Summary
SNAP - 태그와 클립 태그 단백질 라벨링 시스템은 라이브 세포에 대한 관심의 단백질, 형광 염료를 포함하여 분자의 특정 공유 결합 첨부 파일을 활성화합니다. 일단 복제된과 표현, 태그 단백질 다시 복제하지 않고도 수많은 스트림 애플 리케이션을위한 기판의 다양한 사용할 수 있습니다.
Abstract
SNAP - 태그와 클립 태그 단백질 라벨링 시스템은 라이브 세포에 대한 관심의 단백질, 형광 염료를 포함하여 분자의 특정 공유 결합 첨부 파일을 활성화합니다. 이러한 시스템은 이미징 장비의 범위에 최적화된 형광 기판의 넓은 선택을 제공합니다. 일단 복제된과 표현, 태그 단백질 다시 복제하지 않고도 수많은 스트림 애플 리케이션을위한 기판의 다양한 사용할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하는 두 가지 단계가 있습니다 : SNAP - 태그 융합, 그리고 선택의 SNAP 태그 기판과 융합의 상표로 관심의 단백질의 복제, 그리고 표현. SNAP 태그 인간 O를 기반으로 작은 단백질이다
Protocol
CHO - K1 세포를 도금 :
- F - 12K 전체의 6ml 표준 프로토콜에 따라 trypsinized되었습니다 CHO - K1 세포의 50 100μl 추가합니다.
- 여러 번 아래 pipetting과에 의해 세포 현탁액을 혼합, # 1.5 borosilicate coverglass 실 (과 살균 8 실 랩 - 테크 II Chambered Coverglass 각 잘하는 trypsinized 세포 현탁액의 다음 나누어지는 300 μl Nalgene Nunc의 INT;. 제품 # 155409; 롯 : 100808-8-0).
- 37 ° C, 5 % CO 2 밤새에서 샘플을 품어.
pSNAP - ADRB2 및 pSNAP - H2B와 CHO - K1 세포의 과도 Transfection :
- 세포 밀도와 건강을 찾기 위해 전날에 씨앗을 품고 세포 배양 챔버를 확인합니다.
- microfuge 튜브의 해당 번호를 라벨.
- 층류 후드에서 transfection 복잡한 혼합물은 0.3 μg pSNAP - ADBR2 제어 플라스미드 DNA 또는 pSNAP - H2B 제어 플라스미드 DNA, TransPass의 D2 1 μl와 TransPass V 1 μl의 0.3 μg 중 하나를 사용하여 다음 예제 차트에 따라 설정 반응 당.
플라스미드 반응의 수를 혈청이없는 매체의 μl TransPass의 D2의 μl TransPass V의 μl 플라스미드 DNA의 μl TransPass의 D2/reaction의 μl TransPass V / μl 반응 DNA / 반응 NG DNA CONC. (μl / NG) 플라스미드 DNA / μl 반응 SNAP - ADRb2 5 236.5 5 5 3.5 1 1 300 472.34 0.7 H2B - SNAP 5 237 5 5 3 1 1 300 515.89 0.6 조롱하다 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 Untransfected 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 - 첫째, 적절한 플라스미드 DNA와 F - 12K 혈청 무료 후 TransPass V의 Transfection 시약을 추가 후, TransPass D2 Transfection 시약을 추가 섞는다. 각 시약의 추가 후 부드럽게 여러 번하고 아래로 pipetting으로 잘 구성 요소를 섞는다.
- 30 분 실온에서 반응을 품어.
- 부화하는 동안, 전체 DMEM 600 μl로 한 세포를 씻어 각 샘플을 완료 DMEM의 450 μl를 추가합니다.
- 천천히, 그리고 드롭 현명한 방식으로, 각 샘플에 transfection 복잡한 혼합물의 50 μl를 추가합니다.
- ° C 5 % CO 2 37 밤새 샘플을 품어.
Transiently pSNAP - ADRB2 및 pSNAP - H2B와 Transfected CHO - K1 세포의 SNAP - 셀 TMR 스타 라벨링 :
- 조심스럽게 진공 흡입하여 각 샘플에서 transfection 복잡한 미디어를 제거합니다. F - 12K 전체 600 μl로 두 번 세포를 씻고 F - 12K 전체 600 μl와 함께 각 잘 미디어를 교체하십시오.
- 전체 F - 12K 51 μl 0.6 MM SNAP 세포 TMR - 스타 기판의 995 μl를 추가하여 염료 라벨 미디어를 섞는다. SNAP - 셀 TMR - 스타의 최종 농도는 3mM해야합니다. 기판의 추가 후 혼합을 여러 번 위아래로 피펫.
- 조심스럽게 샘플에서 성장 미디어를 제거하고 각 잘하는 염료 라벨 용지 200 μl를 추가합니다. 37 샘플을 품어 ° C 5 % CO 30 분 2.
- 전체 F - 12K 10 ML에, 샘플 잠복기 있지만, Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (Invitrogen 분자 프로브 물 10 MG / ML 솔루션, 16.2 MM 솔루션) 1 μl를 혼합하여 시료의 핵 얼룩에 대한 Hoechst 33342 용액을 준비 .
