Summary
नासोनिया ततैया भ्रूण को 12-24 घंटे के लिए परजीवीकरण के बाद लुसिलिया सेरिकाटा प्यूपे से विच्छेदित किया गया था और रोगाणु मुक्त भ्रूण प्राप्त करने के लिए शराब और 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान से धोया गया था। रोगाणु-मुक्त भ्रूण को पालने और उन्हें विट्रो में बढ़ने और विकसित करने के लिए नासोनिया पालन माध्यम के साथ आपूर्ति करने के बाद, रोगाणु मुक्त नासोनिया वयस्क प्राप्त किए गए थे।
Abstract
सड़न रोकनेवाला पालन तकनीक बाँझ या लगभग बाँझ परिस्थितियों में कीड़ों के संवर्धन की एक विधि है, जो कीट माइक्रोबायोटा पर बाहरी सूक्ष्मजीवों के प्रभाव को प्रभावी ढंग से समाप्त कर सकती है और इस प्रकार कीट माइक्रोबायोटा अनुसंधान के तेजी से विकास को बढ़ावा दे सकती है। नासोनिया (वास्प जीनस) एक परजीवी ततैया कीट है जिसके कई फायदे हैं, जैसे कि एक छोटा जीवनकाल, उच्च आनुवंशिक भिन्नता, आसान ऑपरेशन, आदि, और व्यापक रूप से एक कीट मॉडल प्रणाली के रूप में उपयोग किया जाता है। एंटीबायोटिक उपचार के विपरीत, जो केवल जानवरों में सूक्ष्मजीवों की संख्या को कम कर सकता है, सड़न रोकनेवाला पालन तकनीक जानवरों में सूक्ष्मजीवों की संरचना और मात्रा दोनों को नियंत्रित कर सकती है, जिससे मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के अध्ययन की सुविधा मिलती है। हालांकि, नासोनिया पालन माध्यम (एनआरएम) के पिछले संस्करणों में कुछ दोष और समस्याएं हैं, जैसे कि एक जटिल और समय लेने वाली तैयारी प्रक्रिया, बैक्टीरिया या कवक द्वारा आसान संदूषण, और कम भंडारण समय। इसलिए, यह अध्ययन एनआरएम तैयारी प्रक्रिया, भंडारण की स्थिति और घटक अनुपात में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों को अनुकूलित करके इन समस्याओं को हल करता है। अनुकूलित माध्यम कम से कम 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण की अनुमति दे सकता है और बाँझ ततैया खिलाने के दौरान एनआरएम संदूषण की संभावना को समाप्त कर सकता है। यह आगे सड़न रोकनेवाला नासोनिया की जीवित रहने की दर और स्वास्थ्य स्तर में सुधार करता है , जो माइक्रोबियल अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में नासोनिया का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
रोगाणु मुक्त जानवर ऐसे जानवर हैं जिनके पास कोई पता लगाने योग्य जीवित सूक्ष्मजीवऔर परजीवी नहीं हैं। रोगाणु मुक्त भ्रूण को सड़न रोकनेवाली स्थितियों के तहत मां को विच्छेदित करके प्राप्त किया जा सकता है और बाद में बाधा प्रणाली2 में उठाया जा सकता है। ऐसे जानवरों का उपयोग जानवरों पर सूक्ष्मजीवों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि आंतों के माइक्रोबायोटा, प्रतिरक्षा प्रणाली और चयापचय1। कुछ तकनीकी साधनों के साथ, कई कीड़े और यहां तक कि स्तनधारियों को बाँझ 3,4 प्रदान किया जा सकता है। रोगाणु मुक्त जानवरों की एक अनूठी भूमिका है और सूक्ष्म जीव विज्ञान अनुसंधानके विभिन्न पहलुओं में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, रोगाणु मुक्त नासोनिया ततैया के उपयोग से पता चला है कि सूक्ष्मजीव मेजबानों को दीर्घकालिक बहिर्जात पर्यावरणीय तनाव 6,7 के तहत नए वातावरण के अनुकूल होने में मदद कर सकते हैं।
