Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

Summary

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen.

Abstract

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Deze systemen bieden een brede selectie van fluorescerende substraten geoptimaliseerd voor een reeks van imaging instrumentatie. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen. Er zijn twee stappen voor het gebruik van dit systeem: klonering en expressie van het eiwit van belang als een SNAP-tag fusion, en de etikettering van de fusie met de SNAP-tag substraat van keuze. De SNAP-tag is een klein eiwit gebaseerd op menselijke O

Protocol

Plating CHO-K1 cellen:

1. Voeg 50-100μl van de CHO-K1 cellen die zijn getrypsiniseerd volgens standaard protocollen om 6 ml van complete F-12K.
2. Meng celsuspensie door en neer te pipetteren meerdere malen, dan aliquot 300 ul van getrypsiniseerd celsuspensie aan elke well van een steriele kamer 8-Lab-Tek II Chambered dekglaasje met # 1.5 borosilicaat dekglaasje kamers (Nalgene Nunc Int;. Product # 155409; Lot: 100808-8-0).
3. Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO ₂ 's nachts.

Voorbijgaande Transfectie van CHO-K1 cellen met pSNAP-ADRB2 en pSNAP-H2B:

1. Controleer of de celkweek kamers gezaaid op de vorige dag om te zoeken naar celdichtheid en gezondheid.
2. Etiket het juiste aantal microcentrifuge buizen.
3. In een laminaire stroming kap, opgericht transfectie complexe mengsels op basis van het volgende voorbeeld grafiek, met behulp van 0,3 microgram pSNAP-ADBR2 controle plasmide DNA of 0,3 ug van pSNAP-H2B controle plasmide DNA, 1 ui Transpass D2 en 1 pi Transpass V per reactie.

   plasmide	aantal reacties	il serum-vrij medium	pi Transpass D2	pi Transpass V	ul plasmide DNA	pi Transpass D2/reaction	ul van Transpass V / reactie	ng van DNA / reactie	DNA-conc. (Ng / ul)	il van plasmide DNA / reactie
   SNAP-ADRb2	5	236,5	5	5	3.5	1	1	300	472,34	0.7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0.6
   Bespotten	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Ongetransfecteerde	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. De eerste, mix het serum vrij F-12K met de juiste plasmide DNA, dan is vervolgens de Transpass D2 transfectiereagens toe te voegen, voeg de Transpass V transfectiereagens. Meng de componenten door en neer te pipetteren voorzichtig in enkele keren na de toevoeging van elk reagens.
5. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
6. Tijdens de incubatie, een keer wassen cellen met 600 pi DMEM compleet en voeg 450 ul van de volledige DMEM aan elk monster.
7. Voeg 50 ul van de transfectie complex mengsel aan elk monster, langzaam en in een drop-wijs mode.
8. Incubeer de monsters overnacht bij 37 ° C, 5% CO _2.

SNAP-Cell TMR Star Labeling van CHO-K1 cellen transient getransfecteerd met pSNAP-ADRB2 en pSNAP-H2B:

1. Verwijder voorzichtig de transfectie complexe media van elk monster door afzuiging. Twee keer wassen cellen met 600 pi van volledige F-12K en vervang media in elk putje met 600 ul van complete F-12K.
2. Mix kleurstof etikettering media door het toevoegen van 995 ul van complete F-12K en 51 ul 0,6 mM SNAP-Cell TMR-Star substraat. De uiteindelijke concentratie van SNAP-Cell TMR-Star moet worden 3mm. Pipet op en neer een paar keer te mengen na de toevoeging van substraat.
3. Verwijder voorzichtig de groei van de media-monsters en voeg 200 ul van kleurstof etikettering media aan elke well. Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO ₂ gedurende 30 minuten.
4. Terwijl de monsters te incuberen, te bereiden Hoechst 33342 oplossing voor het nucleaire kleuring van de monsters door het mengen van 1 pi van Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydraat (10 mg / ml, oplossing in water, 16,2 mM oplossing; Invitrogen Molecular Probes) in 10 ml van de volledige F-12K .
5. Verwijder de media van alle monsters en voeg 600 ul van de verdunde Hoechst oplossing voor elk monster. Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO ₂ gedurende 5 minuten.
6. Was monsters drie keer met 600 ul van complete F-12K.
7. Incubeer de monsters bij 37 ° C, 5% CO ₂ voor een extra 30 minuten om zonder rechtspersoonlijkheid fluorofoor uit diffuse van de cellen.
8. Na 30 minuten de media op het SNAP-Cell monsters nog een laatste keer en ga door naar beeldvorming.
9. Het imago van de cellen met behulp van een Zeiss apotome Axiovert 200M fluorescentie microscoop.

