Summary
Tierische caps überexprimierenden Genprodukt (e) auf die Flanke der Entwicklung von transplantierten
Abstract
Viele Proteine spielen eine doppelte Rolle in der embryonalen Entwicklung. Diejenigen, die Zelle Schicksal Bestimmung in einem bestimmten Gewebe zu regulieren kann auch Auswirkungen auf die Entwicklung einer größeren Region des Embryos. Dies macht die Definition seiner Rolle in einem bestimmten Gewebe schwer zu analysieren. Zum Beispiel,
Protocol
Teil I. Set-up für die ACT-Test
- Generieren capped RNA für die Injektion, wie vom Hersteller empfohlen, mit ihren Phenol: Chloroform Reinigungsverfahren (z. B. mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA kodierend für ein fluoreszierendes Protein wird als Tracer verwendet. Wir transkribieren entweder gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) oder mCherry 5 cDNA, die in einem pCS2 + Expressionsvektor ist.
- Pull Borosilikatglas Kapillarröhrchen zu konischem Tipps mit einer Mikropipette puller bilden. Wir verwenden Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), wie zuvor 6 beschrieben.
- Machen sterilen Lösungen in Tabelle 1 aus einer 10 X Marcs Geändert Ringer (MMR)-Lösung Lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES, 1 M NaCl; auf pH 7,5 eingestellt, autoklaviert und gelagert bei RT).
- Isolieren Hoden von einem männlichen Frosch und speichern das Gewebe bei 4 ° C in einer sterilen Lösung von 1X MMR / Gentamicin (50 ug / mL Gentamicinsulfat; BioWhittaker, Kat. Nr. 17-518Z). Dies kann bis zu einer Woche vor dem Start des Experiments durchgeführt werden, aber es ist verliert seine Wirksamkeit im Laufe der Zeit.
- Eiablage-Lösung (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma Basis, 2,62 mM NaHCO 3 und 2,75 mM MgSO 4, eingestellt auf pH 7,6) kann als ein 8X Lager getroffen werden, die kann bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Hinweis: Achten Sie auf Kontamination in dieser Lösung, da dies die Qualität der Eier beeinflussen.
- Generieren Injektion Platten. Um dies zu tun, schmelzen 1% Agarose in 0,4 x MMR in einer Mikrowelle, add ~ 6 ml geschmolzener Agarose-Lösung in 60 mm Platten, sanft abrollen ein Elastomer Form (Abbildung 1) auf der Oberseite der Lösung, um Blasen zu verhindern, und lassen Sie für etwa kühlen 20 Minuten bei RT. Zur Bestimmung der Anzahl benötigt, sollten Sie die Anzahl der experimentellen Bedingungen (z. B. 1, YFP, 2, YFP + Noggin) und die Zahl der transplantierten Host Embryonen benötigt werden. Für unsere Experimente zu generieren wir mindestens 20 transplantierten Host Embryonen für jeden experimentellen Zustand. Bei 18-19 ° C, Embryonen im Stadium 15 für etwa eine Stunde sein. Wenn es eine Stunde dauert bis 20 Transplantationen durchführen, dann zwei Befruchtung Zeitpunkten benötigt werden, vorausgesetzt, der Host-Embryonen akzeptieren alle Transplantationen. Daher wird mittels vier Injektionen verabreichter Gerichte benötigt (2 exp Bedingungen x 2-Düngung Zeitpunkte = 4). Lagern Sie die Platten bei 4 ° C bis zu einer Woche.
- Generieren Kappe Isolation Platten mit 1% Agarose + 0,7 X MMR mit Formen wie bei der Injektion Platte. Machen Sie die gleiche Anzahl von Cap isoliert als Injektion Platten plus eine extra pro Befruchtung Zeitpunkt (4 + 2 Befruchtung Zeitpunkten = 6).
- Inject Weibchen mit 500 Einheiten humanes Chorion-Gonadotropin spät in den Tag, an dem Tag vor der Mikroinjektion. Shop Frauen bei 16-18 ° C über Nacht.
Part II. RNA Mikroinjektion von Xenopus laevis Embryonen
A. Vorbereitung für die Mikroinjektion
- Entfernen Sie hormonell induzierten weiblichen und legen Sie sie in einzelnen Tanks mit 1X Eiablage Lösung (ELS). Hinweis: wir verwenden keine Eier, die in der ELS mehr als zwei Stunden wurden die Qualität der Eier wird reduziert. Deshalb etwa eine Stunde vor in-vitro-Fertilisation, verwerfen wir alle Eier aus dem Tank, so dass nur frisch gelegten Eier gesammelt werden.
- Bereiten Sie die Nadel für die Mikroinjektion von Schnippeln von der Spitze zu einem 25-35 Mikrometer Durchmesser zu erhalten. Setzen Sie die Nadel auf die picoinjector und kalibrieren, so dass es 10 nL verzichtet pro Injektion.
