Summary
동물 모자 overexpressing 유전자 제품 (들)은 개발의 측면에 이식 아르
Abstract
많은 단백질은 배아 발달의 이중 역할을한다. 특정 조직의 세포 운명 결정을 규제 이들은 또한 배아의 큰 지역의 발전에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 분석하기 어려운 특정 조직에서의 역할을 정의합니다. 예를 들어,
Protocol
부 I.는 ACT 분석을위한 셋업
- 클로로포름 정화 방법 (; 응용 Biosystems / 앰비온, 오스틴, TX 예 mMessage mMachine 키트) : 자신의 페놀을 사용하는 것과 제조 업체에 의해 제안 주사 뒤덮인 RNA를 생성합니다. 형광 단백질을 인코딩 RNA는 추적으로 사용됩니다. 우리도 노란색 형광 단백질 (YFP) 또는 pCS2 + 발현 벡터에 cDNA mCherry 5, 고쳐 쓰다.
- micropipette의 풀러를 사용하는 테이퍼 유리 도움말을 형성 borosilicate 유리 모세관 튜브를 당겨. 우리는 서터 Micropipette 풀러, P - 97 (셔터 인 스트 루먼트 주식 회사, 노바토, CA)를 사용하는 등 이전에 6 설명했다.
- KCl 20 MM,, 20 MM CaCl 2; 50 MM의 HEPES, 1 M NaCl, 산도 7.5 조정, autoclaved과에 저장된 10 X 마크의 수정 링거스 (MMR) 솔루션 주식 (10 MM MgCl 2 표 1에서 살균 솔루션을 확인하십시오 RT).
- 남자 개구리에서 testes 격리하고 1X MMR / gentamicin (50 μg / ML의 gentamicin 황산, BioWhittaker, 고양이 # 17 518Z)의 무균 용액 4 ° C에서 조직을 저장합니다. 이것은 실험 시작하기 전에 주일까지 할 수 있지만 시간이 지남에 따라 그 효능을 looses 그것입니다.
- 에그 부설 솔루션은 (1X : 150 MM NaCl, 2.62 MM KCl, 0.8 MM 나 2 HPO 4, 20 MM Trizma 기지, 2.62 MM NaHCO 3 2.75 MM MgSO 4; 산도 7.6로 조정), 8X 주식으로 만들 수있는 4 저장할 수 있습니다 ° C 최대 2 주가에 대한 참고 사항 :.이 솔루션에서 오염에 대한 조심,이 계란의 품질에 영향을 미치지 않습니다.
- 사출 접시를 생성합니다. 이렇게하려면 부드럽게 거품을 방지하고 약 식지하는 솔루션의 상단에 엘라스토머 금형 (그림 1)을 풀다, 60mm의 플레이트에 ~ 6 ML 녹아 아가로 오스 솔루션을 추가, 전자 레인지에 0.4X MMR에 1퍼센트 아가로 오스를 용융 RT 20 분. 필요한 번호를 확인하려면, 실험 조건의 수를 고려 (예 : 1, YFP, 2, YFP + 노긴) 및 이식 호스트 태아의 숫자가 필요합니다. 실험을 위해, 우리는 각각의 실험 조건에 대해 최소한 20 이식 호스트 배아를 생성합니다. 18-19 ° C에서, 배아는 약 한시간 단계 15 것입니다. 그것은 20 이식을 수행하기 위해 한 시간을 소요하는 경우가 두 수정 시간 지점은 호스트 배아 모든 이식을 받아 가정, 필요합니다. 따라서, 넷 사출 요리 (2 EXP 조건 X 2 수정 시간 포인트 = 4)가 필요합니다. 최대 일주일 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
- 사출 접시 등 금형과 1퍼센트 아가로 오스 + 0.7X MMR을 사용하여 절연 캡 플레이트를 생성합니다. 사출 번호판 더하기 하나 추가마다 수정의 시점 (4 + 2 수정 시간 점 = 6)로 절연 캡 같은 번호를 확인합니다.
- microinjection 전날에 하루 늦게 인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 500 단위와 여성을 주사. 16-18 ° C 하룻밤에 저장 여자.
부 II. Xenopus laevis의 태아의 RNA의 Microinjection
microinjection에 대한 A. 준비
- hormonally 유도 여자를 제거하고 1X 계란 누워 솔루션 (ELS) 참고를 포함하는 각각의 탱크에서 그들을 장소 :. 우리는 계란의 품질이 감소로 ELS에 2 시간 이상 있었 계란을 사용하지 마십시오. 단 갓 알을 낳고가 수집되도록 따라서, 시간에 대한 체외의 수정에 전에, 우리는 수조의 모든 계란을 폐기합니다.
