Summary
Gli embrioni di vespa Nasonia sono stati sezionati dalle pupe Lucillia sericata dopo parassitazione per 12-24 ore e lavati con alcool e soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per ottenere embrioni privi di germi. Dopo aver allevato gli embrioni privi di germi e aver fornito loro il terreno di allevamento di Nasonia per crescere e svilupparsi in vitro, sono stati ottenuti adulti di Nasonia privi di germi.
Abstract
La tecnologia di allevamento asettico è un metodo di coltura di insetti in condizioni sterili o quasi sterili, che può eliminare efficacemente l'influenza di microrganismi esterni sul microbiota degli insetti e quindi promuovere il rapido sviluppo della ricerca sul microbiota degli insetti. Nasonia (genere vespa) è un insetto vespa parassita che ha molti vantaggi, come una breve durata della vita, un'elevata variazione genetica, un funzionamento facile, ecc., Ed è ampiamente usato come sistema modello di insetti. A differenza del trattamento antibiotico, che può solo ridurre il numero di microrganismi negli animali, le tecniche di allevamento asettico possono controllare sia la composizione che la quantità di microrganismi negli animali, facilitando ulteriormente lo studio delle interazioni ospite-microbo. Tuttavia, le versioni precedenti del terreno di allevamento Nasonia (NRM) presentano alcuni difetti e problemi, come un processo di preparazione complesso e dispendioso in termini di tempo, una facile contaminazione da batteri o funghi e un breve tempo di conservazione. Pertanto, questo studio risolve questi problemi ottimizzando gli strumenti utilizzati nel processo di preparazione NRM, le condizioni di stoccaggio e i rapporti dei componenti. Il mezzo ottimizzato potrebbe consentire la conservazione a -20 °C per almeno 3 mesi ed eliminare la possibilità di contaminazione da NRM durante l'alimentazione di vespe sterili. Ciò migliora ulteriormente il tasso di sopravvivenza e il livello di salute della nasonia asettica , che è importante per l'utilizzo della nasonia come modello per la ricerca microbica.
Introduction
Gli animali privi di germi sono animali che non hanno microrganismi viventi e parassiti rilevabili1. Gli embrioni privi di germi possono essere ottenuti sezionando la madre in condizioni asettiche e successivamente allevati in sistemi di barriera2. Tali animali possono essere utilizzati per studiare gli effetti dei microrganismi sugli animali, come sul microbiota intestinale, sul sistema immunitario e sul metabolismo1. Con alcuni mezzi tecnici, molti insetti e persino mammiferi possono essere resi sterili 3,4. Gli animali privi di germi hanno un ruolo unico e sono stati ampiamente utilizzati in vari aspetti della ricerca microbiologica5. Ad esempio, l'uso di vespe Nasonia prive di germi ha rivelato che i microrganismi possono aiutare gli ospiti ad adattarsi a nuovi ambienti sotto stress ambientale esogeno a lungo termine 6,7.
I parassitoidi di Nasonia sono piccole vespe parassite che iniettano le loro uova nelle pupe delle mosche4. Ci sono quattro specie conosciute di Nasonia, tra cui Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti e Nasonia oneida 8. N. vitripennis può essere trovato in tutto il mondo, mentre le altre tre specie hanno areali limitati in Nord America4. Le vespe parassitoidi della Nasonia sono considerate insetti modello ideali a causa delle loro caratteristiche, come la facile coltivazione, il breve ciclo di riproduzione, il genoma sequenziato e la diapausa a lungo termine 8,9. Possono essere utilizzati per studiare vari aspetti dell'evoluzione degli insetti, della genetica, dello sviluppo, del comportamento e della simbiosi10. Inoltre, le vespe parassitoidi Nasonia possono anche aiutare a controllare le mosche nocive in agricoltura e malattia11. Il successo della creazione di un sistema di insetti sterili comporta due fasi principali: (1) sterilizzazione degli embrioni e (2) fornitura di cibo sterile alle larve in vitro. Al fine di ottenere cibo sterile, Brucker e Bordenstein 12 hanno sviluppato il terreno di allevamento Nasonia (NRMv1) nel 2012 utilizzando sostanze chimiche come antibiotici, candeggina e siero fetale bovino per uccidere i batteri12. Tuttavia, il metodo di sterilizzazione chimica ha portato a bassi tassi di sopravvivenza ed eclosion di N. vitripennis13. Poi, nel 2016, Shropshire et al. hanno sviluppato NRMv2 utilizzando un metodo di sterilizzazione con filtro invece di un metodo di sterilizzazione chimica per eliminare i pericoli di antibiotici e altre sostanze e hanno ottimizzato il processo di allevamento13. Sfortunatamente, questo metodo presenta ancora alcuni svantaggi, come le sfide associate alla preparazione e all'utilizzo del mezzo, nonché i rischi di annegamento, sottoalimentazione o disidratazione per gli embrioni, le larve e le pupe chiuse14. Wang e Brucker14 hanno recentemente migliorato i protocolli Nasonia rearing media versione 3 (NRMv3) e GFRv2 (germ-free rearing version 2). Questi miglioramenti hanno ridotto i costi e il consumo dei supporti. Tuttavia, NRMv3 ha un tempo di conservazione molto breve ed è altamente suscettibile alla contaminazione.
Basandosi su NRMv3, il metodo di conservazione dello strumento di preparazione NRM e il rapporto dei nutrienti sono stati ottimizzati in questo studio. Questo perfezionamento metodologico facilita l'utilizzo di N. vitripennis come modello per gli studi sul microbioma. Rispetto all'NRMv3 sviluppato da Wang et al.14, lo strumento migliorato per spremere la spremitura della scarpa di Sarcophaga bullata, una delle materie prime NRM, migliora notevolmente l'efficienza produttiva del fluido tissutale della pupa S. bullata rispetto alla siringa da 60 ml con un foro inferiore utilizzata da Wang et al.14. Abbiamo aggiustato il rapporto nutritivo del NRM, che ha portato ad un certo aumento del tasso di sopravvivenza delle vespe Nasonia prive di germi senza influire sul loro tempo di sviluppo. Inoltre, l'NRM è stato confezionato in provette da centrifuga di piccola capacità (1,5 ml) e congelato in un frigorifero a -20 °C per prolungare il tempo di conservazione. Vale la pena notare che mentre abbiamo usato la mosca domestica Lucilia sericata come ospite e fonte per la preparazione NRM, questo protocollo può probabilmente essere adattato per altri ospiti Nasonia disponibili in laboratorio.
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Protocol
1. Preparazione delterreno di allevamento dellaNasonia privo di germi
- Posizionare le pupe di L. sericata disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali) su una superficie che possa ospitare tutte le pupe, come un vassoio o un foglio di carta. Scartare eventuali larve sottosviluppate, vecchie pupe scure, gusci vuoti, segatura o altre impurità. Tenere solo le giovani pupe di colore rosso-brunastro e trasferirle in un becher (circa 3.000-4.000 pupe).
NOTA: Dopo aver condotto molti esperimenti, è stato scoperto che il mezzo ricavato dalle vecchie pupe scure diventava facilmente scuro e fermava lo sviluppo di vespe prive di germi. Questo fenomeno non si è verificato quando si usano le giovani pupe rosso-brunastre per produrre terreno. La ragione di ciò non è ancora chiara e richiede ulteriori indagini per verificarlo. - Aggiungere abbastanza acqua deionizzata al becher per coprire l'intera superficie delle pupe. Avvolgere la bocca del becher con carta stagnola o garza, scuotere il becher per pulire le impurità sulla superficie delle pupe, quindi versare l'acqua. Ripeti da tre a cinque volte.
- Mettere le pupe di L. sericata pulite nel serbatoio del filtro di una pressa per aglio, spremere forte e raccogliere il fluido tissutale delle pupe di L. sericata in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml. Quindi, versare la feccia di pupa e mettere nuove pupe nel serbatoio del filtro della pressa per aglio fino a quando tutti sono schiacciati.
NOTA: Rispetto al dispositivo di estrusione ad ago utilizzato da Wang et al.14, la pressa per aglio è più conveniente e può separare il liquido interstiziale più accuratamente. Questo progresso pone le basi per la produzione su larga scala e lo stoccaggio a lungo termine di NRM. - Centrifugare la miscela a 4 °C (25.000 x g) per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, la miscela sarà separata in tre strati dal basso verso l'alto: strato di sedimento, strato proteico e strato di grasso (Figura 1).
- Per evitare l'intasamento durante la filtrazione, aspirare lo strato proteico utilizzando un ago sterile da 18 G e trasferirlo in una nuova provetta conica sterile in polipropilene da 50 ml.
- Aggiungere il mezzo di Drosophila liquido commerciale (vedi Tabella dei materiali) all'estratto proteico in rapporto 1: 1.
NOTA: L. sericata commercializzato più conveniente è stato utilizzato come materia prima ospite e NRM, rispetto a NRMv3. Pertanto, il rapporto nutrizionale è stato regolato da 1: 2 a 1: 1 in base a NRMv3, che era più adatto per la crescita e lo sviluppo della nasonia sterile (Figura 2). - Filtrare il mezzo miscelato (terreno di Drosophila ed estratto proteico di L. sericata pupa) utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto con diverse dimensioni dei pori (8, 1,2, 0,8 e 0,45 μm; vedi Tabella dei materiali) per rimuovere particelle di diverse dimensioni. Per evitare l'intasamento, cambiare la carta da filtro quando il flusso rallenta.
NOTA: Per ogni filtrazione è necessario utilizzare una nuova provetta sterile da centrifuga da 50 ml. - Centrifugare nuovamente il liquido a 4 °C (15.000 x g) per 10 minuti e sterilizzare il mezzo surnatante attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm. Ripeti i passaggi precedenti una volta.
- Conservare il terreno di coltura a -20 °C dopo l'aliquotazione (Figura 3A) per la conservazione a lungo termine.
NOTA: Per evitare contaminazioni e ripetuti congelamenti e scongelamenti, si raccomanda di aprire ogni tubo di NRM solo una volta quando si utilizza il terreno di coltura dopo il confezionamento (Figura 3A).
2. Raccolta di uova senza germi
- Per garantire un rapporto maschio / femmina stabile nella prole, porre le pupe in una fiala di Drosophila durante lo stadio pupale con un rapporto di 50 femmine per 15 maschi a causa delle loro caratteristiche genetiche aploidi (i maschi si sviluppano da cellule aploidi, mentre le femmine si sviluppano da cellule diploidi che derivano da uova fecondate)4,15.
- Dopo essere emersi agli adulti, lasciare che i maschi e le femmine si accoppiano per 1,5 giorni, quindi inserire circa 40 L. sericata pupe nella fiala. Entro 12-24 ore dopo la parassitizzazione, utilizzare un ago da dissezione sterile per aprire con attenzione un'estremità del guscio della pupa sotto uno stereomicroscopio (Figura 4).
- Tieni l'altra estremità a mano e trova gli embrioni di vespa. Utilizzare un ago da dissezione per trasferire gli embrioni dalla superficie del tessuto della pupa di L. sericata a un filtro a cellule sterili con soluzione salina tamponata fosfato (PBS)14.
NOTA: Le vecchie pupe di L. sericata devono essere utilizzate per il parassitismo perché il tessuto secco di L. sericata pupa è più facile da trasferire gli embrioni . Al fine di garantire il regolare trasferimento delle uova dalla superficie del tessuto della pupa di L. sericata , cercare di fare attenzione a non perforare il tessuto quando l'ago dissecante apre la custodia della pupa in modo che il liquido interstiziale non defluisca.
- Porre 20-30 embrioni su un filtro cellulare e lavarli uniformemente con 1.000 μL di soluzione commerciale di ipoclorito di sodio al 10% (vedere Tabella dei materiali), seguito da un altro lavaggio con 1.000 μL di 1x PBS sterile. Quindi, lavare una volta con 1.000 μL di soluzione di etanolo al 70% e lavare tre volte con 1.000 μL di 1x PBS sterile.
- Innanzitutto, posizionare un foglio di rete in polipropilene di 5 mm di diametro (vedi Tabella dei materiali) che è stato pre-bagnato con 1x PBS in una piastra da 24 pozzetti. Quindi, utilizzando una piccola spazzola sterilizzata, spazzolare delicatamente gli embrioni di vespa sul filtro cellulare sul foglio di rete di polipropilene. Questo può essere fatto per tutti e quattro i pozzetti in una colonna verticale della piastra a 24 pozzetti.
3. Allevamento di vespe senza germi
- Aggiungere 50 μL di NRM a ciascun pozzetto in una cappa a flusso laminare. Per mantenere un ambiente umido per la crescita, aggiungere 1 ml di acqua sterile tra ciascun pozzetto nella piastra a 24 pozzetti. Un piccolo becher contenente 30 ml di acqua sterile può anche essere inserito nella scatola di plastica sterile da 5 litri con la piastra a 24 pozzetti.
- Durante l'intero esperimento, conservare la scatola di plastica sterile e la piastra a 24 pozzetti in una camera climatica a una temperatura costante di 25 ± 2 °C e sotto luce costante.
- Prima di trasferire e aggiungere NRM ogni giorno, scongelare l'NRM congelato su un banco a flusso laminare. In un ambiente sterile, utilizzare una pinzetta disinfettata con alcool per trasferire la rete in polipropilene con le larve su di essa da un pozzetto all'altro. Infine, aggiungere 50 μL di NRM che è stato equilibrato a temperatura ambiente (Figura 3B). Ripeti le operazioni di cui sopra ogni giorno fino a quando non si osservano le pupe.
NOTA: Con lo sviluppo delle vespe, la quantità di NRM dovrebbe essere aumentata in modo appropriato per garantire che le vespe prive di germi abbiano un'alimentazione sufficiente. Ad esempio, le larve del quarto stadio sono state fornite con 60-70 μL di NRM. Poiché diverse fasi di sviluppo possono coesistere nello stesso pozzo, utilizzare una spazzola sterilizzata per trasferire le pupe. Aggiungi una piccola quantità di NRM alle larve rimanenti. Utilizzare tecniche asettiche per evitare l'invasione microbica e l'inquinamento. - Dopo aver mangiato per 9-11 giorni, oltre l'80% delle larve si sviluppa in pupe bianche o gialle. A questo punto, spostare il filtro su una piastra pulita e interrompere l'aggiunta di terreno di coltura per attendere l'eclosione.
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Representative Results
L'efficienza di preparazione di NRM è stata notevolmente migliorata migliorando gli strumenti di preparazione. Inoltre, il problema dell'inquinamento NMR nel processo di alimentazione è stato eliminato ottimizzando la strategia e il metodo di conservazione. Allo stesso tempo, l'NRM aggiustato aveva un rapporto nutrizionale più adatto per la crescita e lo sviluppo di vespe prive di germi con L. sericata come ospiti. Il tasso di sopravvivenza delle vespe prive di germi dalle larve alle pupe è stato significativamente migliorato rispetto alle vespe prive di germi allevate con NRMv3 utilizzando GFRv2 (Figura 2). Inoltre, il periodo di generazione non era diverso tra le vespe asettiche e le vespe allevate convenzionalmente (circa 14 giorni alla generazione) (Figura 5). Questi miglioramenti sono molto significativi per lo sviluppo dell'organismo modello Nasonia e lo studio del meccanismo di interazione ospite-microrganismo.
Figura 1: Miscela separata mediante centrifugazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Il tasso di sopravvivenza delle larve alle pupe in ogni transwell. Il tasso di sopravvivenza è migliorato significativamente rispetto alle femmine prive di germi allevate su NRMv3 con GFRv2 (due test T a campione indipendente, *p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Diagramma schematico dell'erogazione di NMR e dell'allevamento di vespe privo di germi . (A) L'NRM filtrato dalla provetta da centrifuga da 50 mL è stato aliquotato in provette sterili da centrifuga da 1,5 mL e congelato. Ogni tubo di NRM è stato aperto solo una volta. (B) C'era un foglio di rete di polipropilene sotto gli embrioni delle vespe Nasonia . Il tubo della centrifuga conteneva l'NRM confezionato. "Giorno 14-ish" significa che l'emergenza adulta si verifica intorno al 14° giorno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Immagini di uova di vespa trasferite sotto lo stereomicroscopio. Le uova deposte dalla vespa Nasonia sono all'interno della scatola tratteggiata rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Confronto dei tempi di sviluppo. Il tempo di sviluppo delle femmine prive di germi (circa 14 giorni) non era significativamente diverso da quello delle vespe allevate convenzionalmente quando si utilizzava l'NRM migliorato di questo studio (due test T a campione indipendente, ns, non significativi, p > 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Con l'applicazione di tecnologie di rilevamento ad alto rendimento come la genomica e la metabolomica, i ricercatori hanno gradualmente capito che esiste un'enorme diversità genetica e complessità metabolica nel microbiota intestinale16. Questi batteri simbionti sono strettamente correlati a vari stati fisiologici o patologici, come il metabolismo nutrizionale dell'ospite, i tumori, l'immunità e l'invecchiamento attraverso complesse interazioni con l'ospite17. Tuttavia, la ricerca relativa alla rete della composizione e della funzione della popolazione microbica nell'ospite è molto difficile perché la composizione dei microrganismi in ogni individuo naturale non è esattamente la stessa16. Pertanto, è necessario un modello ideale per esplorare l'interazione e i meccanismi correlati tra microrganismi e ospiti. Le vespe Nasonia possono essere utilizzate come modello ideale nel campo del microbioma a causa dei suoi numerosi vantaggi biologici e delle caratteristiche delle vespe prive di germi6. Rispetto al trattamento antibiotico, l'utilizzo di animali sterili consente di controllare la composizione e la quantità di microrganismi, che è fondamentale per studiare la funzione microbica. Inoltre, il trattamento antibiotico può portare a diversi effetti collaterali, tra cui resistenza agli antibiotici, disfunzione intestinale e danni alla barriera intestinale18. Pertanto, lo sviluppo di un metodo più efficiente per ottenere vespe prive di germi è di grande importanza per lo studio delle interazioni ospite-microbioma.
L'acquisizione di Nasonia priva di germi comprende principalmente due passaggi: ottenere embrioni sterili e fornire cibo sterile. Gli embrioni sono stati ottenuti sezionando L. sericata pupee 12-24 ore dopo la parassitizzazione di N. vitripennis sotto uno stereoscopio13. Questo passaggio richiedeva abbastanza abilità per spostare gli embrioni più velocemente e senza danneggiarli al filtro cellulare. Sulla base dell'esperienza, è più conveniente sezionare le vecchie pupe di L. sericata che sono nere. Tuttavia, le giovani pupe rosse di L. sericata sono preferite per la preparazione di NRM.
Inoltre, il normale sviluppo degli embrioni sterili dipendeva dalla produzione di cibo sterile e dal processo operativo di cambiare il mezzo ogni giorno12. Abbiamo scoperto che la principale fonte di contaminazione per l'allevamento di vespe prive di germi da parte di14 GFRv2 di Wang et al. era NRM. Pertanto, la coltura è stata confezionata e conservata in frigorifero a -20 °C nel presente studio, assicurando che ogni terreno sia aperto solo una volta. Ciò non solo non ha avuto alcun effetto sulla crescita e lo sviluppo delle vespe Nasonia , ma ha anche prolungato notevolmente il tempo di conservazione del terreno di coltura ed eliminato la possibilità di contaminazione da NRM. In totale, questo metodo ha ulteriormente aumentato il tasso di sopravvivenza delle vespe asettiche.
Tuttavia, il metodo attuale presenta ancora alcuni inconvenienti. Ad esempio, il trasferimento giornaliero di embrioni sterili in una piastra a 24 pozzetti può aumentare il rischio di inquinamento. Inoltre, il processo di spremitura di una massa di pupe di mosca richiede anche tempo e manodopera. Se i nutrienti specifici che svolgono un ruolo nelle pupe di mosca possono essere identificati, potrebbero essere acquistati e aggiunti direttamente al substrato, il che migliorerebbe notevolmente l'efficienza della preparazione NRM. Si prevede che questo metodo sarà ulteriormente ottimizzato nella ricerca futura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation of China (32270538), dal National Key R&D Program of China (2022YFF0710603), dalla Natural Science Foundation di Pechino (6222046) e dal finanziamento strategico CAS tramite lo schema di finanziamento CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) assegnato a G.H.W. Contributi dell'autore: tutti gli autori hanno sviluppato la portata e il focus della revisione e hanno contribuito alla stesura del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
