Summary
나소니아 말벌 배아를 12-24시간 동안 기생시킨 후 Lucillia sericata 번데기에서 해부하고 알코올과 10% 차아염소산나트륨 용액으로 세척하여 무균 배아를 얻었습니다. 무균 배아를 사육하고 시험관 내에서 성장 및 발달할 수 있도록 Nasonia 사육 배지를 공급한 후 무균 Nasonia 성인을 얻었습니다.
Abstract
무균 사육 기술은 무균 또는 거의 무균 상태에서 곤충을 배양하는 방법으로 곤충 미생물군에 대한 외부 미생물의 영향을 효과적으로 제거하여 곤충 미생물군 연구의 급속한 발전을 촉진할 수 있습니다. 나소니아(말벌속)는 기생 말벌 곤충으로 수명이 짧고 유전적 변이가 높으며 조작이 용이한 등 많은 장점을 가지고 있으며 곤충 모델 시스템으로 널리 사용됩니다. 동물의 미생물 수만 줄일 수 있는 항생제 처리와 달리 무균 사육 기술은 동물의 미생물 구성과 양을 모두 제어할 수 있어 숙주-미생물 상호 작용 연구를 더욱 용이하게 합니다. 그러나 이전 버전의 나소니아 사육 배지(NRM)는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 준비 과정, 박테리아 또는 곰팡이에 의한 쉬운 오염, 짧은 보관 시간 등 몇 가지 결함과 문제가 있습니다. 따라서 본 연구에서는 NRM 준비 과정에서 사용되는 도구, 보관 조건 및 구성 요소 비율을 최적화하여 이러한 문제를 해결합니다. 최적화된 배지는 -20°C에서 최소 3개월 동안 보관할 수 있으며 무균 말벌에게 먹이를 주는 동안 NRM 오염 가능성을 제거할 수 있습니다. 이것은 Nasonia를 미생물 연구의 모델로 사용하는 데 중요한 무균 Nasonia의 생존율과 건강 수준을 더욱 향상시킵니다.
Introduction
무균 동물은 검출 가능한 살아있는 미생물과 기생충이 없는 동물이다1. 무균 배아는 무균 상태에서 모체를 해부하여 얻을 수 있으며, 이후 장벽 시스템에서 키울 수 있다2. 이러한 동물은 장내 미생물군, 면역체계 및 신진대사와 같은 동물에 대한 미생물의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있다1. 특정 기술적 수단을 사용하면 많은 곤충과 심지어 포유류까지도 불임이 될 수 있습니다 3,4. 무균 동물은 독특한 역할을 하며 미생물학 연구의 다양한 측면에서 널리 사용되어 왔다5. 예를 들어, 무균 나소니아 말벌을 사용하면 미생물이 숙주가 장기간의 외인성 환경 스트레스 하에서 새로운 환경에 적응하는 데 도움이 될 수 있음이 밝혀졌습니다 6,7.
나소니아 기생충은 파리의 번데기에 알을 주입하는 작은 기생 말벌입니다4. 나소니아에는 나소니아 비트리페니스(Nasonia vitripennis), 나소니아 롱기코르니스(Nasonia longicornis), 나소니아 기라울티(Nasonia giraulti), 나소니아 오네이다 8(Nasonia oneida8) 등 4종이 알려져 있다. N. vitripennis는 전 세계적으로 볼 수 있지만 다른 세 종은 북미에서 제한된 범위를 가지고 있습니다4. 나소니아 기생 말벌은 쉬운 재배, 짧은 번식 주기, 서열 게놈 및 장기 휴면 8,9와 같은 특성 때문에 이상적인 모델 곤충으로 간주됩니다. 곤충의 진화, 유전학, 발달, 행동, 공생의 다양한 측면을 연구하는 데 사용할 수 있다10. 또한, 나소니아 기생 말벌은 농업과 질병에서 해로운 파리를 방제하는 데 도움이 될 수 있다11. 무균 곤충 시스템의 성공적인 확립에는 (1) 배아의 살균과 (2) 시험관 내에서 유충에게 무균 식품을 제공하는 두 가지 주요 단계가 포함됩니다. 멸균 식품을 얻기 위해 Brucker와 Bordenstein 12는 2012년에 항생제, 표백제, 소 태아 혈청과 같은 화학 물질을 사용하여 박테리아12를 죽임으로써 Nasonia 사육 배지(NRMv12)를 개발했습니다. 그러나 화학적 멸균 방법은 N. vitripennis13의 낮은 생존율과 퇴실률을 초래했다. 그 후 2016년 Shropshire et al. 항생제 및 기타 물질의 유해성을 제거하기 위해 화학적 살균법 대신 필터 살균법을 사용하여 NRMv2를 개발하고 육종 과정을 최적화했다13. 불행하게도, 이 방법은 여전히 몇 가지 단점을 가지고 있는데, 예를 들어 배지 준비 및 사용과 관련된 어려움, 배아, 유충 및 폐쇄 번데기에 대한 익사, 영양 부족 또는 탈수의 위험도 있다14. Wang과 Brucker14는 최근 Nasonia 양육 미디어 버전 3 (NRMv3)과 무균 사육 버전 2 (GFRv2) 프로토콜을 개선했습니다. 이러한 개선으로 비용과 미디어 소비가 감소했습니다. 그러나 NRMv3는 보관 시간이 매우 짧고 오염에 매우 취약합니다.
NRMv3를 기반으로 NRM 준비 도구 보관 방법과 영양소 비율이 이 연구에서 최적화되었습니다. 이러한 방법론적 개선은 N. vitripennis를 마이크로바이옴 연구의 모델로 사용하는 것을 용이하게 합니다. Wang et al.14에 의해 개발된 NRMv3와 비교하여 NRM 원료 중 하나인 Sarcophaga bullata pupa를 압착하기 위한 개선된 도구는 Wang et al.14에서 사용한 바닥 구멍이 있는 60mL 주사기에 비해 S. bullata 번데기 조직액의 생산 효율을 크게 향상시킵니다. NRM의 영양소 비율을 조정하여 발달 시간에 영향을 미치지 않으면서 무균 나소니아 말벌의 생존율을 어느 정도 증가시켰습니다. 또한, NRM을 소용량 원심분리관(1.5 mL)에 포장하고 -20°C 냉장고에서 냉동시켜 보관 시간을 연장하였다. NRM 준비를 위한 숙주 및 소스로 집파리 Lucilia sericata를 사용했지만 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 다른 Nasonia 숙주에 적용될 수 있습니다.
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Protocol
1. 무균 나소니아 사육배지 제조
- 시중에서 판매되는 L. sericata 번데기( 재료 표 참조)를 쟁반이나 종이와 같이 모든 번데기를 수용할 수 있는 표면에 놓습니다. 발육이 저조한 유충, 짙은 늙은 번데기, 빈 번데기 껍질, 톱밥 또는 기타 불순물은 버리십시오. 갈색을 띤 붉은 색의 어린 번데기 만 보관하고 비커 (약 3,000-4,000 마리의 번데기)로 옮깁니다.
참고: 많은 실험을 수행한 후 어두운 오래된 번데기로 만든 배지가 쉽게 어두워지고 무균 말벌의 발달을 멈추는 것으로 나타났습니다. 이 현상은 어린 갈색-적색 번데기를 사용하여 배지를 생산할 때 발생하지 않았습니다. 그 이유는 아직 불분명하며 이를 확인하기 위해 추가 조사가 필요합니다. - 번데기의 전체 표면을 덮을 수 있도록 비커에 충분한 탈이온수를 추가합니다. 비커의 입을 은박지나 거즈로 감싸고 비커를 흔들어 번데기 표면의 불순물을 닦은 다음 물을 붓습니다. 3-5 번 반복하십시오.
- 세척한 L. sericata 번데기를 마늘 프레스의 필터 탱크에 넣고 세게 짜낸 다음 L. sericata 번데기의 조직액을 50mL 멸균 원심분리기 튜브에 수집합니다. 그런 다음 번데기 찌꺼기를 붓고 마늘 프레스의 필터 탱크에 새 번데기를 모두 짜낼 때까지 넣습니다.
참고: Wang et al.14에서 사용한 바늘 압출 장치에 비해 마늘 프레스가 더 편리하고 간질액을 더 철저하게 분리할 수 있습니다. 이러한 발전은 NRM의 대규모 생산 및 장기 보관을 위한 토대를 마련합니다. - 혼합물을 4°C(25,000 x g)에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 혼합물은 침전물층, 단백질층, 지방층의 세 층으로 아래에서 위로 분리됩니다(그림 1).
- 여과 중 막힘을 방지하려면 18G 멸균 바늘을 사용하여 단백질 층을 흡인하고 새로운 50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 상업용 액체 초파리 배지( 재료 표 참조)를 단백질 추출물에 1:1 비율로 추가합니다.
참고: NRMv3에 비해 더 편리한 상용화된 L. serichata 가 호스트 및 NRM 원료로 사용되었습니다. 따라서 영양 비율은 NRMv3를 기준으로 1:2에서 1:1로 조정되었으며, 이는 멸균 Nasonia 의 성장 및 발달에 더 적합했습니다(그림 2). - 다양한 공극 크기(8, 1.2, 0.8 및 0.45μm, 재료 표 참조)를 가진 진공 여과 시스템을 사용하여 혼합 배지(초파리 배지 및 L. sericata pupa의 단백질 추출물)를 여과하여 다양한 크기의 입자를 제거합니다. 막힘을 방지하려면 흐름이 느려질 때 여과지를 교체하십시오.
알림: 각 여과에는 새 50mL 멸균 원심분리기 튜브를 사용해야 합니다. - 액체를 다시 4°C(15,000 x g)에서 10분 동안 원심분리하고 0.22μm 주사기 필터를 통해 상등액 배지를 멸균합니다. 위의 단계를 한 번 반복합니다.
- 장기 보관을 위해 분취 후 배양 배지를 -20°C에서 보관(그림 3A).
알림: 오염과 반복적인 동결 및 해동을 방지하기 위해 포장 후 배양 배지를 사용할 때 NRM의 각 튜브를 한 번만 여는 것이 좋습니다(그림 3A).
2. 무균 계란 수집
- 자손의 안정적인 수컷 대 암컷 비율을 보장하기 위해 번데기 단계에서 번데기를 반수체 유전적 특성 때문에 암컷 50마리 대 수컷 15마리의 비율로 초파리 바이알에 넣습니다(수컷은 반수체 세포에서 발달하고 암컷은 수정란에서 유래한 이배체 세포에서 발달함)4,15.
- 성충이 된 후 수컷과 암컷이 1.5일 동안 짝짓기를 하도록 한 다음 약 40L. 세리카타 번데기를 바이알에 넣습니다. 기생 후 12-24시간 이내에 멸균 해부 바늘을 사용하여 실체 현미경으로 번데기 껍질의 한쪽 끝을 조심스럽게 엽니다(그림 4).
- 다른 쪽 끝을 손으로 잡고 말벌 배아를 찾으십시오. 해부 바늘을 사용하여 L. sericata 번데기 조직 표면에서 인산염 완충 식염수(PBS)가 있는 멸균 세포 여과기로 배아를 옮깁니다14.
참고: 오래된 L. sericata 번데기는 건조한 L. sericata 번데기 조직이 배아를 이식하기 쉽기 때문에 기생에 사용해야 합니다. L. sericata 번데기 조직 표면에서 알을 원활하게 옮기기 위해 해부 바늘이 번데기 케이스를 열 때 조직에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하여 간질액이 흘러나오지 않도록 합니다.
- 20-30개의 배아를 세포 여과기에 놓고 1,000μL의 10% 상업용 차아염소산나트륨 용액( 재료 표 참조)으로 고르게 세척한 다음 1,000μL의 1x 멸균 PBS로 다시 세척합니다. 그런 다음 1,000 μL의 70% 에탄올 용액으로 한 번 세척하고 1,000 μL의 1x 멸균 PBS로 세 번 세척합니다.
- 먼저, 1x PBS로 미리 습윤된 5mm 직경의 폴리프로필렌 메쉬 시트( 재료 표 참조)를 24웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 멸균 된 작은 브러시를 사용하여 세포 여과기의 말벌 배아를 폴리 프로필렌 메쉬 시트에 부드럽게 브러시로 닦습니다. 이는 24-웰 플레이트의 수직 컬럼 내의 4개의 웰 모두에 대해 수행될 수 있다.
3. 무균 말벌 사육
- 층류 후드의 각 웰에 50μL의 NRM을 추가합니다. 성장을 위한 습한 환경을 유지하려면 24웰 플레이트의 각 웰 사이에 1mL의 멸균수를 추가합니다. 30mL의 멸균수가 들어 있는 작은 비커를 24웰 플레이트와 함께 5L 멸균 플라스틱 상자에 넣을 수도 있습니다.
- 전체 실험에 걸쳐, 멸균 플라스틱 상자 및 24-웰 플레이트를 25 ± 2°C의 일정한 온도 및 일정한 빛 하에 기후 챔버에 보관한다.
- 매일 NRM을 옮기고 추가하기 전에 층류 벤치에서 냉동 NRM을 해동하십시오. 무균 환경에서 알코올 소독 핀셋을 사용하여 유충이있는 폴리 프로필렌 메쉬를 한 우물에서 다른 우물로 옮깁니다. 마지막으로 실온에서 평형을 이룬 NRM 50μL를 추가합니다(그림 3B). 번데기가 관찰 될 때까지 매일 위의 작업을 반복하십시오.
알림: 말벌의 발달과 함께 무균 말벌이 충분한 영양을 섭취할 수 있도록 NRM의 양을 적절하게 늘려야 합니다. 예를 들어, 네 번째 instar 유충에는 60 내지 70 μL의 NRM이 공급되었습니다. 같은 우물에 다른 발달 단계가 공존 할 수 있으므로 멸균 된 브러시를 사용하여 번데기를 옮깁니다. 나머지 유충에 소량의 NRM을 첨가하십시오. 미생물 침입 및 오염을 피하기 위해 무균 기술을 사용하십시오. - 9-11 일 동안 먹이를 먹은 후 유충의 80 % 이상이 흰색 또는 노란색 번데기로 발전합니다. 이때, 필터를 깨끗한 웰 플레이트로 옮기고 배양액 첨가를 중단하여 이클로전을 기다린다.
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Representative Results
NRM의 준비 효율성은 준비 도구를 개선하여 크게 향상되었습니다. 또한 사료 공급 과정에서 NRM 오염 문제는 전략 및 보존 방법을 최적화하여 제거되었습니다. 동시에, 조정된 NRM은 L. sericata 를 숙주로 하는 무균 말벌의 성장과 발달에 더 적합한 영양 비율을 가졌습니다. 유충에서 번데기까지 무균 말벌의 생존율은 GFRv2를 사용하여 NRMv3로 사육한 무균 말벌에 비해 크게 향상되었습니다(그림 2). 또한, 무균 말벌과 전통적으로 사육된 말벌 사이에 생성 기간은 차이가 없었습니다(한 세대에 약 14일)(그림 5). 이러한 개선은 Nasonia 모델 유기체를 개발하고 숙주-미생물 상호 작용 메커니즘을 연구하는 데 매우 중요합니다.
그림 1: 원심분리에 의해 분리된 혼합물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 각 트랜스웰에서 번데기에 대한 유충의 생존율. 생존율은 GFRv2와 함께 NRMv3에서 자란 무균 암컷에 비해 유의하게 향상되었습니다(2개의 독립 표본 T-검정, *p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NRM 분배 및 무균 말벌 사육의 개략도. (A) 50mL 원심분리기 튜브에서 여과된 NRM을 멸균된 1.5mL 원심분리기 튜브에 분주하고 냉동했습니다. NRM의 각 튜브는 한 번만 열렸습니다. (B) Nasonia 말벌의 배아 아래에 폴리프로필렌 메쉬 시트가 있었습니다. 원심분리기 튜브에는 포장된 NRM이 들어 있었습니다. "Day 14-ish"는 약 14일째에 성인이 출현한다는 것을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 실체현미경으로 이식한 말벌 알의 이미지. Nasonia 말벌이 낳은 알은 빨간색 점선 상자 안에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 개발 시간 비교. 무균 암컷의 발달 시간(약 14일)은 이 연구의 개선된 NRM을 사용할 때 전통적으로 사육된 말벌의 발달 시간과 크게 다르지 않았습니다(두 개의 독립 표본 T-검정, ns, 유의하지 않음, p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유전체학(genomics) 및 대사체학(metabolomics)과 같은 고처리량 검출 기술을 적용하면서 연구자들은 장내 미생물군에 엄청난 유전적 다양성과 대사 복잡성이 존재한다는 사실을 점차 깨닫게 되었다16. 이러한 공생 박테리아는 숙주와의 복잡한 상호작용을 통해 숙주의 영양 대사, 종양, 면역 및 노화와 같은 다양한 생리학적 또는 병리학적 상태와 밀접하게 관련된다(17). 그러나, 숙주에서 미생물 집단의 조성 및 기능의 네트워크와 관련된 연구는 각 자연 개체에서의 미생물의 조성이 정확히 동일하지 않기 때문에 매우 어렵다16. 따라서 미생물과 숙주 사이의 상호 작용 및 관련 메커니즘을 탐색하기 위해서는 이상적인 모델이 필요합니다. 나소니아 말벌은 많은 생물학적 장점과 무균 말벌의 특성으로 인해 마이크로바이옴 분야에서 이상적인 모델로 사용될 수 있다6. 항생제 치료와 비교하여 멸균 동물을 사용하면 미생물의 구성과 양을 제어할 수 있으며 이는 미생물 기능을 연구하는 데 중요합니다. 또한 항생제 치료는 항생제 내성, 장 기능 장애, 장 장벽 손상 등 여러 부작용을 유발할 수 있다18. 따라서 무균 말벌을 얻기 위한 보다 효율적인 방법을 개발하는 것은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 연구하는 데 매우 중요합니다.
무균 Nasonia의 획득은 주로 멸균 배아를 획득하고 멸균 식품을 제공하는 두 단계를 포함합니다. 배아는 입체경 하에서 N. vitripennis 기생 후 12-24시간 후에 L. sericata 번데기를 해부하여 얻었다13. 이 단계에는 배아를 세포 여과기에 손상시키지 않고 더 빨리 움직일 수 있는 충분한 기술이 필요했습니다. 경험에 비추어 볼 때, 검은 색 L. sericata 번데기를 해부하는 것이 더 편리합니다. 그러나 어린 붉은 L. sericata 번데기는 NRM을 준비하는 데 선호됩니다.
또한, 무균 배아의 정상적인 발달은 무균 식품의 생산과 매일 배지를 교체하는 조작 과정에 달려있다12. 우리는 Wang et al.의14 GFRv2에 의해 무균 말벌을 기르기 위한 주요 오염원이 NRM이라는 것을 발견했습니다. 따라서 본 연구에서는 배양액을 -20°C의 냉장고에 포장하여 보관하여 각 배지가 한 번만 열리도록 하였다. 이것은 나소니아 말벌의 성장과 발달에 영향을 미치지 않았을 뿐만 아니라 배양 배지의 저장 시간을 크게 연장하고 NRM 오염 가능성을 제거했습니다. 전체적으로,이 방법은 무균 말벌의 생존율을 더욱 증가 시켰습니다.
그러나, 현재의 방법은 여전히 몇 가지 단점을 갖는다. 예를 들어, 24웰 플레이트에서 멸균 배아를 매일 옮기면 오염 위험이 증가할 수 있습니다. 또한, 파리 번데기를 짜내는 과정도 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 파리 번데기에서 역할을 하는 특정 영양소를 식별할 수 있다면 구입하여 배지에 직접 첨가할 수 있어 NRM 준비의 효율성이 크게 향상될 것입니다. 이 방법은 향후 연구에서 더욱 최적화될 것으로 기대됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
자금 지원: 이 작업은 중국 국립 과학 재단(32270538), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2022YFF0710603), 베이징 자연 과학 재단(6222046) 및 CAS-CSIRO 자금 지원 계획(152111KYSB20210011)을 통한 CAS 전략적 자금 지원으로 GHW에 수여되었습니다. 저자 기여: 모든 저자는 검토의 범위와 초점을 개발하고 원고 작성에 기여했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
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