Summary
Nasonia getingembryon dissekerades från Lucillia sericata puppor efter parasitering i 12-24 timmar och tvättades med alkohol och 10% natriumhypokloritlösning för att erhålla bakteriefria embryon. Efter uppfödning av bakteriefria embryon och förmedling av dem med Nasonia-uppfödningsmedium för att växa och utvecklas in vitro, erhölls bakteriefria vuxna Nasonia-växter.
Abstract
Aseptisk uppfödningsteknik är en metod för odling av insekter under sterila eller nästan sterila förhållanden, vilket effektivt kan eliminera påverkan av externa mikroorganismer på insektsmikrobiota och därmed främja den snabba utvecklingen av insektsmikrobiotaforskning. Nasonia (getingsläkte) är en parasitisk getinginsekt som har många fördelar, såsom en kort livslängd, hög genetisk variation, enkel användning etc., och används ofta som ett insektsmodellsystem. Till skillnad från antibiotikabehandling, som bara kan minska antalet mikroorganismer hos djur, kan aseptiska uppfödningstekniker styra både sammansättningen och mängden mikroorganismer hos djur, vilket ytterligare underlättar studien av värd-mikrobinteraktioner. Tidigare versioner av Nasonia uppfödningsmedium (NRM) har dock vissa defekter och problem, såsom en komplex och tidskrävande beredningsprocess, enkel kontaminering av bakterier eller svampar och kort lagringstid. Därför löser denna studie dessa problem genom att optimera verktygen som används i NRM-förberedelseprocessen, lagringsförhållanden och komponentförhållanden. Det optimerade mediet kan möjliggöra förvaring vid -20 °C i minst 3 månader och eliminera risken för NRM-kontaminering vid utfodring av sterila getingar. Detta förbättrar ytterligare överlevnaden och hälsonivån för aseptisk Nasonia, vilket är viktigt för att använda Nasonia som modell för mikrobiell forskning.
Introduction
Bakteriefria djur är djur som inte har några detekterbara levande mikroorganismer och parasiter1. Bakteriefria embryon kan erhållas genom dissekering av modern under aseptiska förhållanden och därefter uppfödas i barriärsystem2. Sådana djur kan användas för att studera effekterna av mikroorganismer på djur, såsom på tarmmikrobioten, immunsystemet och ämnesomsättningen1. Med vissa tekniska medel kan många insekter och till och med däggdjur göras sterila 3,4. Bakteriefria djur har en unik roll och har använts i stor utsträckning inom olika aspekter av mikrobiologisk forskning5. Till exempel har användningen av bakteriefria Nasonia-getingar visat att mikroorganismer kan hjälpa värdar att anpassa sig till nya miljöer under långvarig exogen miljöstress 6,7.
Nasonia parasitoider är små parasitsteklar som injicerar sina ägg i flugornas puppor4. Det finns fyra kända arter av Nasonia, inklusive Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti och Nasonia oneida8. N. vitripennis finns över hela världen, medan de andra tre arterna har begränsade utbredningsområden i Nordamerika4. Nasonia parasitoida getingar betraktas som idealiska modellinsekter på grund av deras egenskaper, såsom lätt odling, kort reproduktionscykel, sekvenserat genom och långvarig diapaus 8,9. De kan användas för att studera olika aspekter av insektsutveckling, genetik, utveckling, beteende och symbios10. Dessutom kan Nasonia parasitoida getingar också hjälpa till att kontrollera skadliga flugor i jordbruk och sjukdom11. Den framgångsrika etableringen av ett sterilt insektssystem innebär två huvudsteg: (1) sterilisering av embryon och (2) tillhandahållande av steril mat till larverna in vitro. För att få steril mat utvecklade Brucker och Bordenstein 12 Nasonia uppfödningsmedium (NRMv1) 2012 genom att använda kemikalier som antibiotika, blekmedel och fetalt bovint serum för att döda bakterier12. Den kemiska steriliseringsmetoden resulterade emellertid i låg överlevnad och eclosionshastigheter av N. vitripennis13. Sedan, 2016, utvecklade Shropshire et al. NRMv2 genom att använda en filtersteriliseringsmetod istället för en kemisk steriliseringsmetod för att eliminera farorna med antibiotika och andra ämnen och optimerade avelsprocessen13. Tyvärr har denna metod fortfarande vissa nackdelar, såsom utmaningarna i samband med beredning och användning av mediet, liksom riskerna för drunkning, undermatning eller uttorkning för embryon, larver och slutna puppor14. Wang och Brucker14 förbättrade nyligen Nasonia uppfödningsmedia version 3 (NRMv3) och bakteriefri uppfödning version 2 (GFRv2) protokoll. Dessa förbättringar minskade kostnaden och medieförbrukningen. NRMv3 har dock en mycket kort lagringstid och är mycket känslig för kontaminering.