नासोनिया परजीवी छोटे परजीवी ततैया हैं जोमक्खियों के प्यूपे में अपने अंडे इंजेक्ट करते हैं। नासोनिया की चार ज्ञात प्रजातियां हैं, जिनमें नासोनिया विट्रीपेनिस, नासोनिया लॉन्गिकोर्निस, नासोनिया गिरोल्टी और नासोनिया ओनिडा8 शामिल हैं। विट्रीपेनिस दुनिया भर में पाया जा सकता है, जबकि अन्य तीन प्रजातियों कीउत्तरी अमेरिका में सीमित रेंज हैं। नासोनिया पैरासिटॉइड ततैया को उनकी विशेषताओं के कारण आदर्श मॉडल कीड़े माना जाता है, जैसे कि आसान खेती, लघु प्रजनन चक्र, अनुक्रमित जीनोम, और दीर्घकालिक डायपॉज 8,9। उनका उपयोग कीट विकास, आनुवंशिकी, विकास, व्यवहार और सहजीवनके विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, नासोनिया पैरासिटॉइड ततैया भी कृषि और रोग11 में हानिकारक मक्खियों को नियंत्रित करने में मदद कर सकता है। एक बाँझ कीट प्रणाली की सफल स्थापना में दो प्रमुख चरण शामिल हैं: (1) भ्रूण की नसबंदी और (2) विट्रो में लार्वा के लिए बाँझ भोजन का प्रावधान। बाँझ भोजन प्राप्त करने के लिए, ब्रुकर और बोर्डेनस्टीन12 ने बैक्टीरिया को मारने के लिए एंटीबायोटिकदवाओं, ब्लीच और भ्रूण गोजातीय सीरम जैसे रसायनों का उपयोग करके 2012 में नासोनिया पालन माध्यम (एनआरएमवी 1) विकसित किया। हालांकि, रासायनिक नसबंदी विधि के परिणामस्वरूप एन विट्रीपेनिस13 की कम जीवित रहने और उत्सर्जन दर हुई। फिर, 2016 में, श्रॉपशायर एट अल ने एंटीबायोटिक दवाओं और अन्य पदार्थों के खतरों को खत्म करने के लिए रासायनिक नसबंदी विधि के बजाय एक फिल्टर नसबंदी विधि का उपयोग करके एनआरएमवी 2 विकसित किया, और प्रजनन प्रक्रियाको अनुकूलित किया। दुर्भाग्य से, इस विधि में अभी भी कुछ नुकसान हैं, जैसे कि माध्यम तैयार करने और उपयोग करने से जुड़ी चुनौतियां, साथ ही भ्रूण, लार्वा और बंद प्यूपे14 के लिए डूबने, अंडरफीडिंग या निर्जलीकरण के जोखिम। वांग और ब्रुकर14 ने हाल ही में नासोनिया पालन मीडिया संस्करण 3 (एनआरएमवी 3) और रोगाणु मुक्त पालन संस्करण 2 (जीएफआर वी 2) प्रोटोकॉल में सुधार किया। इन सुधारों ने लागत और मीडिया की खपत को कम कर दिया। हालांकि, NRMv3 में बहुत कम भंडारण समय है और संदूषण के लिए अतिसंवेदनशील है।
एनआरएमवी 3 पर निर्माण, एनआरएम तैयारी उपकरण भंडारण विधि और पोषक तत्व अनुपात को इस अध्ययन में अनुकूलित किया गया था। यह पद्धतिगत शोधन माइक्रोबायोम अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में एन विट्रीपेनिस का उपयोग करने की सुविधा प्रदान करता है। वांग एट अल.14 द्वारा विकसित एनआरएमवी 3 की तुलना में, एनआरएम कच्चे माल में से एक सरकोफागा बुल्टा पुपा को निचोड़ने के लिए बेहतर उपकरण, वांग एट अल.14 द्वारा उपयोग किए जाने वाले निचले छेद के साथ 60 एमएल सिरिंज की तुलना में एस बुल्टा प्यूपा ऊतक द्रव की उत्पादन दक्षता को बहुत बढ़ाता है। हमने एनआरएम के पोषक तत्व अनुपात को समायोजित किया, जिसके कारण उनके विकास के समय को प्रभावित किए बिना रोगाणु मुक्त नासोनिया ततैया की जीवित रहने की दर में एक निश्चित वृद्धि हुई। इसके अलावा, एनआरएम को छोटी क्षमता वाले सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (1.5 एमएल) में पैक किया गया था और भंडारण समय का विस्तार करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में जमे हुए थे। यह ध्यान देने योग्य है कि जब हमने एनआरएम तैयारी के लिए मेजबान और स्रोत के रूप में हाउसफ्लाई लुसिलिया सेरिकाटा का उपयोग किया, तो इस प्रोटोकॉल को प्रयोगशाला में उपलब्ध अन्य नासोनिया मेजबानों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. रोगाणु मुक्त नासोनिया पालन माध्यम की तैयारी
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एल सेरिकाटा प्यूपे ( सामग्री की तालिका देखें) को एक सतह पर रखें जो सभी प्यूपे को समायोजित कर सके, जैसे कि ट्रे या कागज की शीट। किसी भी अविकसित लार्वा, गहरे पुराने प्यूपे, खाली प्यूपल गोले, चूरा, या अन्य अशुद्धियों को त्याग दें। केवल युवा प्यूपे रखें जो भूरे-लाल रंग के हों और उन्हें बीकर (लगभग 3,000-4,000 प्यूपे) में स्थानांतरित करें।
नोट: कई प्रयोगों के बाद, यह पाया गया कि गहरे पुराने प्यूपे से बना माध्यम आसानी से अंधेरा हो गया और रोगाणु मुक्त ततैया के विकास को रोक दिया। माध्यम का उत्पादन करने के लिए युवा भूरे-लाल प्यूपे का उपयोग करते समय यह घटना नहीं हुई। इसका कारण अभी भी स्पष्ट नहीं है और इसे सत्यापित करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है। - प्यूपे की पूरी सतह को कवर करने के लिए बीकर में पर्याप्त विआयनीकृत पानी जोड़ें। बीकर के मुंह को टिनफॉइल या धुंध के साथ लपेटें, प्यूपे की सतह पर अशुद्धियों को साफ करने के लिए बीकर को हिलाएं, और फिर पानी डालें। तीन से पांच बार दोहराएं।
- लहसुन प्रेस के फिल्टर टैंक में साफ किए गए एल सेरिकाटा प्यूपे को रखें, जोर से निचोड़ें, और एल सेरिकाटा प्यूपे के ऊतक द्रव को 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें। फिर, प्यूपा ड्रेग्स डालें और नए प्यूपे को लहसुन प्रेस के फिल्टर टैंक में डालें जब तक कि सभी निचोड़े न जाएं।
नोट: वांग एट अल .14 द्वारा उपयोग किए जाने वाले सुई एक्सट्रूज़न डिवाइस की तुलना में, लहसुन प्रेस अधिक सुविधाजनक है और अंतरालीय द्रव को अधिक अच्छी तरह से अलग कर सकता है। यह प्रगति एनआरएम के बड़े पैमाने पर उत्पादन और दीर्घकालिक भंडारण की नींव रखती है। - 10 मिनट के लिए मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस (25,000 x ग्राम) पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, मिश्रण को नीचे से ऊपर तक तीन परतों में विभाजित किया जाएगा: तलछट परत, प्रोटीन परत और वसा परत (चित्रा 1)।
- निस्पंदन के दौरान क्लॉगिंग को रोकने के लिए, 18 ग्राम बाँझ सुई का उपयोग करके प्रोटीन परत को एस्पिरेट करें और इसे एक नए 50 एमएल शंक्वाकार बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 1: 1 अनुपात में प्रोटीन निकालने के लिए वाणिज्यिक तरल ड्रोसोफिला माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
नोट: एनआरएमवी 3 की तुलना में अधिक सुविधाजनक व्यावसायिक एल सेरिकाटा का उपयोग मेजबान और एनआरएम कच्चे माल के रूप में किया गया था। इसलिए, पोषण अनुपात को एनआरएमवी 3 के आधार पर 1: 2 से 1: 1 तक समायोजित किया गया था, जो बाँझ नासोनिया के विकास और विकास के लिए अधिक उपयुक्त था (चित्रा 2)। - विभिन्न आकारों के कणों को हटाने के लिए विभिन्न छिद्र आकारों (8, 1.2, 0.8, और 0.45 μm; सामग्री की तालिका देखें) के साथ वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग करके मिश्रित माध्यम (ड्रोसोफिला माध्यम और एल सेरिकाटा प्यूपा का प्रोटीन अर्क) को फ़िल्टर करें। क्लॉगिंग को रोकने के लिए, प्रवाह धीमा होने पर फ़िल्टर पेपर बदलें।
नोट: प्रत्येक निस्पंदन के लिए एक नए 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग आवश्यक है। - 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (15,000 x ग्राम) पर तरल को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें और 0.22 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरने वाले माध्यम को निष्फल करें। उपरोक्त चरणों को एक बार दोहराएं।
- लंबे समय तक भंडारण के लिए एलिकोटिंग (चित्रा 3 ए) के बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम स्टोर करें।
नोट: संदूषण और बार-बार ठंड और पिघलने को रोकने के लिए, पैकेजिंग के बाद कल्चर माध्यम का उपयोग करते समय एनआरएम की प्रत्येक ट्यूब को केवल एक बार खोलने की सिफारिश की जाती है (चित्रा 3 ए)।
2. रोगाणु मुक्त अंडा संग्रह
- संतानों में एक स्थिर पुरुष-से-महिला अनुपात सुनिश्चित करने के लिए, प्यूपे को उनकी अगुणित आनुवंशिक विशेषताओं के कारण 50 महिलाओं से 15 पुरुषों के अनुपात में प्यूपल चरण के दौरान ड्रोसोफिला शीशी में रखें (पुरुष अगुणित कोशिकाओं से विकसित होते हैं, जबकि महिलाएं द्विगुणित कोशिकाओं से विकसित होती हैं जो निषेचित अंडे के परिणामस्वरूप होती हैं)4,15।
- वयस्कों के लिए उभरने के बाद, पुरुषों और महिलाओं को 1.5 दिनों के लिए संभोग करने की अनुमति दें, और फिर शीशी में लगभग 40 एल सेरिकाटा प्यूपे डालें। परजीवीकरण के बाद 12-24 घंटे के भीतर, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 4) के तहत प्यूपल शेल के एक छोर को सावधानीपूर्वक खोलने के लिए एक बाँझ विच्छेदन सुई का उपयोग करें।
- दूसरे छोर को हाथ से पकड़ें और ततैया भ्रूण खोजें। सेरिकाटा प्यूपा ऊतक की सतह से फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) 14 के साथ एक बाँझ सेल छन्नी में भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए एक विच्छेदन सुई का उपयोग करें।
नोट: पुराने एल सेरिकाटा प्यूपे का उपयोग परजीवीवाद के लिए किया जाना चाहिए क्योंकि शुष्क एल सेरिकाटा प्यूपा ऊतक भ्रूण को स्थानांतरित करना आसान है । एल सेरिकाटा प्यूपा ऊतक की सतह से अंडे के सुचारू हस्तांतरण को सुनिश्चित करने के लिए, सावधान रहने की कोशिश करें कि जब विच्छेदन सुई प्यूपल केस को खोलती है तो ऊतक को पंचर न करें ताकि अंतरालीय तरल पदार्थ बाहर न निकले।
- एक सेल छन्नी पर 20-30 भ्रूण रखें और उन्हें 10% वाणिज्यिक सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के 1,000 μL के साथ समान रूप से धोएं ( सामग्री की तालिका देखें), इसके बाद 1x बाँझ पीबीएस के 1,000 μL के साथ एक और धोएं। फिर, 70% इथेनॉल समाधान के 1,000 μL के साथ एक बार धोएं और 1x बाँझ पीबीएस के 1,000 μL के साथ तीन बार धोएं।
- सबसे पहले, एक 5 मिमी व्यास पॉलीप्रोपाइलीन जाल शीट ( सामग्री की तालिका देखें) रखें जिसे 24-वेल प्लेट में 1x पीबीएस के साथ पूर्व-गीला किया गया है। फिर, एक निष्फल छोटे ब्रश का उपयोग करके, पॉलीप्रोपाइलीन जाल शीट पर सेल छन्नी पर ततैया भ्रूण को धीरे से ब्रश करें। यह 24-वेल प्लेट के ऊर्ध्वाधर स्तंभ में सभी चार कुओं के लिए किया जा सकता है।
3. रोगाणु मुक्त ततैया पालन
- एक लामिनर प्रवाह हुड में प्रत्येक कुएं में एनआरएम के 50 μL जोड़ें। विकास के लिए आर्द्र वातावरण बनाए रखने के लिए, 24-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं के बीच 1 मिलीलीटर बाँझ पानी जोड़ें। 30 मिलीलीटर बाँझ पानी युक्त एक छोटा बीकर भी 24-वेल प्लेट के साथ 5 एल बाँझ प्लास्टिक बॉक्स में रखा जा सकता है।
- पूरे प्रयोग के दौरान, बाँझ प्लास्टिक बॉक्स और 24-वेल प्लेट को 25 ± 2 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर और निरंतर प्रकाश के तहत जलवायु कक्ष में रखें।
- हर दिन एनआरएम को स्थानांतरित करने और जोड़ने से पहले, जमे हुए एनआरएम को एक लामिनर प्रवाह बेंच पर पिघलाएं। एक बाँझ वातावरण में, एक कुएं से दूसरे कुएं में लार्वा के साथ पॉलीप्रोपाइलीन जाल को स्थानांतरित करने के लिए अल्कोहल-कीटाणुरहित चिमटी का उपयोग करें। अंत में, एनआरएम के 50 μL जोड़ें जिसे कमरे के तापमान (चित्रा 3 बी) के बराबर किया गया है। उपरोक्त कार्यों को हर दिन दोहराएं जब तक कि प्यूपे का पालन न किया जाए।
नोट: ततैया के विकास के साथ, एनआरएम की मात्रा को उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि रोगाणु मुक्त ततैया में पर्याप्त पोषण है। उदाहरण के लिए, चौथे इनस्टार लार्वा को एनआरएम के 60 से 70 μL के साथ आपूर्ति की गई थी। चूंकि विभिन्न विकास चरण एक ही कुएं में सह-अस्तित्व में हो सकते हैं, इसलिए प्यूपे को बाहर स्थानांतरित करने के लिए एक निष्फल ब्रश का उपयोग करें। शेष लार्वा में एनआरएम की थोड़ी मात्रा जोड़ें। माइक्रोबियल आक्रमण और प्रदूषण से बचने के लिए सड़न रोकनेवाली तकनीकों का उपयोग करें। - 9 से 11 दिनों तक खिलाने के बाद, 80% से अधिक लार्वा सफेद या पीले प्यूपे में विकसित होते हैं। इस समय, फ़िल्टर को एक साफ कुएं की प्लेट में ले जाएं और एक्लॉज़न की प्रतीक्षा करने के लिए संस्कृति माध्यम जोड़ना बंद कर दें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
तैयारी उपकरणों में सुधार करके एनआरएम की तैयारी दक्षता में काफी सुधार किया गया था। इसके अलावा, रणनीति और संरक्षण विधि को अनुकूलित करके भोजन प्रक्रिया में एनआरएम प्रदूषण की समस्या को समाप्त कर दिया गया था। उसी समय, समायोजित एनआरएम में मेजबान के रूप में एल सेरिकाटा के साथ रोगाणु मुक्त ततैया के विकास और विकास के लिए अधिक उपयुक्त पोषण अनुपात था। लार्वा से प्यूपे तक रोगाणु-मुक्त ततैया की जीवित रहने की दर में जीएफआरवी 2 (चित्रा 2) का उपयोग करके एनआरएमवी 3 के साथ पाले गए रोगाणु मुक्त ततैया की तुलना में काफी सुधार हुआ था। इसके अलावा, पीढ़ी की अवधि सड़न रोकनेवाला ततैया और पारंपरिक रूप से पाले गए ततैया (लगभग 14 दिन एक पीढ़ी) के बीच अलग नहीं थी (चित्रा 5)। ये सुधार नासोनिया मॉडल जीव को विकसित करने और मेजबान-सूक्ष्मजीव बातचीत तंत्र का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण हैं।
चित्र 1: सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया मिश्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: प्रत्येक ट्रांसवेल में लार्वा से प्यूपी की जीवित रहने की दर। GFRv2 (दो स्वतंत्र-नमूना टी-परीक्षण, * p < 0.05) के साथ NRMv3 पर पाली गई रोगाणु-मुक्त महिलाओं की तुलना में जीवित रहने की दर में काफी सुधार हुआ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: एनआरएम वितरण और रोगाणु मुक्त ततैया पालन का योजनाबद्ध आरेख। (ए) 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से फ़िल्टर किए गए एनआरएम को बाँझ 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित किया गया था और फ्रीज किया गया था। एनआरएम की प्रत्येक ट्यूब केवल एक बार खोली गई थी। (बी) नासोनिया ततैया के भ्रूण के नीचे एक पॉलीप्रोपाइलीन जाल शीट थी। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पैक किया गया एनआरएम था। "दिन 14-इश" का अर्थ है कि वयस्क उद्भव लगभग 14वें दिन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत स्थानांतरित ततैया अंडे की छवियां। नासोनिया ततैया द्वारा रखे गए अंडे लाल डैश्ड बॉक्स के भीतर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: विकास समय तुलना। रोगाणु मुक्त महिलाओं (लगभग 14 दिन) का विकास समय इस अध्ययन के बेहतर एनआरएम का उपयोग करते समय पारंपरिक रूप से पाले गए ततैया से काफी अलग नहीं था (दो स्वतंत्र-नमूना टी-परीक्षण, एनएस, महत्वपूर्ण नहीं, पी > 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