- 25-35 μm의 직경을 얻을 수있는 팁을을 snipping하여 microinjection을 위해 바늘을 준비합니다. picoinjector에 바늘을 놓고 그것이 사출 당 10 NL을 dispenses 수 있도록 그것을 보정.
- 14 ° C.에 배양기를 설정
- 일단 여성이 한 시간, 전송 피펫을 사용하여 탱크에서 계란을 제거하고 60mm 페트리 요리에 넣어 달걀을 마련했습니다. 가능한 계란에서 많은 ELS로 제거하고 1X MMR로 바꿉니다. 계란은 바로 수정된거나 시간을위한 1X MMR에 머물 수 있습니다. 장기 이식 분석을 위해, 그것은 주위 오전 11시, 오후 1시 별도의 세 가지 배치까지에 계란의 단일 층의 80 %가 꽉 들어찬 두개의 요리를 비옥하는 것이 좋습니다. 주입 후, 14에 배치됩니다 ° C 그래서 그들은 캡 절연 (무대 8.5-9)과 이식에 원하는 단계로 성장할 것으로 (단계 15; 위의 I, # 6 부 참조).
- testes의 품질을 확인하기 위해, 우리는 처음부터 정자가 가능한되지 않을 경우 우리는 다른 남자의 testes를 추출할 수있는 이른 아침에 수정을 (~ 8 AM), 수행합니다. 참고 : 1 ML 1X MMR에서 ~ 0.25 testes를 균질하고 oocytes의 플레이트 당 약 5-7 방울을 추가합니다.
- 체외에서 균질 testes와 달걀을 비옥하게하고, 한 시간 후, 드 젤리 솔루션을 사용하여 달걀에서 젤리 코트를 제거 (164μl 1M DTT + 10mL 1M 트리스, 최대 50 ML autoclaved nanopure 물로 산도 8.8). 그들은 18에서 2 시간 정도 소요 정렬을 시작하는 두 세포 단계에 도달할 때까지 기다려 실내 온도 (22 ° C)에서 ° C 1.5 시간.
- transf를 사용어 피펫, 정렬 균일하게 색소와 고르게 나누어 배아가 같은 0.4X MMR + 6 % Ficoll 가득 사출 접시의 우물에, 그림 3의 왼쪽 동물 모자에 표시됩니다.
B.의 Microinjection
- 60mm 페트리 접시 뚜껑의 맨 위에 Parafilm를 스트레치. 당신의 주사 바늘을 채우기 위해 PLI - 100를 사용하여 Parafilm 및 대기음에 처음으로 RNA 샘플의 피펫 2 μl. 바늘 아직도 주사를 시작하기 전에 샘플 10 NL을 분배 있는지 확인하시기 바랍니다.
- 다른 접시 7 500 PG YFP 한 접시에 RNA와 관심의 유전자 (예 : 20 PG 노긴 RNA) 플러스 YFP RNA와 함께 20-30 두 세포 단계 배아 (모두 blastomeres) 주사.
- Ficoll 용액 다른 사출 접시의 시점마다 장소 100-200 아닌 주입된 배아. 주입된 배아 동시에 보육의 그들을 밖으로 이동. 이러한 파트 IV에 사용할 수있는 호스트입니다.
- 주사 후 14 ° C 하룻밤에 모든 배아를 품어. 모든 시간 지점 반복합니다.
부 III. 주입 배아에서 동물 모자를 분리
- 배아 단계로 이른 아침에 도착. 최초의 시점은 9 단계에서해야합니다. 생존하지 않은 사람을 제거합니다. 배치의 각 시점 작업 다음 단계를 진행합니다.
- 각 접시에서 Ficoll 용액을 붓고 다시 0.7X MMR / gentamicin 솔루션을 추가합니다. 캡 분리 요리하려면, 0.7X MMR / gentamicin 솔루션의 관대한 금액을 추가합니다. 신선한 캡 고립 접시에 전송 피펫과 장소를 사용하여 사출 접시의 우물에서 배아를 이동시키다.
- 준비를위한 2 또는 3 그대로 배아를 유지, 0.7X MMR + gentamicin 솔루션에서 동물 모자를 분리. 노란 팁 400 μm의로 구부러진, 또는 날카로운 넘버 5 포셉 한 쌍의가 장착되어 Gastromaster 역시 사용할 수 있습니다.
- 다음날까지 14 ° C 배양기에 다시 뚜껑을 넣어. 호스트 배아가 기증자의 조직과 같은 발달 단계에서 그들을 유지하는 뚜껑과 같은 시간에 인큐베이터에서 제거되어야합니다.
부 IV. 측면에 모자의 이식
- 14 ° C 배양기에서 처음 지점에서 뚜껑과 배아를 제거하고 배아를 무대. 추적 주입 (그림 2)에 따라 균일한 노란색이나 빨간색 형광 - 긍정적인 모자에 대한 정렬.