Baserat på NRMv3 optimerades lagringsmetoden och näringsförhållandet för NRM-beredningsverktyget i denna studie. Denna metodologiska förfining underlättar användningen av N. vitripennis som modell för mikrobiomstudier. Jämfört med NRMv3 som utvecklats av Wang et al.14, förbättrar det förbättrade verktyget för att pressa Sarcophaga bullata pupa, ett av NRM-råmaterialen, kraftigt produktionseffektiviteten för S. bullata pupa vävnadsvätska jämfört med 60 ml spruta med ett bottenhål som används av Wang et al.14. Vi justerade näringsförhållandet för NRM, vilket ledde till en viss ökning av överlevnadsgraden för bakteriefria Nasonia-getingar utan att påverka deras utvecklingstid. Dessutom packades NRM i centrifugrör med liten kapacitet (1,5 ml) och frystes i ett kylskåp på -20 °C för att förlänga lagringstiden. Det är värt att notera att medan vi använde husflugan Lucilia sericata som värd och källa för NRM-förberedelse, kan detta protokoll sannolikt anpassas för andra Nasonia-värdar som finns tillgängliga i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av bakteriefrittuppfödningsmedium frånNasonia
- Placera de kommersiellt tillgängliga L. sericata pupporna (se Materialförteckning) på en yta som rymmer alla puppor, till exempel en bricka eller ett pappersark. Kassera alla underutvecklade larver, mörka gamla puppar, tomma valpskal, sågspån eller andra föroreningar. Håll endast unga puppor som är brunröda i färg och överför dem till en bägare (cirka 3 000-4 000 puppor).
OBS: Efter att ha utfört många experiment fann man att mediet tillverkat av de mörka gamla pupporna lätt blev mörkt och stoppade utvecklingen av bakteriefria getingar. Detta fenomen uppstod inte när man använde de unga brunröda popparna för att producera medium. Orsaken till detta är fortfarande oklar och kräver ytterligare utredning för att verifiera den. - Tillsätt tillräckligt med avjoniserat vatten till bägaren för att täcka hela ytan av pupporna. Vik in bägarens mun med folie eller gasväv, skaka bägaren för att rengöra föroreningarna på poppens yta och häll sedan ut vattnet. Upprepa tre till fem gånger.
- Placera de rengjorda L. sericata pupporna i filterbehållaren på en vitlökspress, pressa hårt och samla vävnadsvätskan i L. sericata pupporna i ett 50 ml sterilt centrifugrör. Häll sedan ut pupporna och lägg nya puppor i vitlökspressens filtertank tills alla är pressade.
OBS: Jämfört med nålsträngsprutningsanordningen som används av Wang et al.14 är vitlökspressen bekvämare och kan separera interstitiell vätska mer noggrant. Detta framsteg lägger grunden för storskalig produktion och långtidslagring av NRM. - Centrifugera blandningen vid 4 °C (25 000 x g) i 10 minuter. Efter centrifugering separeras blandningen i tre lager från botten till toppen: sedimentskikt, proteinskikt och fettlager (figur 1).
- För att förhindra igensättning under filtrering, aspirera proteinskiktet med en 18 G steril nål och överför den till ett nytt 50 ml koniskt sterilt polypropencentrifugrör.
- Tillsätt kommersiellt flytande Drosophila-medium (se materialförteckning) till proteinextraktet i förhållandet 1:1.
OBS: Mer praktiskt kommersialiserad L. sericata användes som värd- och NRM-råmaterial jämfört med NRMv3. Därför justerades näringsförhållandet från 1: 2 till 1: 1 baserat på NRMv3, vilket var mer lämpligt för tillväxt och utveckling av steril Nasonia (figur 2). - Filtrera det blandade mediet (Drosophila-medium och proteinextrakt från L. sericata pupa) med hjälp av ett vakuumfiltreringssystem med olika porstorlekar (8, 1,2, 0,8 och 0,45 μm; se materialförteckning) för att avlägsna partiklar av olika storlekar. För att förhindra igensättning, byt filterpapper när flödet saktar ner.
OBS: Användningen av ett nytt 50 ml sterilt centrifugrör krävs för varje filtrering. - Centrifugera vätskan igen vid 4 °C (15 000 x g) i 10 minuter och sterilisera supernatantmediet genom ett 0,22 μm sprutfilter. Upprepa stegen ovan en gång.
- Förvara odlingssubstratet vid -20 °C efter alikvotering (figur 3A) för långtidsförvaring.
Anmärkning: För att förhindra kontaminering och upprepad frysning och upptining rekommenderas att varje rör av NRM endast öppnas en gång när odlingsmediet används efter förpackning (figur 3A).
2. Bakteriefri äggsamling
- För att säkerställa ett stabilt förhållande mellan män och kvinnor hos avkomman, placera pupporna i en Drosophila-injektionsflaska under valpstadiet i förhållandet 50 honor till 15 hanar på grund av deras haploida genetiska egenskaper (hanar utvecklas från haploida celler, medan honor utvecklas från diploida celler som är resultatet av befruktade ägg)4,15.
- Efter att ha kommit fram till vuxna, låt män och kvinnor para sig i 1,5 dagar och lägg sedan cirka 40 L. sericata puppar i flaskan. Inom 12-24 timmar efter parasitering, använd en steril dissekeringsnål för att försiktigt öppna ena änden av valpskalet under ett stereomikroskop (figur 4).
- Håll den andra änden för hand och hitta getingembryon. Använd en dissekeringsnål för att överföra embryon från ytan av L. sericata puppvävnad till en steril cellsil med fosfatbuffrad saltlösning (PBS)14.
OBS: Äldre L. sericata puppor bör användas för parasitism eftersom den torra L. sericata puppvävnaden är lättare att överföra embryon . För att säkerställa en smidig överföring av ägg från L. sericata puppvävnadsytan, försök att vara försiktig så att du inte punkterar vävnaden när dissekeringsnålen öppnar valphöljet så att interstitiell vätska inte rinner ut.
- Placera 20-30 embryon på en cellsil och tvätta dem jämnt med 1 000 μL 10% kommersiell natriumhypokloritlösning (se materialtabell), följt av ytterligare en tvätt med 1 000 μL 1x steril PBS. Tvätta sedan en gång med 1 000 μL 70 % etanollösning och tvätta tre gånger med 1 000 μL 1x steril PBS.
- Placera först ett 5 mm diameter polypropennätark (se materialförteckning) som har förfuktats med 1x PBS i en 24-brunnsplatta. Borsta sedan försiktigt getingembryona på cellsilen på polypropennätarket med en steriliserad liten borste. Detta kan göras för alla fyra brunnarna i en vertikal kolonn på 24-brunnsplattan.
3. Bakteriefri getinguppfödning
- Tillsätt 50 μL NRM till varje brunn i en laminär flödeshuv. För att upprätthålla en fuktig miljö för tillväxt, tillsätt 1 ml sterilt vatten mellan varje brunn i 24-brunnsplattan. En liten bägare som innehåller 30 ml sterilt vatten kan också placeras i den 5 L sterila plastlådan med 24-brunnsplattan.
- Under hela experimentet, håll den sterila plastlådan och 24-brunnsplattan i en klimatkammare vid en konstant temperatur av 25 ± 2 ° C och under konstant ljus.
- Innan du överför och lägger till NRM varje dag, tina den frysta NRM på en laminär flödesbänk. I en steril miljö, använd alkoholdesinficerad pincett för att överföra polypropennätet med larver på det från en brunn till en annan. Tillsätt slutligen 50 μl NRM som har jämnats med rumstemperatur (figur 3B). Upprepa ovanstående operationer varje dag tills puppar observeras.
OBS: Med utvecklingen av getingar bör mängden NRM ökas på lämpligt sätt för att säkerställa att de bakteriefria getingarna har tillräckligt med näring. Till exempel försågs de fjärde instarlarverna med 60 till 70 μL NRM. Eftersom olika utvecklingsstadier kan samexistera i samma brunn, använd en steriliserad borste för att överföra ut pupporna. Tillsätt en liten mängd NRM till de återstående larverna. Använd aseptiska tekniker för att undvika mikrobiell invasion och förorening. - Efter matning i 9 till 11 dagar utvecklas mer än 80% av larverna till vita eller gula puppar. Vid denna tidpunkt, flytta filtret till en ren brunnsplatta och sluta tillsätta odlingsmedium för att vänta på stängning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förberedelseeffektiviteten för NRM förbättrades avsevärt genom att förbättra beredningsverktygen. Dessutom eliminerades problemet med NRM-föroreningar i utfodringsprocessen genom att optimera strategin och konserveringsmetoden. Samtidigt hade den justerade NRM ett mer lämpligt näringsförhållande för tillväxt och utveckling av bakteriefria getingar med L. sericata som värdar. Överlevnaden för bakteriefria getingar från larver till puppor förbättrades signifikant jämfört med bakteriefria getingar uppfödda med NRMv3 med GFRv2 (figur 2). Vidare var generationsperioden inte annorlunda mellan de aseptiska getingarna och de konventionellt uppfödda getingarna (cirka 14 dagar per generation) (figur 5). Dessa förbättringar är mycket betydelsefulla för att utveckla Nasonia-modellorganismen och studera värd-mikroorganisminteraktionsmekanismen.