Representatieve resultaten

Figuur 1. Hier zijnenkele representatieve resultaten van het fluorescerende beeldvorming met behulp van standaard fluorescentie microscopie van levende COS-7 cellen die uiten SNAP-tag fusies. Deze eerste afbeelding toont live-COS-7 cellen die pSNAP-H2B (nucleaire histone) gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star. De pSNAP-H2B construct werd gegenereerd met behulp van de pSNAP-tag (m) vector. De cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star gedurende 30 minuten en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw) voor de kernen. De roze fluorescentie toont de overlay van de rode fluorescentie waar histon-eiwit aanwezig is in aanvulling op de blauwe fluorescentie onder vermelding van de kern. De expressie van het eiwit H2B is duidelijk en gemakkelijk te herkennen.

Figuren 2 en 3. Deze volgende twee afbeeldingen laten wonen COS-7 cellen transient getransfecteerd met pSNAP-ADRβ2.
Cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star (rood) en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw). De pSNAP-ADRβ2 construct werd gegenereerd met behulp van de pSNAP-tag (m) vector. De cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star gedurende 30 minuten en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw) voor de kernen. De rode fluorescentie duidt op de aanwezigheid van het celoppervlak receptor-eiwit ADRB2 terwijl blauw fluorescentie identificeert de kern.

Discussion

Er zijn een aantal variabelen die de waargenomen resultaten, zoals scherpstelling, laser intensiteit, de uitrusting mogelijkheden, lens gebruikt, enz. De fotostabiliteit van de fluorofoor bepaalt hoe snel de fluorescentie moet worden vastgelegd voordat vervagen.

Deze methode van eiwit labeling is veelzijdig en geschikt voor vele toepassingen. SNAP-tag en CLIP-tag technologieën voor de specifieke etikettering van fusie-eiwitten met synthetische probes in staat stellen de verschillende aspecten van eiwitten functie, zoals een verscheidenheid aan dynamische processen in levende cellen en in cellysaten. SNAP-, clip-, MCP-en de ACS-tag technologieën bieden eenvoud en buitengewone veelzijdigheid aan de beeldvorming van eiwitten in levende cellen en vaste en de studie van eiwitten in vitro. De oprichting van een enkel gen te bouwen levert een gecodeerde fusie-eiwit in staat is de vorming van een covalente binding aan een verscheidenheid van functionele groepen, waaronder fluoroforen, biotine, of kralen. Het eiwit van de rente moet worden gekloond en uitgedrukt slechts een keer en dan is de fusie kan worden gebruikt met een verscheidenheid van fluorescerende substraten voor tal van stroomafwaartse toepassingen zoals gelijktijdige eiwit-etiket aan de binnenzijde levende cellen, eiwit lokalisatie en translocatie, pulse-chase experimenten, receptor internalisatie studies , selectieve celoppervlak etikettering, eiwit pull-down assays, eiwit detectie in SDS-PAGE, flowcytometrie, high-throughput bindingsassays in microtiterplaten, biosensor interactie experimenten en FRET-gebaseerde binding assays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-K1 Cells	ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers	Nalge Nunc international	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)	Invitrogen	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid	New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid	New England Biolabs	N9179S	0010811