- 모자의 개수를 카운트하고 0.7X MMR / gentamicin 솔루션 신선한 사출 접시에 단계의 수를 12-13 배아를 두 번 제거합니다. 날카로운 # 5 포셉로 각 vitelline 멤브레인를 제거합니다. 뚜껑과 접시로 전송하지만, 조심 해요. 자신의 vitelline의 점막없이 배아 신속하게 물의 표면에서 떼어 놓다 수 있습니다.
- gastromaster (노란색 팁 200 - 250μm 벤트 와이어, 최고의 설정) 또는 # 5 포셉를 사용하여 스테이지 14-15 (그림 3)에서 배 (胚)의 측면에 사각형 200 μm의를 제거합니다. 그렇다면 반으로 잘라 모자 (gastromaster 또는 # 5 포셉)와 호스트 배아에서 만든 구멍에 조직을 놓으십시오. 치유를 허용하도록 잘 대해 배아를 회전합니다. 그들이 단계 15있는 동안 당신이 할 수 많은 배아 동안이 작업을 수행합니다. 모든 시간 지점 반복합니다.
- 배아는 보통 30 분 이내에 치유됩니다. # 5 포셉과 부드러운 모션 솔질과 죽은 세포 (흰색)을 제거합니다. 18 ° C 야간에 그들을 성장.
- 해부 형광 현미경으로, 찬란 - 라벨, 이식 조직과 정렬 배아. 18 그들을 돌려 놔 ° C 단계가 42-43까지 성장합니다.
- tricaine에있는 동물을 마취. 이 시점에서, 당신은 형광 해부 현미경으로 사진을 찍을 수 있습니다. 작업이 완료되면, 섹션을 수정하고 관심을 귀하의 조직에 대한 마커를 사용하여 현장 하이브리드화에 immunostain 또는 수행합니다.
그림 1. 배아 들고 요리를 만드는 데 사용되는 엘라스토머 금형 주조에 대한 플렉시 글라스의 디자인. 38 X 38mm 둥근 모서리의 사각형은 (~ 5mm 깊이) 50 X 50mm의 광장과 두께 25mm는 플렉시 글라스의 조각 밖으로 전달되었습니다. 원형, 균등하게 게재 우물 (1.5 mm 직경)은 플라스틱으로 깊이 1mm을 뚫고있다. microinjection 요리에 대한 엘라스토머 금형을 위해, 우리는 제조 업체의 지침에 따라, 플렉시 글라스에 Sylgard 탄성체를 부은하고 응고 수있었습니다. 이 엘라스토머 사출 금형이와 뚜껑의 절연 판을하는 데 사용됩니다.
그림 2. 표현이 다를 수로 이식하기 전에 정렬 동물 모자는 것이 중요합니다. 오른쪽에있는 explant이 드문드문 표현을 보유하고 삭제되지만 왼쪽에있는 동물 모자가 조직 전반에 걸쳐 고르게 mCherry 표현합니다.
그림 3. 호스트 tadpOLE는 이식 동물 캡 세포로부터 측면에 눈 같은 구조를 개발했습니다. 형광 이미지가 브라이트 이미지에 overlayed되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 동물 캡 이식 분석을 만들 재배열 Xenopus의 생물학 자에 의해 사용 고전 기법, 우리의 버전을 증명하고있다. 상온에서, Xenopus의 배아는 단계 9 15 매우 신속하게 개발할 수 있습니다. 14에 그들을 배치함으로써 ° C, 배아의 발달 속도가 느려졌되고 더 많은 이식 한 실험에서 수행할 수 있습니다. 이 세 단계 (> 43분의 42)에 배아를 성장하기 위해 필요한 경우, 우리는 나이 tadpoles에서 주입된 형광 단백질 신호 페이드 때문에, 유전자 변형 비너스 YFP 동물을 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 EFTFs 또는 노긴은 눈 같은 조직 형태 지정을 표현하는 것을 동물 모자 조직을 수립하는 분석를 사용합니다. 이 분석은 관심의 유전자가 (S) 특정 세포의 운명을 결정하는 필요 여부를 설정하는 간단한 테스트로 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 실명 (경력 개발 MEZ 및 ASV로 수상 및 안과의학과에 제한 부여), E. 마틸다 지글러 재단 (MEZ 및 ASV)와 국립 안과 연구소 / NIH (MEZ 방지 연구의 교부금에 의해 지원되었다 , 보조금 R01EY015748 및 R01EY017964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| human chorionic gonadotropin | Intervet Inc. | 22219 | |
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Transfer pipette | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Dumostar #5 Forceps | Fisher Scientific | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