- 모든 샘플에서 미디어를 제거하고 각 샘플에 희석 Hoechst 솔루션 600 μl를 추가합니다. 37 샘플을 품어 ° C, 5 % 5 분 동안 CO 2.
- F - 12K 전체 600 μl와 샘플을 세 번 씻으십시오.
- 37 샘플을 품어 ° C 5 % 비법인 형광단이 세포 밖으로 확산 수 있도록 추가 30 분 CO 2.
- 30 분 후에, SNAP 세포 샘플을 마지막으로 한 시간에 미디어를 변경하고 이미지로 넘어갑니다.
- 자이스 혈구 Apotome Axiovert 200M 형광 현미경을 사용하여 이미지 세포.
대표 결과
그림 1. 왔지SNAP - 태그 fusions을 표현 아르 라이브 COS - 7 세포의 형광 현미경 표준을 사용하는 형광 이미징의 일부 대표적인 결과입니다. 첫 번째 이미지는 SNAP 세포 TMR - 등급으로 표시 pSNAP - H2B을 (히스톤 핵) 표현 라이브 COS - 7 세포를 보여줍니다. pSNAP - H2B 건설은 pSNAP 태그 (M) 벡터를 사용하여 생성되었습니다. 세포는 30 분 SNAP - 셀 TMR - 스타로 표시하고 핵에 대한 Hoechst 33342 (파란색)과 counterstained되었습니다. 핑크 형광는 히스톤 단백질이 핵을 나타내는 파란색의 형광 이외에 존재하는 적색 형광의 오버레이를 보여줍니다. H2B 단백질의 표현이 명확하고 쉽게 식별됩니다.
그림 2와 3.이 다음 두 이미지는 transiently pSNAP - ADRβ2와 transfected 라이브 COS - 7 세포를 보여줍니다.
전지는 SNAP 세포 TMR - 스타 (적색)으로 표시하고 Hoechst 33342 (파란색)과 counterstained되었습니다. pSNAP - ADRβ2 건설은 pSNAP 태그 (M) 벡터를 사용하여 생성되었습니다. 세포는 30 분 SNAP - 셀 TMR - 스타로 표시하고 핵에 대한 Hoechst 33342 (파란색)과 counterstained되었습니다. 파란 형광이 핵을 식별하는 동안 빨간색 형광은 세포 표면 수용체 단백질 ADRB2의 존재를 나타냅니다.
Discussion
형광단의 photostability은 퇴색하기 전에 캡처해야합니다 얼마나 빨리 형광 결정 등 초점, 레이저 강도, 장비 기능, 렌즈 사용 등 관찰 결과에 영향을 미치는 여러 변수가 있습니다.
단백질 라벨의이 방법은 다양한 여러 애플 리케이션에 적합합니다. 합성 프로브와 함께 융합 단백질의 특정 상표에 대한 SNAP - 태그와 클립 태그 기술은 라이브 세포에서 세포 lysates의 역동적인 프로세스를 포함하여 다양한 단백질 기능의 다양한 측면을 활성화하십시오. SNAP -, 클립, MCP 및 ACP 태그 기술이 생활하고 고정된 세포에 단백질의 이미지와 체외에서 단백질 연구에 단순하고 특별한 다기능을 제공합니다. 하나의 유전자 구조의 생성은 fluorophores, 비오틴, 또는 구슬을 포함하여 기능 그룹의 다양한 공유 결합 결합을 형성 수있는 태그 융합 단백질을 산출. 관심의 단백질은 복제 및 표현 한 번만 후 융합이 같은 라이브 셀 내부에 동시 단백질 라벨, 단백질 현지화 및 translocation, 펄스 - 체이스 실험, 수용체의 국제화 연구 등 다양한 스트림 애플 리케이션을위한 형광 기판의 다양한 사용할 수 있어야합니다 , 선택적 세포 표면 라벨, 단백질은 assays, SDS - PAGE, 유동세포계측법, microtiter 접시, 바이오 센서 상호 작용 실험에서 높은 처리량 바인딩 assays의 단백질 감지, 그리고 걱정 기반 바인딩 assays를 가져옵니다.
Disclosures
저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산하는 뉴 잉글랜드 Biolabs 고용하고 있습니다.
Acknowledgments
카이 Johnsson
이반 코레아
안드레아스 브레히트
카트린 Müentener
크리스 노렌
루오 일
밍 쑤
테오도르 데이비스
살바토레 Russello
Aihua 장
잉카 가쉬
엘리사 Maunus
니콜라스 라바흐뜨
제임스 맥팔랜드
존 버스웰
브렌다 데즈먼드
제임스 엘라드
돈 빗
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | |
| Serum free F-12K | |||
| Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalge Nunc international | 155409 | Lot: 100808-8-0 |
| DMEM | |||
| H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen | H3570 | 470519 |
| Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 |
| Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 |
| SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 |
| pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 |
| pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |
References
- Johnsson, K. Visualizing biochemical activities in living cells. Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).
- Johnsson, K. SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function. NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).
