Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis doi: 10.3791/1932 Published: May 16, 2010

Summary

בעלי חיים כמוסות overexpressing הגן המוצר (ים) שנמצאים מושתלים האגף לפיתוח

Abstract

חלבונים רבים משחקים תפקיד כפול ההתפתחות העוברית. אלה המווסתים את גורל קביעת תא ברקמה מסוימת יכול להשפיע גם על פיתוח של אזור גדול יותר של העובר. זה הופך את הגדרת תפקידה רקמה מסוימת קשה לנתח. לדוגמה,

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חלק א הקמה עבור Assay ACT

  1. הפקת רנ"א כתרים להזרקה כפי שהוצע על ידי היצרן, באמצעות פנול שלהם: שיטת טיהור כלורופורם (למשל mMessage mMachine קיט; Applied Biosystems / Ambion, אוסטין, טקסס). קידוד RNA חלבון פלואורסצנטי משמש נותב. אנו לתמלל או חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) או mCherry 5 cDNA, שהוא וקטור ביטוי pCS2 +.
  2. משוך צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי טיפים ליצירת זכוכית קוני באמצעות חולץ micropipette. אנו משתמשים סאטר micropipette פולר, P-97 (סאטר מכשירים, Inc, Novato, CA), כפי שתואר לעיל 6.
  3. הפוך את פתרונות סטרילי בטבלה 1 מתוך 10 השתנה X של מארק Ringer של (MMR) פתרון המניות (10 mM MgCl 2: 20 מ"מ KCl: 20 מ"מ CaCl 2; 50 HEPES מ"מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסנים ב RT).
  4. בודד האשכים מן צפרדע זכר לחנות רקמה על 4 ° C בתמיסה סטרילית של 1X MMR / גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין סולפט; BioWhittaker, חתול # 17-518Z). ניתן לעשות זאת עד שבוע לפני תחילת הניסוי, אבל זה מאבד את יעילותו לאורך זמן.
  5. פתרון ההטלה (1X: 150 mM NaCl, KCl mM 2.62, 0.8 mM Na 2 HPO 4, 20 מ"מ Trizma בסיס, 2.62 mM NaHCO 3 ו - 2.75 mM MgSO 4; מותאם pH 7.6) ניתן גם מניות 8X, אשר ניתן לאחסן 4 ° C למשך עד שבועיים. הערה: להיזהר זיהום בפתרון זה, כמו זה ישפיע על איכות הביצים שלך.
  6. צור צלחות ההזרקה. כדי לעשות זאת, להמיס agarose 1% MMR 0.4X במיקרוגל, מוסיפים 6 ~ פתרון נמס לתוך 60 מ"ל agarose צלחות מ"מ, לגולל בעדינות עובש אלסטומר (איור 1) על גבי פתרון כדי למנוע בועות ולתת להתקרר למשך כ 20 דקות RT. כדי לקבוע את מספר צורך לשקול מספר תנאים ניסויים (למשל 1, YFP; 2, YFP noggin +) ואת מספר העוברים המושתלים מארח הצורך. על הניסויים שלנו, אנחנו מייצרים לפחות 20 עוברי מארח המושתלים עבור כל תנאי הניסוי. ב 18-19 ° C, עוברים יהיה בשלב 15 במשך כשעה. אם זה לוקח שעה לבצע 20 השתלות, אז שתי נקודות זמן הפריה יש צורך, בהנחה עוברים מארח לקבל את כל ההשתלות. לכן, ארבע מנות הזרקה יהיה צורך (2 תנאים exp x 2 נקודות זמן הפריה = 4). אחסן את הלוחות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
  7. צור בידוד כובע צלחות באמצעות 1% agarose + 0.7X MMR עם תבניות כמו צלחת ההזרקה. בצע את אותו מספר של בידוד כובע כמו צלחות זריקה ועוד אחד זמן נוסף לכל נקודה הפריה (4 + 2 נקודות זמן הפריה = 6).
  8. הזרק נקבות עם 500 יחידות גונדוטרופין כוריוני אנושי מאוחר יותר באותו יום יום לפני microinjection. חנות נקבות ב 16-18 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

חלק II. RNA Microinjection עוברים Xenopus laevis

א הכנה microinjection

  1. הסר נקבה המושרה הורמונלי ומכניסים אותם טנקים בודדים המכיל 1X פתרון ההטלה (ELS). הערה: אנחנו לא משתמשים בביצים, כי כבר ב ELS יותר משעתיים כמו איכות הביצים מצטמצם. לכן, כשעה לפני הפריה חוץ גופית, אנו לזרוק את כל הביצים מהטנק כך ביצים רק טרי נאספים.
  2. הכן את המחט על ידי microinjection תולשת את קצה להשיג בקוטר 25-35 מיקרומטר. מניחים את המחט אל picoinjector לכייל אותו כך שהוא מחלק 10 NL לכל זריקה.
  3. הגדר באינקובטור עד 14 ° C.
  4. לאחר הנקבות יש הטילו ביצים במשך כשעה, להסיר את הביצים מהטנק באמצעות פיפטה להעביר ולהכניס אותם לתוך 60 מ"מ צלחות פטרי. הסר כמו ELS הרבה מן הביצים ככל האפשר ולהחליף MMR 1X. הביצים יכול להיות מופרית מיד או להישאר MMR 1X עד שעה. עבור assay ההשתלה, עדיף להפרות שתי מנות, 80% מלא בשכבה אחת של ביצים עד שלוש קבוצות נפרדות בסביבות 11:00, צהריים 01:00. לאחר ההזרקה, הם יוצבו על 14 מעלות צלזיוס, כך שהם יגדלו בשלבים הרצוי עבור בידוד כובע (שלב 8.5-9) וכן השתלה (שלב 15; לראות חלק I, # 6 לעיל).
  5. כדי לבדוק את האיכות של האשכים, אנו מבצעים הפריה הבוקר המוקדמות (~ 08:00), אשר מאפשרת לנו לחלץ מן האשכים הגברי אחר אם הזרע הראשון אינו בר קיימא. הערה: אנו homogenize ~ 0.25 האשכים ב 1 מ"ל 1X MMR ולהוסיף כ 5-7 טיפות לכל צלחת של ביציות.
  6. במבחנה להפרות את הביצים עם האשכים הומוגני וגם, כעבור שעה, להסיר את המעיל ג'לי על הביצים באמצעות דה ג'לי פתרון (164μl 1M DTT + 10 מ"ל 1M טריס, pH 8.8 עד 50 מים nanopure autoclaved מ"ל). חכו עד שהם מגיעים שני תאים בשלב להתחיל מיון, אשר לוקח בערך 2 שעות 18 ° C או 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (22 ° C).
  7. שימוש transfאה פיפטה, עוברים מיון פיגמנט אחיד לחלק באופן שווה, כפי שמוצג כובע החיה שמאל באיור 3, לתוך הבאר של צלחת זריקה מלא Ficoll + 0.4X MMR 6%.

ב Microinjection

  1. מתיחה Parafilm מעל מכסה 60 מ"מ צלחת פטרי. פיפטה 2 μl של הדוגמה הראשונה RNA שלך על Parafilm ואת לשאוב באמצעות PLI-100 כדי למלא את מחט הזריקה שלך. הקפד לבדוק כי המחט עדיין מחלק 10 NL המדגם לפני תחילת ההזרקה.
  2. הזרק 20-30 שני תא עוברי בשלב (שניהם בלסטומרים) עם 500 עמ YFP RNA בצלחת אחת הגן העניין שלך (למשל 20 pg noggin RNA) בתוספת YFP RNA בצלחת נוספת 7.
  3. מקום 100-200 הלא מוזרק עוברים לכל נקודת זמן בצלחת עוד זריקה עם פתרון Ficoll. העבר אותם פנימה והחוצה של החממה באותו זמן כמו עוברי מוזרק. אלה המארחים כדי לשמש חלק ד '.
  4. לאחר ההזרקה, דגירה כל העוברים על 14 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן.

חלק III. בודד כמוסות חיים מעוברים מוזרק

  1. הגעה בשעות הבוקר המוקדמות לשלב עוברי. נקודת הזמן המוקדם אמור להיות בשלב 9. הסר את אלה שלא שרדו. המשך בשלבים הבאים לעבוד עם נקודה בכל פעם בקבוצות.
  2. יוצקים את הפתרון Ficoll מהצלחת כל ולהוסיף MMR 0.7X בחזרה / פתרון גנטמיצין. כדי בצלחת הבידוד המכסה, מוסיפים כמות נדיבה של פתרון ה-MMR / גנטמיצין 0.7X. לעקור עוברים מצלחת זריקה שלהם בארות באמצעות פיפטה להעביר מקום את התבשיל מוכן טרי הבידוד המכסה.
  3. בודד כמוסות חיה פתרון 0.7X MMR + גנטמיצין, שמירה על 2 או 3 עוברים שלם עבור הבימוי. או Gastromaster, מצויד קצה צהוב התכופפה 400 מיקרומטר, או זוג 5 מלקחיים חדה במספר ניתן להשתמש.
  4. שים כמוסות בחזרה 14 ° C החממה עד למחרת. עוברים המארח יש להסיר מן האינקובטור באותו זמן כמו כובעים כדי לשמור אותם בשלב התפתחותי זהה רקמות התורם.

חלק ד '. השתלה של כמוסות על האגף

  1. הסר כובעים עוברים מנקודה זו הפעם הראשונה מתוך 14 ° C החממה בשלב עוברי. מיון אחיד עבור ניאון חיובי כמוסות צהוב או אדום, תלוי הזריקו נותב (איור 2).
  2. ספירת כובעים להסיר להכפיל את מספר השלב 12-13 עוברים לצלחת הזרקת מוכן טרי עם 0.7X MMR / פתרון גנטמיצין. עם חדות מלקחיים # 5, להסיר את הקרום vitelline מכל אחד. העברת אותם בצלחת עם כובעים, אבל להיות זהירים. ללא קרומים vitelline שלהם, עוברים במהירות לנתק את פני המים.
  3. שימוש (קצה צהוב, חוט 200-250μm כפופות, הגדרת הגבוה ביותר) gastromaster או # 5 מלקחיים, להסיר 200 מיקרומטר מרובע בצד של העובר בשלב 14-15 (איור 3). לאחר מכן, לחתוך כובע במחצית (עם gastromaster או # 5 מלקחיים) והמקום רקמות החור שנעשו בעובר המארח. סובב את העובר נגד היטב כדי לאפשר ריפוי. האם זה כמו עוברים רבים ככל שאתה יכול בזמן שהם בשלב 15. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן.
  4. העובר בדרך כלל לרפא בתוך 30 דקות. הסרת התאים המתים (לבן) בתנועה הברשה עדינה עם מלקחיים # 5. לגדל אותם 18 ° C במשך הלילה.
  5. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, עוברים מיון עם רקמה, fluorescently שכותרתו המושתלים. שים אותם בחזרה 18 ° C לגדול עד לשלב 42-43.
  6. להרדים את החיות tricaine. בשלב זה, אתה יכול לצלם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח. לאחר שתסיים, לתקן, סעיף ו immunostain או לבצע הכלאה באתרו באמצעות סמנים עבור רקמות העניין שלך.

איור 1
באיור 1. עיצוב של פרספקס ליציקת את התבנית אלסטומר משמש להכנת מאכלים מחזיק העובר. 38 x 38 עגול פינות מ"מ מרובע (~ 5 מ"מ עמוק) כבר מנותב מתוך פיסת פרספקס כי הוא 50 x 50 מ"מ מרובע ו 25 מ"מ עובי. בחוזר, בארות מחולקת באופן שווה (בקוטר 1.5 מ"מ) כבר קדחו 1 מ"מ עמוק לתוך הפלסטיק. כדי להפוך את התבנית אלסטומר עבור microinjection את הכלים, אנחנו מזג אלסטומר Sylgard לתוך פרספקס ואיפשר לו לגבש, לפי הוראות היצרן. עובש זה אלסטומר משמש לייצור הזרקת ובידוד צלחות כובע.

איור 2
איור 2. כובע מיון בעלי חיים לפני השתלת חשוב, כביטוי יכול להשתנות. כובע בעלי חיים בצד שמאל מבטא mCherry באופן שווה על פני רקמת בעוד explant בצד ימין יש ביטוי מחוצ'קנים, ייפסל.

איור 3
איור 3. Tadp מארחOLE פיתחה מבנה העין כמו על האגף שלו מן התאים המושתלים כובע בעלי חיים. תמונה פלורסנט כבר overlayed על התמונה brightfield.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בסרטון זה, יש לנו הפגינו הגרסה שלנו של טכניקות קלאסיות בשימוש על ידי ביולוגים Xenopus, שאנו מחדש ליצור את כובע חיה assay להשתלה. בטמפרטורת החדר, עוברים Xenopus לפתח מהר מאוד שלבים 9 ו -15. על ידי הצבת אותם על 14 מעלות צלזיוס, התפתחות העובר הוא האט השתלות רבות יותר ניתן לבצע ניסוי אחד. אם יש צורך לגדל את העוברים לשלבים מבוגרים יותר (> 42 / 43), ואז אנו ממליצים להשתמש מהונדס ונוס חיות YFP, שכן הזריקו ניאון האות דועך חלבון הראשנים יותר. השתמשנו זה assay לקבוע כי כובע רקמה חיה להביע EFTFs או noggin המצוין כדי ליצור את העין כמו רקמה. Assay זה יכול לשמש בדיקה פשוטה כדי לקבוע אם גן (ים) של עניין הכרחי בקביעת גורל התא בפרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר כדי למנוע עיוורון (פיתוח קריירה פרסים MEZ ו ASV ו מענק חופשית מחלקת עיניים), את מטילדה א זיגלר קרן (MEZ ו ASV) ואת העין לאומי / NIH (MEZ , מענקים R01EY015748 ו R01EY017964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2009).
רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב<em> Xenopus laevis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter