Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes

Summary

SNAP-tag et CLIP-tag systèmes d'étiquetage de protéines permettre au particulier, la fixation covalente de molécules, y compris les colorants fluorescents, à une protéine d'intérêt dans les cellules vivantes. Une fois cloné et exprimé, la protéine marquée peut être utilisé avec une variété de substrats pour de nombreuses applications en aval sans avoir à cloner à nouveau.

Abstract

SNAP-tag et CLIP-tag systèmes d'étiquetage de protéines permettre au particulier, la fixation covalente de molécules, y compris les colorants fluorescents, à une protéine d'intérêt dans les cellules vivantes. Ces systèmes offrent une large sélection de substrats fluorescents optimisé pour une gamme d'instruments d'imagerie. Une fois cloné et exprimé, la protéine marquée peut être utilisé avec une variété de substrats pour de nombreuses applications en aval sans avoir à cloner à nouveau. Il ya deux étapes à l'aide de ce système: le clonage et l'expression de la protéine d'intérêt comme une fusion SNAP-tag, et l'étiquetage de la fusion avec le substrat de SNAP-tag de choix. Le SNAP-tag est une petite protéine humaine basée sur O

Protocol

Placage cellules CHO-K1:

1. Ajouter 50 100 pi de cellules CHO-K1 qui ont été traitées à la trypsine selon des protocoles standard pour 6ml de complet F-12K.
2. Mélanger la suspension cellulaire par aspiration et refoulement plusieurs fois, puis aliquote de 300 ul de suspension cellulaire trypsinisées à chaque puits d'une chambre de stériles 8-Lab-Tek II lamelle couvre-objet Chambré avec # 1.5 borosilicate lamelle chambres (Nalgene Nunc Int;. Produit # 155409; Lot: 100808-8-0).
3. Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant la nuit.

Transfection transitoire de cellules CHO-K1 avec pSNAP-ADRB2 et pSNAP-H2B:

1. Vérifiez les chambres de culture de cellules ensemencées sur les jours précédents à chercher densité cellulaire et la santé.
2. Étiquetez le nombre approprié de tubes de microcentrifugeuse.
3. Dans une hotte à flux laminaire, mis en place des mélanges complexes de transfection selon le tableau de l'échantillon suivant, en utilisant soit 0,3 ug pSNAP-ADBR2 l'ADN plasmidique de contrôle ou 0,3 pg d'ADN de contrôle pSNAP-H2B plasmidique, 1 pl de D2 Transpass et 1 ul de Transpass V par réaction.

   plasmide	nombre de réactions	pl d'un milieu sans sérum	ul de D2 Transpass	pl d'Transpass V	ul d'ADN plasmidique	pl d'D2/reaction Transpass	pl d'Transpass V / réaction	ng d'ADN / réaction	L'ADN conc. (Ng / l)	ul d'ADN plasmidique / réaction
   SNAP-ADRB2	5	236,5	5	5	3.5	1	1	300	472,34	0.7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0.6
   Moquer	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Non transfectées	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. Tout d'abord, mélanger les sans sérum F-12K avec l'ADN plasmidique appropriée, puis ajouter le réactif de transfection Transpass D2, puis ajouter le Réactif de transfection Transpass V. Mélanger les composants bien par aspiration et refoulement en douceur à plusieurs reprises après l'addition de chaque réactif.
5. Incuber la réaction à température ambiante pendant 30 minutes.
6. Durant l'incubation, laver les cellules une fois avec 600 pi de DMEM complet et ajouter 450 ul de DMEM complet à chaque échantillon.
7. Ajouter 50 ul du mélange de transfection complexe pour chaque échantillon, lentement et de manière goutte à goutte.
8. Incuber les échantillons nuit à 37 ° C, 5% de CO _2.

SNAP-Cell Étiquetage Étoile TMR des cellules CHO-K1 transfectées transitoirement avec pSNAP-ADRB2 et pSNAP-H2B:

1. Retirer délicatement le support de transfection complexes à partir de chaque échantillon par aspiration sous vide. Laver les cellules deux fois avec 600 pi de terminer F-12K et de remplacer les médias dans chaque puits avec 600 pi de terminer F-12K.
2. Mix média étiquetage colorant en ajoutant 995 ul de complet F-12K et 51 ul 0,6 mM SNAP-Cell TMR-Star substrat. La concentration finale de SNAP-Cell TMR-Star doit être de 3mm. Pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger après l'ajout de substrat.
3. Retirez délicatement les milieux de croissance à partir d'échantillons et ajouter 200 ul de médias étiquetage colorant pour chaque puits. Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 30 minutes.
4. Alors que les échantillons sont en incubation, préparer Hoechst 33342 solution pour la coloration nucléaire d'échantillons en mélangeant 1 pl de Hoechst 33342, trichlorhydrate, trihydraté (10 mg / ml solution dans l'eau, 16,2 mM solution; sondes moléculaires Invitrogen) dans 10 ml d'achever F-12K .
5. Retirez le support de tous les échantillons et ajouter 600 ul de la solution diluée Hoechst pour chaque échantillon. Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 5 minutes.
6. Lavez échantillons trois fois avec 600 pi de terminer F-12K.
7. Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% de CO ₂ pour 30 minutes supplémentaires pour permettre fluorophore non constituée en société à diffuser à l'extérieur des cellules.
8. Après 30 minutes, le changement des médias sur les échantillons SNAP-Cell une dernière fois et procéder à l'imagerie.
9. Image des cellules en utilisant un Zeiss Axiovert 200M Apotome microscope à fluorescence.

Les résultats représentatifs

Figure 1. Voiciquelques résultats représentatifs de l'imagerie de fluorescence en utilisant la norme de la microscopie à fluorescence direct cellules COS-7 qui sont l'expression SNAP-tag fusions. Cette première image montre direct cellules COS-7 exprimant pSNAP-H2B (nucléaire histones) marqué avec SNAP-Cell TMR-Star. La construction pSNAP-H2B a été généré en utilisant l'pSNAP-tag (m) du vecteur. Les cellules ont été marquées avec SNAP-Cell TMR-Star pour 30 minutes et de contraste avec Hoechst 33342 (bleu) pour les noyaux. La fluorescence rose montre la superposition de la fluorescence rouge où protéine histone est présent dans plus de la fluorescence bleue indiquant le noyau. L'expression de la protéine H2B est clairement et facilement identifiables.

Les figures 2 et 3. Ces deux images suivantes montrent direct cellules COS-7 transfectées transitoirement avec pSNAP-ADRβ2.
Les cellules ont été marquées avec SNAP-Cell TMR-Star (rouge) et de contraste avec Hoechst 33342 (bleu). La construction pSNAP-ADRβ2 a été généré en utilisant l'pSNAP-tag (m) du vecteur. Les cellules ont été marquées avec SNAP-Cell TMR-Star pour 30 minutes et de contraste avec Hoechst 33342 (bleu) pour les noyaux. La fluorescence rouge indique la présence de protéines de surface cellulaire ADRB2 récepteurs tout en fluorescence bleue identifie le noyau.

Discussion

Il ya plusieurs variables qui affectent les résultats observés tels que l'intensité du laser se concentrer, capacités de l'équipement, l'objectif utilisé, etc photostabilité du fluorophore détermine la vitesse de la fluorescence doit être capturé avant de s'estomper.

Cette méthode de marquage des protéines est polyvalent et convient pour de nombreuses applications. Technologies de SNAP-tag et CLIP-tag pour le marquage spécifique de protéines de fusion avec des sondes synthétiques permettent divers aspects de la fonction des protéines, y compris une variété de processus dynamiques dans les cellules vivantes et dans les lysats cellulaires. SNAP-CLIP-MCP-et ACP-tag technologies offrent une polyvalence extraordinaire simplicité et à l'imagerie de protéines dans les cellules vivantes et fixes, et à l'étude des protéines in vitro. La création d'un seul gène de construire donne une protéine de fusion taggés capable de former une liaison covalente à une variété de groupes fonctionnels, y compris les fluorophores, biotine, ou des perles. La protéine d'intérêt doit être cloné et exprimé qu'une seule fois et ensuite la fusion peut être utilisé avec une variété de substrats fluorescents pour de nombreuses applications en aval tels que l'étiquetage de protéines simultanément à l'intérieur des cellules vivantes, la localisation des protéines et translocation, pulse-chase expériences, des études de l'internalisation du récepteur , sélectives étiquetage surface de la cellule, les protéines déroulant tests, la détection de protéines en SDS-PAGE, la cytométrie en flux à haut débit dans les dosages de liaison des plaques de microtitration, des expériences d'interaction biocapteur, et FRET basé dosages de liaison.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-K1 Cells	ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers	Nalge Nunc international	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)	Invitrogen	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid	New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid	New England Biolabs	N9179S	0010811