (гаплотип H-2b), но не был оценен для дальнейшего линий мышей до сих пор. Кроме различий в налаживании плотность клеток, цитокинов концентрации, продолжительности лечения циклоспорином, культуры клеток и блюда также могут привести к эффективным CD40-активации мышиных клеток с такой же скоростью распространения. Однако интенсивная работа была проведена по оптимизации этой системы максимально активации и пролиферации ставки в результате существующей системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Эксперименты проводились в соответствии с национальными и европейскими рекомендации по поддержанию лабораторных животных. Что касается немецкого закона защиты животных животные находились под контролем регулярно соответствующие органы.

Acknowledgments

Мы любезно благодарит д-р Клеменс Wendtner за предоставление tmuCD40-лиганд-клеточной линии HeLa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
2. Feeder cell selection medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
Hygromycin B, 0.2 mg/mL
3. mCD40-B washing medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
4. mCD40-B culture medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
MEM, 0.1mM (1x)
FBS, 10%
B. Miscellaneous Reagents:
RPMI 1640 Invitrogen REF 21875
D-MEM Invitrogen REF 41965
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen REF 11140
Hygromycin B PAA Laboratories Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, (11), 2757-2765 (1997).
  2. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
  3. Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169, (4), 2164-2171 (2002).
  4. Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
  5. von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, (7), 2786-2789 (2006).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, (11), 2836-2843 (2003).
  7. Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124, (1), 129-140 (2008).
  8. Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, (9), 3319-3325 (2002).
  9. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, (2), 249-256 (2009).
  10. Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, (12), 659-664 (2004).
  11. Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107, (2), 742-751 (2006).
  12. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, (13), 955-965 (2008).
Мышиной модели CD40-активации В-клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).More

Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter