Summary
Эмбрионы осы Nasonia препарировали из куколок Lucillia sericata после паразитирования в течение 12-24 ч и промывали спиртом и 10% раствором гипохлорита натрия для получения безмикробных эмбрионов. После выращивания безмикробных эмбрионов и снабжения их средой для выращивания Nasonia для роста и развития in vitro были получены взрослые особи Nasonia без микробов.
Abstract
Технология асептического выращивания – это метод культивирования насекомых в стерильных или почти стерильных условиях, который позволяет эффективно исключить влияние внешних микроорганизмов на микробиоту насекомых и тем самым способствовать быстрому развитию исследований микробиоты насекомых. Nasonia (род ос) - это паразитическое насекомое-оса, которое имеет много преимуществ, таких как короткая продолжительность жизни, высокая генетическая изменчивость, простота в эксплуатации и т. д., и широко используется в качестве модельной системы насекомых. В отличие от лечения антибиотиками, которое может только уменьшить количество микроорганизмов у животных, методы асептического выращивания могут контролировать как состав, так и количество микроорганизмов у животных, что еще больше облегчает изучение взаимодействий хозяина и микроба. Однако предыдущие версии среды для выращивания Nasonia (NRM) имеют некоторые дефекты и проблемы, такие как сложный и трудоемкий процесс приготовления, легкое загрязнение бактериями или грибками и короткое время хранения. Таким образом, данное исследование решает эти проблемы за счет оптимизации инструментов, используемых в процессе подготовки NRM, условий хранения и соотношения компонентов. Оптимизированная среда может обеспечить хранение при -20 °C в течение не менее 3 месяцев и исключить возможность загрязнения NRM во время кормления стерильных ос. Это еще больше улучшает выживаемость и уровень здоровья асептической Nasonia, что важно для использования Nasonia в качестве модели для микробных исследований.
Introduction
Безмикробные животные - это животные, у которых нет обнаруживаемых живых микроорганизмов и паразитов1. Эмбрионы, не содержащие зародышей, могут быть получены путем вскрытия матери в асептических условиях и впоследствии выращены в барьерных системах2. Такие животные могут быть использованы для изучения воздействия микроорганизмов на животных, таких как кишечная микробиота, иммунная система и метаболизм1. С помощью определенных технических средств многие насекомые и даже млекопитающие могут быть стерильны 3,4. Безмикробные животные играют уникальную роль и широко используются в различных аспектах микробиологических исследований5. Например, использование безмикробных ос Nasonia показало, что микроорганизмы могут помочь хозяевам адаптироваться к новым условиям в условиях длительного экзогенного стрессаокружающей среды 6,7.
Паразитоиды Nasonia - это мелкие паразитические осы, которые впрыскивают свои яйца в куколок мух4. Известно четыре вида Nasonia, в том числе Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti и Nasonia oneida8. N. vitripennis можно найти по всему миру, в то время как три других вида имеют ограниченный ареал в Северной Америке4. Паразитоидные осы Nasonia считаются идеальными модельными насекомыми из-за их характеристик, таких как простота выращивания, короткий цикл размножения, секвенированный геном и длительная диапауза 8,9. Их можно использовать для изучения различных аспектов эволюции насекомых, генетики, развития, поведения и симбиоза10. Кроме того, паразитоидные осы Nasonia также могут помочь в борьбе с вредными мухами в сельском хозяйстве и болезнями11. Успешное создание стерильной системы насекомых включает в себя два основных этапа: (1) стерилизацию эмбрионов и (2) предоставление стерильной пищи личинкам in vitro. Чтобы получить стерильную пищу, Брукер и Борденштейн 12 разработали среду для выращивания Nasonia (NRMv1) в 2012 году с использованием химических веществ, таких как антибиотики, отбеливатель и эмбриональная бычья сыворотка, для уничтожения бактерий12. Однако метод химической стерилизации привел к низкой выживаемости и скорости экклозии N. vitripennis13. Затем, в 2016 году, Shropshire et al. разработали NRMv2 с использованием метода стерилизации фильтра вместо метода химической стерилизации для устранения опасности антибиотиков и других веществ и оптимизировали процесс размножения13. К сожалению, этот метод все еще имеет некоторые недостатки, такие как проблемы, связанные с подготовкой и использованием среды, а также риски утопления, недокармливания или обезвоживания эмбрионов, личинок и закрытых куколок14. Wang and Brucker14 недавно улучшили протоколы выращивания Nasonia версии 3 (NRMv3) и безмикробного выращивания версии 2 (GFRv2). Эти улучшения снизили стоимость и потребление мультимедиа. Однако NRMv3 имеет очень короткое время хранения и очень подвержен загрязнению.
Основываясь на NRMv3, в этом исследовании были оптимизированы метод хранения инструмента для подготовки NRM и соотношение питательных веществ. Это методологическое уточнение облегчает использование N. vitripennis в качестве модели для исследований микробиома. По сравнению с NRMv3, разработанным Wang et al.14, улучшенный инструмент для выдавливания куколки Sarcophaga bullata, одного из сырьевых материалов NRM, значительно повышает эффективность производства тканевой жидкости куколки S. bullata по сравнению со шприцем объемом 60 мл с нижним отверстием, используемым Wang et al.14. Мы скорректировали соотношение питательных веществ NRM, что привело к определенному увеличению выживаемости безмикробных ос Nasonia, не влияя на время их развития. Кроме того, NRM упаковывали в центрифужные пробирки малой емкости (1,5 мл) и замораживали в холодильнике с температурой -20 °C, чтобы продлить срок хранения. Стоит отметить, что, хотя мы использовали комнатную муху Lucilia sericata в качестве хозяина и источника для получения NRM, этот протокол, вероятно, может быть адаптирован для других хозяев Nasonia, которые доступны в лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление безмикробнойсреды для выращиваниянасонии
- Поместите имеющихся в продаже куколок L. sericata (см. Таблицу материалов) на поверхность, на которой могут разместиться все куколки, например, на лоток или лист бумаги. Выбросьте все недоразвитые личинки, темные старые куколки, пустые оболочки куколок, опилки или другие примеси. Оставляйте только молодых куколок коричневато-красного цвета и переносите их в стакан (примерно 3000-4000 куколок).
ПРИМЕЧАНИЕ: После проведения многих экспериментов было обнаружено, что среда, сделанная из темных старых куколок, легко темнела и останавливала развитие безмикробных ос. Это явление не возникало при использовании молодых коричневато-красных куколок для получения среды. Причина этого до сих пор неясна и требует дальнейшего расследования для ее проверки. - Добавьте в стакан достаточное количество деионизированной воды, чтобы покрыть всю поверхность куколок. Оберните горлышко стакана фольгой или марлей, встряхните стакан, чтобы очистить поверхность куколок от загрязнений, а затем вылейте воду. Повторите три-пять раз.
- Поместите очищенные куколки L. sericata в фильтрующий резервуар чесночного пресса, сильно отожмите и соберите тканевую жидкость куколок L. sericata в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл . Затем вылейте куколку и поместите новые куколки в фильтрующий резервуар чесночного пресса, пока все не сожмется.
ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с игольчатым экструзионным устройством, используемым Wang et al.14, чесночный пресс более удобен и может более тщательно отделять интерстициальную жидкость. Это усовершенствование закладывает основу для крупномасштабного производства и длительного хранения NRM. - Центрифугируйте смесь при 4 °C (25 000 x g) в течение 10 мин. После центрифугирования смесь будет разделена на три слоя снизу вверх: слой осадка, белковый слой и жировой слой (рис. 1).
- Чтобы предотвратить засорение во время фильтрации, аспирируйте белковый слой с помощью стерильной иглы 18 г и перенесите его в новую коническую стерильную полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Добавьте коммерческую жидкую среду дрозофилы (см. Таблицу материалов) в белковый экстракт в соотношении 1:1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более удобный коммерциализированный L. sericata использовался в качестве сырья-хозяина и NRM по сравнению с NRMv3. Таким образом, соотношение питательных веществ было скорректировано с 1:2 до 1:1 на основе NRMv3, который больше подходил для роста и развития стерильных Nasonia (рис. 2). - Фильтруют смешанную среду (среду дрозофилы и белковый экстракт куколки L. sericata ) с помощью вакуумной системы фильтрации с различными размерами пор (8, 1,2, 0,8 и 0,45 мкм; см. Таблицу материалов) для удаления частиц разного размера. Чтобы предотвратить засорение, меняйте фильтровальную бумагу при замедлении потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой фильтрации требуется использование новой стерильной центрифужной пробирки объемом 50 мл. - Снова центрифугируйте жидкость при 4 °C (15 000 x g) в течение 10 мин и стерилизуйте надосадочную среду через шприцевой фильтр 0,22 мкм. Повторите описанные выше шаги один раз.
- Хранят питательную среду при -20 °C после аликвотирования (рис. 3А) для длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения загрязнения и повторного замораживания и оттаивания рекомендуется открывать каждую пробирку NRM только один раз при использовании питательной среды после упаковки (рис. 3A).
2. Сбор яиц без микробов
- Чтобы обеспечить стабильное соотношение самцов и самок у потомства, поместите куколок во флакон дрозофилы на стадии куколки в соотношении 50 самок к 15 самцам из-за их гаплоидных генетических характеристик (самцы развиваются из гаплоидных клеток, а самки развиваются из диплоидных клеток, которые образуются в результате оплодотворенных яйцеклеток)4,15.
- После выхода во взрослую особь дайте самцам и самкам спариваться в течение 1,5 дней, а затем положите во флакон около 40 л куколок серикаты . В течение 12-24 ч после паразитирования стерильной рассекающей иглой осторожно вскрывают один конец оболочки куколки под стереомикроскопом (рис. 4).
- Возьмитесь за другой конец рукой и найдите зародыши осы. Используйте рассекающую иглу для переноса эмбрионов с поверхности ткани куколки L. sericata в стерильное клеточное ситечко с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS)14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более старые куколки L . sericata следует использовать для паразитирования, потому что сухая ткань куколки L. sericata легче переносит эмбрионы. Чтобы обеспечить плавный перенос яиц с поверхности ткани куколки L. sericata , старайтесь быть осторожными, чтобы не проколоть ткань, когда рассекающая игла открывает корпус куколки, чтобы интерстициальная жидкость не вытекла.
- Поместите 20-30 эмбрионов на клеточный фильтр и равномерно промойте их 1000 мкл 10% коммерческого раствора гипохлорита натрия (см. Таблицу материалов), а затем еще раз промывка 1000 мкл 1x стерильного PBS. Затем один раз промойте 1,000 мкл 70% раствора этанола и трижды промойте 1,000 мкл 1x стерильного PBS.
- Во-первых, поместите лист полипропиленовой сетки диаметром 5 мм (см. Таблицу материалов), предварительно смачиваемый 1x PBS, в пластину с 24 лунками. Затем, используя стерилизованную маленькую щетку, аккуратно смахните зародыши ос с клеточного ситечка на лист полипропиленовой сетки. Это может быть сделано для всех четырех скважин в вертикальной колонне 24-луночной плиты.
3. Безмикробное выращивание ос
- Добавьте 50 мкл NRM в каждую лунку в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Чтобы поддерживать влажную среду для роста, добавьте 1 мл стерильной воды между каждой лункой в 24-луночную пластину. Небольшой стакан, содержащий 30 мл стерильной воды, также может быть помещен в стерильную пластиковую коробку объемом 5 л с 24-луночной пластиной.
- На протяжении всего эксперимента храните стерильный пластиковый ящик и 24-луночную пластину в климатической камере при постоянной температуре 25 ± 2 °C и при постоянном освещении.
- Перед переносом и добавлением NRM каждый день размораживайте замороженный NRM на скамье с ламинарным потоком. В стерильной среде используйте продезинфицированный спиртом пинцет для переноса полипропиленовой сетки с находящимися на ней личинками из одной лунки в другую. Наконец, добавьте 50 мкл NRM, который был уравновешен до комнатной температуры (рис. 3B). Повторяйте вышеуказанные операции каждый день до тех пор, пока не будут замечены куколки.
ПРИМЕЧАНИЕ: С развитием ос количество NRM должно быть соответствующим образом увеличено, чтобы обеспечить достаточное питание ос, свободных от микробов. Например, личинки четвертого возраста получали от 60 до 70 мкл NRM. Поскольку разные стадии развития могут сосуществовать в одной и той же лунке, используйте стерилизованную щетку для переноса куколок. Добавьте небольшое количество NRM к оставшимся личинкам. Используйте асептические методы, чтобы избежать микробной инвазии и загрязнения. - После кормления в течение 9-11 дней более 80% личинок развиваются в белые или желтые куколки. В это время переместите фильтр в чистую лунку и прекратите добавлять питательную среду, чтобы дождаться экзоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективность подготовки NRM была значительно улучшена за счет совершенствования инструментов подготовки. Кроме того, проблема загрязнения NRM в процессе кормления была устранена за счет оптимизации стратегии и метода сохранения. В то же время скорректированный NRM имел более подходящее соотношение питательных веществ для роста и развития безмикробных ос с L. sericata в качестве хозяев. Выживаемость безмикробных ос от личинок до куколок была значительно улучшена по сравнению с безмикробными осами, выращенными с помощью NRMv3 с использованием GFRv2 (рис. 2). Кроме того, период генерации не различался между асептическими осами и осами, выращиваемыми традиционным способом (около 14 дней в поколении) (рис. 5). Эти улучшения очень важны для разработки модельного организма Nasonia и изучения механизма взаимодействия хозяина и микроорганизма.
Рисунок 1: Смесь, разделенная центрифугированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выживаемость личинок до куколок в каждом трансвелле. Выживаемость значительно улучшилась по сравнению с самками без микробов, выращенными на NRMv3 с GFRv2 (два Т-теста независимой выборки, *p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Принципиальная схема дозирования NRM и выращивания ос без микробов . (A) Отфильтрованный NRM из центрифужной пробирки объемом 50 мл аликвотировали в стерильные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и замораживали. Каждая пробирка NRM была открыта только один раз. (B) Под зародышами ос Nasonia был полипропиленовый сетчатый лист. Пробирка центрифуги содержала упакованный NRM. «14-й день» означает, что появление взрослой особи происходит примерно на14-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изображения перенесенных яиц ос под стереомикроскопом. Яйца, отложенные осой Nasonia , находятся в красной пунктирной коробке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение времени разработки. Время развития самок без микробов (около 14 дней) существенно не отличалось от такового у ос, выращенных традиционным способом, при использовании улучшенного NRM этого исследования (два Т-критерия независимой выборки, ns, не значимые, p > 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С применением высокопроизводительных технологий обнаружения, таких как геномика и метаболомика, исследователи постепенно осознали, что в микробиоте кишечника существует огромное генетическое разнообразие и сложность метаболизма16. Эти симбиотические бактерии тесно связаны с различными физиологическими или патологическими состояниями, такими как метаболизм питательных веществ хозяина, опухоли, иммунитет и старение посредством сложных взаимодействий с хозяином17. Однако исследования, связанные с сетью состава и функции микробной популяции в организме хозяина, очень сложны, потому что состав микроорганизмов у каждой естественной особи не совсем одинаков16. Следовательно, необходима идеальная модель для изучения взаимодействия и связанных с ним механизмов между микроорганизмами и хозяевами. Осы Nasonia могут быть использованы в качестве идеальной модели в области микробиома из-за ее многочисленных биологических преимуществ и характеристик безмикробных ос6. По сравнению с лечением антибиотиками, использование стерильных животных позволяет контролировать состав и количество микроорганизмов, что имеет решающее значение для изучения функции микробов. Кроме того, лечение антибиотиками может привести к нескольким побочным эффектам, включая резистентность к антибиотикам, дисфункцию кишечника и повреждение кишечного барьера18. Поэтому разработка более эффективного метода получения безмикробных ос имеет большое значение для изучения взаимодействий хозяина и микробиома.
Приобретение безмикробной назоны в основном включает в себя два этапа – получение стерильных эмбрионов и обеспечение стерильным питанием. Эмбрионы были получены путем вскрытия куколок L. sericata через 12-24 ч после паразитирования N. vitripennis под стереоскопом13. Этот шаг требовал достаточного мастерства, чтобы перемещать эмбрионы быстрее и не повреждая их клеточному ситечку. Исходя из опыта, удобнее препарировать старые куколки L. sericata , которые имеют черный цвет. Тем не менее, молодые красные куколки L. sericata предпочтительны для приготовления NRM.
Более того, нормальное развитие стерильных эмбрионов зависело от производства стерильной пищи и операционного процесса смены среды каждый день12. Мы обнаружили, что основным источником загрязнения для выращивания безмикробных ос14 GFRv2 Wang et al. был NRM. Поэтому в настоящем исследовании культуру упаковывали и хранили в холодильнике при -20 °C, гарантируя, что каждая среда будет открыта только один раз. Это не только не повлияло на рост и развитие ос Nasonia , но и значительно продлило время хранения питательной среды и исключило вероятность заражения NRM. В общей сложности этот метод еще больше увеличил выживаемость асептических ос.
Однако у нынешнего метода все же есть некоторые недостатки. Например, ежедневный перенос стерильных эмбрионов в 24-луночную пластину может увеличить риск загрязнения. Кроме того, процесс выдавливания массы куколок мухи также является трудоемким и трудоемким. Если конкретные питательные вещества, которые играют роль в куколках мух, могут быть идентифицированы, их можно будет приобрести и добавить непосредственно в среду, что значительно повысит эффективность приготовления NRM. Ожидается, что этот метод будет дополнительно оптимизирован в будущих исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Финансирование: эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (32270538), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2022YFF0710603), Фондом естественных наук Пекина (6222046) и стратегическим финансированием CAS через схему финансирования CAS-CSIRO (152111KYSB20210011), присужденную G.H.W. Вклад авторов: все авторы разработали объем и направленность обзора и внесли свой вклад в написание рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