Figur 1: Blandning separerad genom centrifugering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Överlevnadsgraden för larver till puppor i varje transwell. Överlevnaden förbättrades signifikant jämfört med bakteriefria honor som fötts upp på NRMv3 med GFRv2 (två oberoende T-prov, *p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematiskt diagram över dispensering av NRM och bakteriefri getinguppfödning . (A) Den filtrerade NRM från 50 ml centrifugröret alikvoterades till sterila 1,5 ml centrifugrör och frystes. Varje rör av NRM öppnades bara en gång. (B) Det fanns ett polypropennätskikt under embryona från Nasonia-getingarna . Centrifugröret innehöll den förpackade NRM. "Dag 14-ish" betyder vuxen uppkomst inträffar ungefär den 14: e dagen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bilder av överförda getingägg under stereomikroskopet. Äggen som läggs av Nasonia-getingen ligger inom den röda streckade rutan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av utvecklingstid. Utvecklingstiden för bakteriefria honor (cirka 14 dagar) skilde sig inte signifikant från den för konventionellt uppfödda getingar vid användning av den förbättrade NRM i denna studie (två oberoende prov T-test, ns, inte signifikant, p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tillämpningen av detekteringstekniker med hög genomströmning som genomik och metabolomik har forskare gradvis insett att det finns enorm genetisk mångfald och metabolisk komplexitet i tarmmikrobiota16. Dessa symbiotiska bakterier är nära besläktade med olika fysiologiska eller patologiska tillstånd, såsom värdnäringsmetabolism, tumörer, immunitet och åldrande genom komplexa interaktioner med värden17. Forskningen relaterad till nätverket av sammansättningen och funktionen hos den mikrobiella populationen i värden är emellertid mycket svår eftersom sammansättningen av mikroorganismer i varje naturlig individ inte är exakt densamma16. Därför behövs en idealisk modell för att utforska interaktionen och relaterade mekanismer mellan mikroorganismer och värdar. Nasonia-getingar kan användas som en idealisk modell inom mikrobiomfältet på grund av dess många biologiska fördelar och egenskaperna hos bakteriefria getingar6. Jämfört med antibiotikabehandling möjliggör användning av sterila djur kontroll över sammansättningen och mängden mikroorganismer, vilket är avgörande för att studera mikrobiell funktion. Dessutom kan antibiotikabehandling leda till flera biverkningar, inklusive antibiotikaresistens, tarmdysfunktion och tarmbarriärskada18. Därför är utvecklingen av en effektivare metod för att erhålla bakteriefria getingar av stor betydelse för att studera värd-mikrobiominteraktioner.
Förvärvet av bakteriefri Nasonia omfattar huvudsakligen två steg - att erhålla sterila embryon och tillhandahålla steril mat. Embryona erhölls genom dissekering av L. sericata puppor 12-24 h efter N. vitripennis parasitering under ett stereoskop13. Detta steg krävde tillräckligt med skicklighet för att flytta embryon snabbare och utan att skada dem till cellsilen. Baserat på erfarenhet är det bekvämare att dissekera de gamla L. sericata pupporna som är svarta. Unga röda L. sericata puppor föredras dock för att förbereda NRM.
Dessutom berodde den normala utvecklingen av sterila embryon på produktionen av steril mat och operationsprocessen för att byta medium varje dag12. Vi fann att den huvudsakliga föroreningskällan för uppfödning av bakteriefria getingar av Wang et al.s14 GFRv2 var NRM. Därför packades kulturen och förvarades i kylskåp vid -20 °C i den aktuella studien, vilket säkerställer att varje medium bara öppnas en gång. Detta hade inte bara ingen effekt på tillväxten och utvecklingen av Nasonia-getingar , utan förlängde också odlingsmediets lagringstid kraftigt och eliminerade risken för NRM-kontaminering. Totalt ökade denna metod ytterligare överlevnadsgraden för aseptiska getingar.
Den nuvarande metoden har dock fortfarande vissa nackdelar. Till exempel kan den dagliga överföringen av sterila embryon i en platta med 24 brunnar öka risken för förorening. Dessutom är processen att klämma en massa flugpuppar också tidskrävande och arbetsintensiv. Om de specifika näringsämnena som spelar en roll i flugpupporna kan identifieras kan de köpas och läggas direkt till mediet, vilket avsevärt skulle förbättra effektiviteten i NRM-beredningen. Det förväntas att denna metod kommer att optimeras ytterligare i framtida forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering: detta arbete stöddes av National Science Foundation of China (32270538), National Key R&D Program of China (2022YFF0710603), Natural Science Foundation of Beijing (6222046) och CAS strategiska finansiering via CAS-CSIRO-finansieringssystemet (152111KYSB20210011) som tilldelades G.H.W. Författarbidrag: alla författare utvecklade granskningens omfattning och fokus och bidrog till skrivandet av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
