Summary
Animaux bouchons surexprimant le produit du gène (s) sont transplantées dans le flanc de développement
Abstract
De nombreuses protéines jouent un double rôle dans le développement embryonnaire. Celles qui régissent la détermination du destin cellulaire dans un tissu spécifique peut également affecter le développement d'une grande région de l'embryon. Cela rend la définition de son rôle dans un tissu particulier difficile à analyser. Par exemple,
Protocol
Partie I. Mise en place pour le test ACT
- Générer ARN coiffé d'injection tel que suggéré par le fabricant, en utilisant leur phénol: chloroforme méthode de purification (par exemple mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). ARN codant pour une protéine fluorescente est utilisée comme traceur. On supporte transcrire protéine fluorescente jaune (YFP) ou mCherry 5 ADNc, qui est dans un vecteur d'expression pCS2 +.
- Tirez tubes en verre borosilicate capillaires pour former conseils verre conique à l'aide d'un extracteur micropipette. Nous utilisons Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), comme décrit précédemment 6.
- Assurez solutions stériles dans le tableau 1 à partir d'un 10 X Marc jour Ringer (ROR) solution mère (10 mM de MgCl2, 20 mM de KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM d'HEPES, 1 M de NaCl, ajusté à pH 7,5, autoclave et stockés à RT).
- Isoler les testicules d'un homme grenouille et le tissu stocker à 4 ° C dans une solution stérile de1X MMR / gentamicine (50 pg / ml de sulfate de gentamicine; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Cela peut se faire jusqu'à une semaine avant le début de l'expérience, mais il est perd de son efficacité au fil du temps.
- Solution de ponte (1X: 150 mM de NaCl, 2,62 mM de KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma de base, 2,62 mM NaHCO 3 et 2,75 mM MgSO 4, ajusté à pH 7,6) peut être faite comme un stock 8X, qui peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Remarque: attention à la contamination dans cette solution, car cela aura une incidence sur la qualité de vos oeufs.
- Générer des plaques d'injection. Pour ce faire, faire fondre 1% d'agarose dans ROR 0.4x dans un micro-ondes, ajouter ~ 6 ml solution fondue agarose en 60 plaques mm, doucement dérouler un moule en élastomère (figure 1) au-dessus de la solution pour éviter les bulles et laisser refroidir pendant environ 20 minutes à température ambiante. Pour déterminer le nombre nécessaire, considérez le nombre de conditions expérimentales (par exemple 1, YFP, 2, YFP + Noggin) et le nombre de embry hôte transplanté OS besoin. Pour nos expériences, nous générons au moins 20 embryons transplantés d'accueil pour chaque condition expérimentale. À 18-19 ° C, les embryons seront à l'étape 15 pendant environ une heure. Si cela prend une heure pour effectuer 20 greffes, puis deux points dans le temps de fertilisation sont nécessaires, en supposant que les embryons hôtes acceptent toutes les greffes. Par conséquent, quatre plats d'injection sera nécessaire (2 conditions exp x 2 points dans le temps de fécondation = 4). Stocker les plaques à 4 ° C pendant une semaine.
- Générer des plaques d'isolation en utilisant capitalisation agarose à 1% + 0,7 X MMR avec des moules que pour la plaque d'injection. Faire le même nombre de plaques d'isolation bouchon en plus une injection supplémentaire de points par unité de temps la fécondation (4 + 2 points dans le temps de fécondation = 6).
- Injecter femelles avec 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine en fin de journée la veille de la micro-injection. Boutique femelles à 16-18 ° C pendant la nuit.
Partie II. La micro-injection d'ARN d'embryons de Xenopus laevis
étape "> A. Préparation de la micro-injection- Retirer des femmes hormonale induite et les placer dans des réservoirs individuels contenant 1X ponte solution (ELS). Remarque: nous n'utilisons pas les œufs qui ont été dans les ELS plus de deux heures que la qualité des œufs est réduite. Par conséquent, environ une heure avant la fécondation in vitro, nous supprimons tous les œufs dans le bac afin que les œufs fraîchement pondus ne sont collectées.
- Préparer l'aiguille pour la microinjection en coupant la pointe pour obtenir un diamètre de 25 à 35 um. Placer l'aiguille sur le picoinjector et l'étalonner de sorte qu'il distribue 10 nl par injection.
- Définir un incubateur à 14 ° C.
- Une fois que les femelles ont pondu pendant environ une heure, retirer les œufs dans le bac à l'aide d'une pipette de transfert et les placer dans des boîtes de 60 mm de Pétri. Enlever le ELS bien des œufs que possible et remplacer par 1X ROR. Les œufs peuvent être fécondés tout de suite ou rester dans ROR 1X pour jusqu'à une heure. Pour le dosage de transplantation, il estmieux pour fertiliser deux plats, 80% complets d'une seule couche d'œufs dans un maximum de trois lots distincts vers 11 h, midi et 13 heures. Après l'injection, ils seront placés à 14 ° C afin qu'ils atteignent les étapes souhaitées pour l'isolement du bouchon (stade 8,5 à 9) et de la transplantation (étape 15; voir Partie I, n ° 6 ci-dessus).
- Pour vérifier la qualité des testicules, nous procédons à une fertilisation tôt le matin (~ 8 heures), ce qui nous permet d'extraire les testicules d'un autre mâle si le sperme du premier n'est pas viable. Note: nous homogénéiser ~ 0,25 testicules dans 1 ml MMR 1X et ajouter environ 5 à 7 gouttes par plaque d'ovocytes.
- In vitro, la fécondation des oeufs avec des testicules homogénéisés et, une heure plus tard, enlever la couche de gelée sur les oeufs à l'aide de la gelée de solution (1M 164μl TNT + 10 ml de Tris 1M, pH 8,8 à 50 ml d'eau nanopure à l'autoclave). Attendez jusqu'à ce qu'ils atteignent deux cellules étape pour commencer le tri, ce qui prend environ 2 heures à 18 ° C ou 1,5 heures à température ambiante (22 ° C).
- L'utilisation d'un transfoer pipette, en quelque sorte uniformément pigmentés et uniformément divisant embryons, comme indiqué dans le chapeau animale gauche de la figure 3, dans le puits d'injection d'un plat rempli de 0.4x ROR + 6% de Ficoll.
Microinjection B.
- Étirer Parafilm sur le dessus du couvercle d'une boîte de Petri de 60 mm. Prélever 2 l de votre échantillon d'ARN d'abord sur le Parafilm et aspirer l'aide de la PLI-100 pour remplir votre aiguille d'injection. N'oubliez pas de vérifier que l'aiguille est encore distribuer 10 nL d'échantillon avant de commencer l'injection.
- Injecter 20-30 embryons au stade de deux cellules (blastomères deux) avec 500 pg d'ARN YFP dans un plat et votre gène d'intérêt (par exemple 20 pg d'ARN Noggin) plus YFP ARN dans un autre plat 7.
- Lieu 100-200 non injectables embryons par point de temps à autre plat d'injection de la solution de Ficoll. Les déplacer dans et hors de l'incubateur en même temps que les embryons injectés. Ce sont les hôtes qui seront utilisés dans la partie IV.
- Après l'injection, incuber tous les embryons à 14 ° C overnight. Répétez l'opération pour tous les points dans le temps.
Partie III. Isoler calottes animales à partir d'embryons injectés
- Arrivez tôt le matin pour organiser les embryons. Le point plus tôt devrait être à l'étape 9. Supprimer ceux qui n'ont pas survécu. Poursuivre avec les étapes de travail suivantes à chaque point dans le temps par lots.
- Décanter la solution de Ficoll à partir de chaque assiette et ajouter MMR retour 0.7X / solution de gentamicine. Pour un plat d'isolation plafond, ajouter une quantité généreuse de 0,7 X MMR / gentamicine solution. Déloger les embryons de leurs puits d'injection de plat à l'aide d'une pipette de transfert et le placer dans le plat isolement bouchon fraîchement préparé.
- Isoler calottes animales en 0.7X MMR solution + gentamicine, avec 2 ou 3 embryons intacts pour la mise en scène. Soit le Gastromaster, muni d'une pointe jaune plié à 400 um, ou une paire de pinces 5 Numéro forte peut être utilisé.
- Placer des bouchons de retour dans 14 incubateur ° C jusqu'au lendemain. Les embryons d'accueil devraient être retirées de l'incubateuren même temps que les chapeaux de les garder au même stade de développement que le tissu du donneur.
Partie IV. La transplantation de bouchons sur le flanc
- Retirer les capuchons et les embryons du point première fois de l'incubateur 14 ° C et organiser les embryons. Trier par uniformes jaune ou rouge fluorescent positifs casquettes, selon le traceur injecté (figure 2).
- Comptez le nombre de caps et de supprimer le double du nombre d'étages 12 à 13 embryons dans un plat fraîchement préparée avec injection de 0,7 X MMR / gentamicine solution. Avec des pinces ° 5 pointues, retirez la membrane vitelline de chacun. Transférez-les sur la plaque avec les bouchons, mais soyez prudent. Sans leurs membranes vitellines, les embryons peuvent rapidement se dissocient à la surface de l'eau.
- Utilisation de la gastromaster (pointe jaune, 200 250 pm fil plié, réglage le plus élevé) ou n ° 5 pinces, retirez de 200 um carrés sur le côté de l'embryon au stade 14-15 (figure 3). Ensuite, coupez un chapeau de moitié (à l'gastromaster ou til # 5 forceps) et de placer le tissu dans le trou pratiqué dans l'embryon hôte. Tournez l'embryon contre le bien pour permettre la cicatrisation. Faites cela pour que les embryons que vous pouvez alors qu'ils sont à l'étape 15. Répétez l'opération pour tous les points dans le temps.
- L'embryon se guérissent habituellement dans les 30 minutes. Éliminer les cellules mortes (blanc) avec un léger mouvement de brossage avec une pince n ° 5. Cultivez-les à 18 ° C pendant la nuit.
- Sous la loupe binoculaire à fluorescence, les embryons de tri avec marquée par fluorescence, tissu transplanté. Remettez-les à 18 ° C pour se développer jusqu'au stade 42-43.
- Anesthésier les animaux dans tricaïne. À ce stade, vous pouvez prendre des photos sous un microscope à fluorescence de dissection. Une fois que vous avez terminé, fixer, section et coloration immunologique ou d'effectuer l'hybridation in situ en utilisant des marqueurs pour votre tissu d'intérêt.
Figure 1. Conception de plexiglass pour la coulée de la m élastomèreancien utilisé pour la fabrication des plats de détention d'embryons. A 38 x 38 mm carré aux angles arrondis (~ 5 mm de profondeur) a été acheminé sur un morceau de plexiglas qui est de 50 x 50 mm carré et de 25 mm d'épaisseur. Circulaire, régulièrement espacés les puits (1,5 mm de diamètre) ont été forés 1 mm de profondeur dans la matière plastique. Pour faire le moule en élastomère pour les plats micro-injection, nous avons versé élastomère Sylgard dans le plexiglas et lui a permis de se solidifier, selon les instructions du fabricant. Ce moule en élastomère est utilisé pour fabriquer des plaques d'isolation par injection et le chapeau.
Figure 2. Bouchon de tri des animaux avant la transplantation est importante, car l'expression peut varier. Bouchon animale sur la gauche exprime mCherry uniformément dans les tissus tandis que l'explant sur le droit a l'expression inégale et seront rejetées.
Figure 3. Un hôte TADPole a développé une structure oculaire comme sur son flanc transplantés à partir de cellules de la coiffe des animaux. Une image fluorescente a été superposée sur l'image en fond clair.
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Discussion
Dans cette vidéo, nous avons démontré notre version de techniques classiques utilisées par les biologistes de Xenopus, qui nous réarrangés pour créer le test greffe animale bouchon. A température ambiante, les embryons de xénope se développer très rapidement à travers les étapes 9 et 15. En les plaçant à 14 ° C, le développement de l'embryon est ralentie et beaucoup d'autres greffes peuvent être effectuées en une seule expérience. S'il est nécessaire d'augmenter les embryons de stades plus avancés (> 42/43), nous vous recommandons d'utiliser transgéniques venus animaux YFP, depuis les injectées fluorescentes signal s'affaiblit protéines dans les vieux têtards. Nous avons utilisé ce test pour établir que le tissu bouchon animal exprimant EFTFs ou Noggin est spécifié pour former les yeux comme le tissu. Ce test pourrait être utilisé comme un test simple pour déterminer si un gène (s) d'intérêt est nécessaire pour déterminer un destin cellulaire particulier.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche pour prévenir la cécité (Bourses de développement de carrière à MEZ et ASV et une subvention sans restriction à du Département d'ophtalmologie), la Fondation E. Matilda Ziegler (MEZ et ASV) et le National Eye Institute / NIH (MEZ , les subventions et R01EY015748 R01EY017964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| human chorionic gonadotropin | Intervet Inc. | 22219 | |
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Transfer pipette | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Dumostar #5 Forceps | Fisher Scientific | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
