SNAP-tag und CLIP-tag Proteinmarkierung Systeme ermöglichen die spezifische, kovalente Bindung von Molekülen, einschließlich Fluoreszenzfarbstoffe, um ein Protein von Interesse in lebenden Zellen. Einmal kloniert und exprimiert, kann die markierte Protein mit einer Vielzahl von Substraten für zahlreiche nachgelagerte Anwendungen, ohne sich erneut Klon verwendet werden.
SNAP-tag und CLIP-tag Proteinmarkierung Systeme ermöglichen die spezifische, kovalente Bindung von Molekülen, einschließlich Fluoreszenzfarbstoffe, um ein Protein von Interesse in lebenden Zellen. Diese Systeme bieten eine breite Auswahl an fluoreszierende Substrate für eine Reihe von Imaging-Instrumenten optimiert. Einmal kloniert und exprimiert, kann die markierte Protein mit einer Vielzahl von Substraten für zahlreiche nachgelagerte Anwendungen, ohne sich erneut Klon verwendet werden. Es gibt zwei Schritte, um mit diesem System: Klonierung und Expression des Proteins von Interesse als SNAP-tag-Fusion, und die Kennzeichnung der Fusion mit der SNAP-tag Substrat der Wahl. Die SNAP-tag ist ein kleines Protein auf die menschliche O Basis<sup> 6</sup>-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (hAGT), ein DNA-Reparatur-Protein. SNAP-tag-Etiketten sind Farbstoffe konjugiert Guanin oder Chlorpyrimidin Abgangsgruppen über eine Benzyl-Linker. Bei der Kennzeichnung Reaktion wird das substituierte Benzylgruppe des Substrates kovalent an die SNAP-tag befestigt. CLIP-tag ist eine modifizierte Version des SNAP-tag, entwickelt, um mit benzylcytosine anstatt Benzylguanin Derivaten reagieren. In Verbindung mit SNAP-tag verwendet, ermöglicht CLIP-tag der orthogonalen und komplementären Kennzeichnung von zwei Proteine gleichzeitig in den gleichen Zellen.
Es gibt mehrere Variablen, die die beobachteten Ergebnisse wie Fokus, Laserintensität, Geräte-Funktionen, verwendeten Objektiv, etc. Die Photostabilität des Fluorophors bestimmt, wie schnell die Fluoreszenz müssen, bevor sie verblassen erfasst werden.
Diese Methode der Protein-Kennzeichnung ist vielseitig und für viele Anwendungen geeignet. SNAP-tag und CLIP-tag-Technologien für die spezifische Markierung von Fusionsproteinen mit synthetischen Sonden ermöglichen die verschiedenen Aspekte der Funktion von Proteinen, einschließlich einer Vielzahl von dynamischen Prozessen in lebenden Zellen und in Zelllysaten. SNAP-, CLIP-, MCP-und AKP-tag-Technologien bieten Einfachheit und außergewöhnliche Vielseitigkeit für die Bildgebung von Proteinen in lebenden und fixierten Zellen und die Untersuchung von Proteinen in vitro. Die Schaffung eines einheitlichen Genkonstrukt ergibt eine getaggt Fusionsprotein in der Lage, eine kovalente Verknüpfung mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, einschließlich der Fluorophore, Biotin oder Perlen. Das Protein von Interesse sind kloniert und nur einmal und dann die Fusion kann mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Substrate für zahlreiche Downstream-Anwendungen wie zB die gleichzeitige Proteinmarkierung in lebenden Zellen, Protein-Lokalisation und Translokation, Puls-Chase-Experimente, Rezeptor-Internalisierung Studien verwendet werden , selektive Zelloberfläche Kennzeichnung, Protein-Pull-Down-Assays, Protein-Nachweis in SDS-PAGE, Durchflusszytometrie, High-Throughput-Bindungs-Assays in Mikrotiterplatten, Biosensor-Interaktion Experimente und FRET-basierten Bindungsassays.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | ||
Serum free F-12K | ||||
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalgene Nunc Int. | 155409 | Lot: 100808-8-0 | |
DMEM | ||||
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen Molecular Probes | H3570 | 470519 | |
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Zeiss | |||
Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 | |
Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 | |
SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 | |
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 | |
pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |