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Biology

ऊतक में पशु कैप (अधिनियम) प्रत्यारोपण परख का प्रयोग निर्धारण Xenopus laevis doi: 10.3791/1932 Published: May 16, 2010

Summary

पशु टोपियां overexpressing जीन उत्पाद (ओं) को विकसित करने की दिशा में प्रत्यारोपित कर रहे हैं

Abstract

कई प्रोटीन भ्रूण के विकास में एक दोहरी भूमिका निभाते हैं. जो कि एक विशिष्ट ऊतकों में सेल भाग्य निर्धारण को विनियमित भी भ्रूण के एक बड़े क्षेत्र के विकास को प्रभावित कर सकते हैं. यह एक विशेष ऊतकों में अपनी भूमिका के विश्लेषण करने के लिए मुश्किल को परिभाषित करता है. उदाहरण के लिए,

Protocol

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भाग मैं अधिनियम परख के लिए सेट अप

  1. क्लोरोफॉर्म शुद्धि विधि (, एप्लाइड Biosystems / Ambion, ऑस्टिन, TX जैसे mMessage mMachine किट): के रूप में निर्माता द्वारा सुझाए इंजेक्शन के लिए छाया शाही सेना, उनके phenol का उपयोग उत्पन्न करता है. एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग शाही सेना एक अनुरेखक के रूप में प्रयोग किया जाता है. हम या तो पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) या 5 mCherry सीडीएनए, जो एक pCS2 + अभिव्यक्ति वेक्टर में है टाइप करना.
  2. पतला गिलास एक micropipette खींचने का उपयोग सुझावों फार्म borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब खींचो. हम Sutter micropipette डांड़ी, P-97 (Sutter उपकरण, Inc, Novato, CA) का उपयोग करें, जैसा कि पहले 6 में वर्णित है.
  3. 20 KCl मिमी, 20 मिमी 2 CaCl, 50 मिमी HEPES, 1 एम NaCl, 7.5 पीएच को समायोजित, autoclaved और पर संग्रहीत तालिका 1 में से एक 10 एक्स है मार्क संशोधित घंटी (एमएमआर) समाधान स्टॉक (10 मिमी 2 MgCl है बाँझ समाधान बनाओ आर टी).
  4. एक नर मेंढक से testes पृथक और 4 ° C पर 1X एमएमआर / gentamicin (50 / μg एमएल gentamicin सल्फेट, BioWhittaker, बिल्ली # 17-518Z) के एक बाँझ समाधान में ऊतकों की दुकान. इस प्रयोग के शुरू होने से पहले एक सप्ताह के लिए किया जा किया जा सकता है लेकिन यह समय के साथ इसकी क्षमता हारता.
  5. अंडे बिछाने समाधान (1X: 150 मिमी NaCl, 2.62 मिमी KCl, 0.8 मिमी ना दो HPO 4, 20 मिमी Trizma आधार, 2.62 मिमी 3 NaHCO और 2.75 मिमी MgSO 4, 7.6 पीएच को समायोजित) एक 8X स्टॉक के रूप में बनाया जा सकता है है, जो 4 में संग्रहीत किया जा सकता है डिग्री सेल्सियस अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए नोट: इस समाधान में संदूषण के लिए बाहर घड़ी है, के रूप में यह अपने अंडे की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा.
  6. इंजेक्शन प्लेटें उत्पन्न. ऐसा करने के लिए, एक माइक्रोवेव में 0.4X एमएमआर में 1% agarose पिघल, 60 मिमी प्लेटों में ~ 6 एमएल पिघला agarose समाधान जोड़ने के लिए, धीरे बुलबुले को रोकने के लिए और के बारे में के लिए ठंडा समाधान के शीर्ष पर elastomer एक मोल्ड (चित्रा 1) उतारना आरटी में 20 मिनट. आवश्यक संख्या का निर्धारण करने के लिए, प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या पर विचार (1 उदाहरण के लिए, YFP, 2, YFP + नोगिन) और प्रतिरोपित मेजबान भ्रूण के संख्या की जरूरत है. हमारे प्रयोगों के लिए, हम कम से कम 20 प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए प्रतिरोपित मेजबान भ्रूण उत्पन्न करते हैं. 18-19 से कम डिग्री सेल्सियस भ्रूण, के स्तर पर 15 के बारे में एक घंटे के लिए किया जाएगा. यदि यह 20 प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए एक घंटे लेता है है, तो दो निषेचन समय अंक की जरूरत है, कर रहे हैं संभालने मेजबान भ्रूण प्रत्यारोपण स्वीकार. इसलिए, चार इंजेक्शन व्यंजन (2 ऍक्स्प शर्तों एक्स 2 निषेचन समय अंक = 4) की जरूरत होगी. 4 ° C पर एक सप्ताह के लिए प्लेटों का स्टोर.
  7. टोपी अलगाव molds के साथ इंजेक्शन की थाली के लिए के रूप में 1% agarose + 0.7X MMR उपयोग कर प्लेटें उत्पन्न करता है. इंजेक्शन प्लेटें प्लस एक अतिरिक्त प्रति निषेचन समय बिंदु (4 + 2 निषेचन समय अंक = 6) के रूप में टोपी अलगाव की एक ही नंबर है.
  8. 500 मानव chorionic gonadotropin इकाइयों microinjection पहले दिन पर दिन में देर के साथ महिलाओं को इंजेक्षन. 16-18 डिग्री सेल्सियस रातोंरात स्टोर महिलाओं.

भाग द्वितीय. Xenopus laevis भ्रूण की शाही सेना Microinjection

ए microinjection के लिए तैयार

  1. Hormonally प्रेरित महिला निकालें और उन्हें व्यक्तिगत 1X अंडे बिछाने (ELS) नोट समाधान युक्त टैंक में जगह: हम अंडे कि एल्स में दो घंटे से अधिक समय किया गया है के रूप में अंडे की गुणवत्ता कम है का उपयोग नहीं करते. इसलिए, इन विट्रो निषेचन में पहले एक घंटे के बारे में, हम टैंक से सभी अंडे त्यागने इतना है कि केवल हौसले से रखी अंडे एकत्र कर रहे हैं.
  2. Microinjection के लिए बंद टिप snipping 25-35 सुक्ष्ममापी व्यास प्राप्त करने के द्वारा सुई तैयार करो. Picoinjector पर सुई प्लेस और यह जांचना इतना है कि यह इंजेक्शन के 10 प्रतिशत NL dispenses.
  3. 14 डिग्री सेल्सियस के लिए एक इनक्यूबेटर सेट
  4. एक बार महिलाओं के लिए एक घंटे के बारे में, टैंक से अंडे एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर हटा दें और 60 मिमी पेट्री डिश में उन्हें जगह लिए अंडे रखी है. संभव के रूप में अंडे से ज्यादा एल्स के रूप में निकालें और 1X एमएमआर के साथ की जगह. अंडे सही दूर निषेचित किया जा सकता है या एक घंटे के लिए 1X एमएमआर में रहना. प्रत्यारोपण परख के लिए, यह सबसे अच्छा है के आसपास रहा हूँ 11, दोपहर और 1 बजे के तीन अलग - अलग बैचों के लिए दो बर्तन, 80% तक में एक अंडे की एक परत से भरा खाद है. इंजेक्शन के बाद, वे 14 में रखा जाएगा डिग्री सेल्सियस इतना है कि वे टोपी (8.5-9 चरण) अलगाव और प्रत्यारोपण के लिए वांछित चरणों बढ़ेगा (15 मंच; पार्ट मैं, # ऊपर 6).
  5. Testes की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, हम एक सुबह (~ 8 बजे) निषेचन, जो हमें एक और पुरुष से testes को निकालने के लिए है अगर पहले से शुक्राणु व्यवहार्य नहीं है की अनुमति देता है प्रदर्शन. नोट: हम ~ 1 एमएल 1X एमएमआर में 0.25 testes homogenize और oocytes की थाली के अनुसार लगभग 5 से 7 बूँदें जोड़ने.
  6. इन विट्रो में homogenized testes के साथ अंडे की खाद और एक घंटे के बाद, समाधान डे - जेली का उपयोग अंडे पर जेली कोट निकालने (164μl 1M डीटीटी + 10ml 1M Tris, 50 एमएल autoclaved nanopure पानी पीएच 8.8) . रुको जब तक वे दो सेल चरण तक पहुंचने के लिए छँटाई, जो 18 साल की उम्र में के बारे में 2 घंटे लगते शुरू ° सी या कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर 1.5 घंटे.
  7. एक transf का उपयोगएर पिपेट, सॉर्ट भ्रूण समान pigmented और समान रूप से विभाजित, के रूप में 3 चित्र में बाईं पशु टोपी में एक इंजेक्शन 0.4X MMR + 6% Ficoll से भरा पकवान की अच्छी तरह से में, दिखाया.

बी Microinjection

  1. एक 60 मिमी पेट्री डिश ढक्कन के शीर्ष पर Parafilm खींचो. पिपेट Parafilm और aspirate पीएलआई-100 का उपयोग करने के लिए अपने इंजेक्शन की सुई को भरने पर अपना पहला शाही सेना नमूना के 2 μl. कि सुई अभी भी नमूने के इंजेक्शन शुरू करने से पहले 10 NL वितरण की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें.
  2. 500 स्नातकोत्तर YFP एक डिश में शाही सेना और अपने हित के जीन (जैसे 20 स्नातकोत्तर नोगिन आरएनए) plus YFP शाही सेना के साथ एक और 7 पकवान में 20-30 दो सेल मंच भ्रूण (दोनों blastomeres) इंजेक्षन.
  3. प्लेस 100-200 Ficoll समाधान के साथ एक और इंजेक्शन डिश में गैर इंजेक्शन समय बिंदु प्रति भ्रूण. उन्हें में ले जाएँ और इंजेक्शन भ्रूण के रूप में एक ही समय में इनक्यूबेटर. मेजबान भाग IV में इस्तेमाल किया जा रहे हैं.
  4. इंजेक्शन के बाद, 14 पर सभी भ्रूण डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं. सभी समय अंक के लिए दोहराएँ.

भाग III. इंजेक्शन भ्रूण से पशु टोपियां पृथक

  1. भ्रूण चरण सुबह जल्दी आएँ. जल्द से जल्द समय बिंदु 9 स्तर पर होना चाहिए. उन है कि जीवित नहीं किया निकालें. बैचों में हर बार बिंदु के साथ काम कर रहे निम्न चरणों के साथ आगे बढ़ें.
  2. प्रत्येक थाली से Ficoll समाधान डालो और वापस 0.7X एमएमआर / gentamicin समाधान जोड़ें. एक टोपी अलगाव पकवान करने के लिए, 0.7X समाधान / MMR gentamicin के एक उदार राशि जोड़ें. उनके इंजेक्शन पकवान हौसले से तैयार टोपी अलगाव पकवान में एक हस्तांतरण विंदुक और जगह का उपयोग कर कुओं से भ्रूण हटाना.
  3. 0.7X MMR + gentamicin समाधान में पशु टोपियां पृथक रखने के मंचन के लिए 2 या 3 बरकरार भ्रूण. या तो Gastromaster, एक पीले रंग की टिप 400 सुक्ष्ममापी तुला, या तेज संख्या 5 संदंश की एक जोड़ी के साथ फिट किया जा सकता.
  4. टोपी वापस अगले दिन तक 14 ° सी इनक्यूबेटर में रखो. मेजबान भ्रूण टोपी के रूप में एक ही समय उन्हें दाता ऊतक के रूप में एक ही विकास के चरण में रखने में इनक्यूबेटर से हटाया जाना चाहिए.

भाग IV. पार्श्व पर टोपी का प्रत्यारोपण

  1. 14 ° सी इनक्यूबेटर से पहली बार बिंदु से निकालें कैप और भ्रूण और भ्रूण मंच. वर्दी पीले या लाल फ्लोरोसेंट सकारात्मक टोपियां, ट्रेसर इंजेक्शन (चित्रा 2) के आधार पर छाँटें.
  2. टोपी की संख्या की गणना और 0.7X एमएमआर / gentamicin समाधान के साथ एक नया तैयार इंजेक्शन पकवान मंच की संख्या 12-13 भ्रूण डबल हटायें. तेज # 5 संदंश के साथ, प्रत्येक से vitelline झिल्ली को हटा दें. उन्हें टोपी के साथ थाली करने के लिए स्थानांतरण, लेकिन सावधान रहना. उनके vitelline झिल्ली के बिना, भ्रूण जल्दी से पानी की सतह पर अलग कर देना कर सकते हैं.
  3. Gastromaster (पीले टिप, 200 250μm तुला तार, उच्चतम सेटिंग) या # संदंश 5 का प्रयोग, 14-15 मंच (चित्रा 3) में भ्रूण की तरफ 200 वर्ग सुक्ष्ममापी हटा दें. फिर, आधे में एक टोपी में कटौती (gastromaster या # 5 संदंश के साथ) और मेजबान भ्रूण में बने छेद में ऊतक जगह. अच्छी तरह के खिलाफ भ्रूण घुमाएँ के लिए चिकित्सा की अनुमति है. के रूप में आप कर सकते हैं कई भ्रूण के रूप में यह मत करो, जबकि वे चरण में 15 हैं. सभी समय अंक के लिए दोहराएँ.
  4. भ्रूण आम तौर पर 30 मिनट के भीतर ठीक हो जायेगा. # 5 संदंश के साथ एक सौम्य गति brushing के साथ मृत कोशिकाओं (सफेद) निकालें. उन्हें 18 ° रात भर सी हो जाओ.
  5. विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत, fluorescently लेबल, प्रतिरोपित ऊतकों के साथ सॉर्ट भ्रूण. उन्हें वापस रख 18 डिग्री सेल्सियस 42-43 चरण तक विकसित करने के लिए.
  6. Tricaine में पशुओं anesthetize. इस बिंदु पर, आप एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीरें ले सकता है. उसके बाद आप कर रहे हैं, ठीक है, अनुभाग और immunostain या हित के अपने ऊतक के लिए मार्कर का उपयोग स्वस्थानी संकरण में प्रदर्शन.

चित्रा 1
चित्रा 1. Plexiglass की elastomer भ्रूण पकड़े व्यंजन बनाने के लिए इस्तेमाल किया मोल्ड कास्टिंग के लिए डिजाइन. एक 38 x 38 मिमी गोल कोनों वर्ग (~ गहरी 5 मिमी) Plexiglass का एक टुकड़ा है कि 50 x 50 मिमी वर्ग और 25 मिमी मोटी है किया गया है बाहर कराई. परिपत्र, समान रूप से स्थान कुओं (1.5 मिमी व्यास) प्लास्टिक में एक गहरी मिमी drilled किया गया. Microinjection व्यंजनों के लिए elastomer मोल्ड करने के लिए, हम Plexiglass में Sylgard elastomer डाला और यह जमना करने की अनुमति दी निर्माता निर्देशों के अनुसार. इस elastomer ढालना इंजेक्शन और टोपी अलगाव प्लेटें बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. पशु प्रत्यारोपण करने से पहले छँटाई टोपी महत्वपूर्ण है, के रूप में अभिव्यक्ति भिन्न हो सकते हैं बाईं तरफ के पशु टोपी mCherry समान रूप से ऊतक भर जबकि दाईं तरफ explant धब्बेदार अभिव्यक्ति है और खारिज किया जाएगा व्यक्त करता है ..

चित्रा 3
चित्रा 3. एक मेजबान tadpऑब्जेक्ट लिंकिंग एंड एम्बेडिंग प्रतिरोपित जानवर टोपी कोशिकाओं से अपने पार्श्व पर एक आंख की तरह संरचना विकसित की है एक फ्लोरोसेंट छवि brightfield छवि पर overlayed है.

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Discussion

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इस वीडियो में, हम क्लासिक Xenopus जीव द्वारा इस्तेमाल की तकनीक है, जो हम जानवर टोपी प्रत्यारोपण परख बनाने पुनर्व्यवस्थित के हमारे संस्करण का प्रदर्शन किया है . कमरे के तापमान पर, Xenopus भ्रूण चरणों 9 और 15 के माध्यम से बहुत जल्दी से विकसित करना. उन्हें 14 में रखकर डिग्री सेल्सियस, भ्रूण के विकास धीमा है और कई और अधिक प्रत्यारोपण एक प्रयोग में किया जा सकता है है. यदि यह बड़े चरणों (> 42/43) भ्रूण को बढ़ने के लिए आवश्यक है, तो हम ट्रांसजेनिक वीनस YFP पशुओं का उपयोग इंजेक्शन बड़े tadpoles में फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेत fades के बाद से, सलाह देते हैं. हम इस परख इस्तेमाल करने के लिए है कि जानवरों की टोपी ऊतक EFTFs या नोगिन के लिए आंख की तरह ऊतक फार्म करने के लिए निर्दिष्ट किया जाता है व्यक्त की स्थापना. यह परख है कि ब्याज की एक जीन (ओं) एक विशेष सेल भाग्य का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है स्थापित करने के लिए एक साधारण परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Acknowledgments

इस काम में अनुसंधान अनुदान से दृष्टिहीनता (कैरियर MEZ और ASV तक विकास पुरस्कार और नेत्र विज्ञान विभाग के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान), ई. Matilda Zeigler (MEZ और ASV) फाउंडेशन और राष्ट्रीय नेत्र संस्थान / (एनआईएच MEZ रोकें द्वारा समर्थित किया गया R01EY015748 और R01EY017964 अनुदान).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

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References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2009).
ऊतक में पशु कैप (अधिनियम) प्रत्यारोपण परख का प्रयोग निर्धारण<em> Xenopus laevis</em
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Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

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