- Set einem Inkubator auf 14 ° C.
- Sobald Weibchen Eier für etwa eine Stunde, entfernen Sie die Eier aus dem Tank mit einer Transferpipette und sie in 60 mm Petrischalen gelegt. Entfernen Sie so viel ELS aus den Eiern wie möglich und ersetzen mit 1X MMR. Die Eier können sofort befruchtet werden oder bleiben in 1X MMR für bis zu eine Stunde. Für die Transplantation Assay ist es am besten, zwei Gerichte, 80% voll aus einer einzigen Schicht von Eiern in bis zu drei getrennten Ansätzen gegen 11 Uhr, mittags und 01.00 Uhr zu befruchten. Nach der Injektion wird sie bei 14 ° C platziert werden, so dass sie auf die gewünschte Bühnen für cap Trennung (Stufe 8,5-9) und Transplantation wachsen (Stufe 15; siehe Teil I, Nr. 6 oben).
- Zur Überprüfung der Qualität der Hoden führen wir einen frühen Morgen-Fertilisation (~ 08.00 Uhr), die uns Hoden von einem anderen männlichen extrahieren, wenn die Spermien aus dem ersten ist nicht lebensfähig ermöglicht. Hinweis: Wir homogenisieren ~ 0,25 Hoden in 1 ml 1X MMR und fügen etwa 5 bis 7 Tropfen pro Platte von Eizellen.
- In-vitro-Befruchtung der Eier mit homogenisiert Hoden und eine Stunde später, entfernen Sie das Gelee Mantel auf die Eier mit de-Gelee-Lösung (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 bis 50 ml autoklaviert Nanopure Wasser). Warten Sie, bis sie zwei-Zell-Stadium zu sortieren, die etwa 2 Stunden dauert bei 18 beginnen ° C erreichen oder 1,5 Stunden bei Raumtemperatur (22 ° C).
- Mit einem transfer Pipette Art gleichmäßig pigmentierte und gleichmäßig geteilt Embryonen, wie in der linken Tier Kappe in Abbildung 3 dargestellt, in den Brunnen einer Injektion Gericht mit 0.4x MMR + 6% Ficoll gefüllt.
B. Mikroinjektion
- Stretch Parafilm über die Spitze eines 60 mm-Petrischale Deckel. Pipette 2 ul Ihre erste RNA-Probe auf den Parafilm und saugen mit den PLI-100, um Ihre Injektionsnadel zu füllen. Achten Sie darauf, um zu überprüfen, dass die Nadel immer noch Dosieren 10 nL der Probe vor dem Start Injektion.
- Inject 20-30 Zwei-Zell-Embryonen (beide Blastomeren) mit 500 pg YFP RNA in eine Schüssel und Ihr Gen von Interesse (zB 20 pg Noggin RNA) plus YFP RNA in eine andere Schüssel sieben.
- Legen 100-200 nicht-injizierten Embryonen pro Zeitpunkt in eine weitere Injektion Schale mit der Ficoll-Lösung. Bewegen Sie sie in und aus dem Inkubator zur gleichen Zeit wie die injizierten Embryonen. Dies sind die Gastgeber in Teil IV verwendet werden.
- Nach der Injektion inkubieren alle Embryonen bei 14 ° C über Nacht. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte.
Teil III. Isolieren tierischer Kappen aus injizierten Embryonen
- Kommen Sie früh am Morgen, um die Embryonen der Bühne. Der früheste Zeitpunkt sollte in Stufe 9 sein. Entfernen Sie diejenigen, die nicht überlebt haben. Gehen Sie mit den folgenden Schritten die Arbeit mit jedem Zeitpunkt in den Reihen.
- Abgießen Ficoll-Lösung von jeder Platte und wieder hinzuzufügen 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Um eine Kappe Isolation Schüssel, fügen Sie eine großzügige Menge 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Verdrängen Embryonen aus der Injektion Gericht Brunnen mit einer Transferpipette und in den frisch präparierten Kappe Isolation Gericht.
- Isolieren tierischer Kappen in 0.7X MMR + Gentamicin-Lösung, halten 2 oder 3 intakte Embryonen für die Inszenierung. Entweder die Gastromaster, mit einer gelben Spitze gebogen, um 400 um, oder ein Paar scharfe Nummer 5 Zangen ausgerüstet verwendet werden kann.
- Put Kappen zurück in 14 ° C Inkubator bis zum nächsten Tag. Der Host-Embryonen aus dem Inkubator zur gleichen Zeit wie die Kappen, sie auf der gleichen Entwicklungsstufe wie das Spendergewebe halten entfernt werden.
Teil IV. Die Transplantation von Kappen auf Flanke
- Entfernen Sie die Schutzkappen und Embryonen aus dem ersten Zeitpunkt aus dem 14 ° C Inkubator und Bühne der Embryonen. Sortieren für eine einheitliche gelbe oder rote Fluoreszenz-positive Mützen, abhängig von der Tracer (Abbildung 2).
- Zählt die Anzahl der Kappen und entfernen Sie doppelte Anzahl der Bühne 12-13 Embryonen ein frisch zubereitetes Injektion Gericht mit 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Mit scharfen Nr. 5 Pinzette entfernen die Dotterhaut von jedem. Übertragen auf die Platte mit dem Deckel, aber seien Sie vorsichtig. Ohne ihre vitelline Membranen können Embryonen schnell an der Oberfläche des Wassers zu distanzieren.
- Mit dem gastromaster (gelber Spitze, 200-250μm gebogenen Draht, höchste Einstellung) oder Nr. 5 Zange, entfernen Sie einen 200 um Platz auf der Seite des Embryos im Stadium 14-15 (Abbildung 3). Dann schneiden Sie ein Cap in die Hälfte (mit dem gastromaster oder Nr. 5 Pinzette) und platzieren Sie das Gewebe in das Loch in der Host-Embryo gemacht. Drehen Sie den Embryo gegen die gut zur Heilung zu ermöglichen. Tun Sie dies für so viele Embryonen, wie Sie können, während sie bei Stufe 15 sind. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte.
- Der Embryo wird in der Regel innerhalb von 30 Minuten zu heilen. Entfernen Sie die toten Zellen (weiß) mit einem sanften Bürsten Bewegung mit einem # 5 Pinzette. Wachsen sie bei 18 ° C über Nacht.
- Unter dem Sezieren Fluoreszenzmikroskop, sortieren Embryonen mit fluoreszenzmarkierten, transplantierte Gewebe. Setzen Sie sie wieder bei 18 ° C bis Stufe 42-43 wachsen.
- Anesthetize die Tiere in Tricaine. An dieser Stelle können Sie Bilder unter einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop nehmen. Nachdem Sie fertig sind, zu beheben, Abschnitt und immunostain oder in situ-Hybridisierung mit Markern für Ihre Gewebe von Interesse durchzuführen.
Abbildung 1. Design aus Plexiglas für das Gießen der Elastomer-Form zur Herstellung Embryo hält Speisen verwendet. Ein 38 x 38 mm mit abgerundeten Ecken square (~ 5 mm tief) wurde aus einem Stück Plexiglas, das 50 x 50 mm ² und 25 mm dick ist geleitet. Circular, gleichmäßig verteilte Bohrungen (1,5 mm Durchmesser) wurden 1 mm tief in den Kunststoff gebohrt. Um das Elastomer Form für die Mikroinjektion Gerichte, gossen wir Sylgard Elastomer in den Plexiglas und erlaubt es sich zu verfestigen, wie pro Anweisungen des Herstellers. Dieses Elastomer Form wird verwendet, um Einspritzung und Kappe Isolation Platten zu machen.
Abbildung 2. Tierische Kappe Sortierung vor der Transplantation ist es wichtig, als Ausdruck variieren kann. Tierische Kappe auf der linken Seite drückt mCherry gleichmäßig über das Gewebe, das Explantat auf der rechten Seite hat spotty Ausdruck und werden verworfen.
Abbildung 3. Eine Vielzahl TADPole hat ein Auge-Struktur auf ihrer Flanke von transplantierten Tieren cap-Zellen entwickelt. Ein fluoreszierendes Bild auf dem Hellfeld Bild wurde überlagert.
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Discussion
In diesem Video haben wir unsere Version des klassischen Techniken, die von Xenopus Biologen, die wir neu geordnet, um das Tier Kappe Transplantation Assay erstellen demonstriert. Bei Raumtemperatur entwickeln Xenopus Embryonen sehr schnell durch die Stufen 9 und 15. Indem sie bei 14 ° C, die Entwicklung des Embryos wird verlangsamt und viele weitere Transplantationen können in einem Experiment durchgeführt werden. Sollte es notwendig sein, um die Embryonen zu älteren Stadien (> 42/43) wachsen wird, dann empfehlen wir die Verwendung von transgenen venus YFP Tiere, da das injizierte fluoreszierende Protein-Signal verschwindet bei älteren Kaulquappen. Wir haben diesen Test zu diesem Tier Kappe Gewebe exprimiert EFTFs oder Noggin wird angegeben, um Augen-ähnliches Gewebe zu formen. Dieser Test kann als ein einfacher Test, um festzustellen, ob ein Gen (e) von Interesse, die zur Bestimmung einer bestimmten Zelle Schicksal verwendet werden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Forschung bis Blindness (Career Development Awards zu MEZ und ASV und einen nicht zweckgebundenen Zuschuss an das Department of Ophthalmology), die E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ und ASV) und der National Eye Institute / NIH (MEZ Prevent unterstützt gewährt R01EY015748 und R01EY017964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| human chorionic gonadotropin | Intervet Inc. | 22219 | |
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Transfer pipette | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Dumostar #5 Forceps | Fisher Scientific | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