जीनोमिक्स और मेटाबोलॉमिक्स जैसी उच्च-थ्रूपुट पहचान प्रौद्योगिकियों के आवेदन के साथ, शोधकर्ताओं ने धीरे-धीरे महसूस किया है कि आंत माइक्रोबायोटा16 में भारी आनुवंशिक विविधता और चयापचय जटिलता है। ये सहजीवी बैक्टीरिया विभिन्न शारीरिक या पैथोलॉजिकल अवस्थाओं से निकटता से संबंधित हैं, जैसे कि मेजबान पोषण चयापचय, ट्यूमर, प्रतिरक्षा, और मेजबान के साथ जटिल बातचीतके माध्यम से उम्र बढ़ने। हालांकि, मेजबान में माइक्रोबियल आबादी की संरचना और कार्य के नेटवर्क से संबंधित शोध बहुत मुश्किल है क्योंकि प्रत्येक प्राकृतिक व्यक्ति में सूक्ष्मजीवों की संरचनाबिल्कुल समान नहीं है। इसलिए, सूक्ष्मजीवों और मेजबानों के बीच बातचीत और संबंधित तंत्र का पता लगाने के लिए एक आदर्श मॉडल की आवश्यकता होती है। नासोनिया ततैया को माइक्रोबायोम क्षेत्र में एक आदर्श मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि इसके कई जैविक फायदे और रोगाणु मुक्त ततैयाकी विशेषताएं 6 हैं। एंटीबायोटिक उपचार की तुलना में, बाँझ जानवरों का उपयोग सूक्ष्मजीवों की संरचना और मात्रा पर नियंत्रण की अनुमति देता है, जो माइक्रोबियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, एंटीबायोटिक उपचार से कई दुष्प्रभाव हो सकते हैं, जिनमें एंटीबायोटिक प्रतिरोध, आंतों की शिथिलता और आंतों की बाधा क्षतिशामिल है। इसलिए, रोगाणु-मुक्त ततैया प्राप्त करने के लिए एक अधिक कुशल विधि विकसित करना मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
रोगाणु मुक्त नासोनिया के अधिग्रहण में मुख्य रूप से दो कदम शामिल हैं - बाँझ भ्रूण प्राप्त करना और बाँझ भोजन प्रदान करना। भ्रूण को स्टीरियोस्कोप13 के तहत एन विट्रीपेनिस परजीवीकरण के 12-24 घंटे बाद एल सेरिकाटा प्यूपे का विच्छेदन करके प्राप्त किया गया था। इस कदम के लिए भ्रूण को तेजी से और सेल स्ट्रेनर को नुकसान पहुंचाए बिना स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त कौशल की आवश्यकता थी। अनुभव के आधार पर, पुराने एल सेरिकाटा प्यूपे को विच्छेदित करना अधिक सुविधाजनक है जो काले हैं। हालांकि, एनआरएम तैयार करने के लिए युवा लाल एल सेरिकाटा प्यूपे को प्राथमिकता दी जाती है।
इसके अलावा, बाँझ भ्रूण का सामान्य विकास बाँझ भोजन के उत्पादन औरहर दिन माध्यम को बदलने की संचालन प्रक्रिया पर निर्भर करता है। हमने पाया कि वांग एट अल के14 GFRV2 द्वारा रोगाणु मुक्त ततैया पालन के लिए संदूषण का मुख्य स्रोत NRM था। इसलिए, संस्कृति को वर्तमान अध्ययन में -20 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में पैक और संग्रहीत किया गया था, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक माध्यम केवल एक बार खोला जाता है। इसका न केवल नासोनिया ततैया के विकास और विकास पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, बल्कि संस्कृति माध्यम के भंडारण समय को भी बहुत लंबा कर दिया और एनआरएम संदूषण की संभावना को समाप्त कर दिया। कुल मिलाकर, इस विधि ने सड़न रोकनेवाला ततैया की जीवित रहने की दर को और बढ़ा दिया।
हालांकि, वर्तमान विधि में अभी भी कुछ कमियां हैं। उदाहरण के लिए, 24-वेल प्लेट में बाँझ भ्रूण के दैनिक हस्तांतरण से प्रदूषण का खतरा बढ़ सकता है। इसके अलावा, फ्लाई प्यूपे के द्रव्यमान को निचोड़ने की प्रक्रिया भी समय लेने वाली और श्रम-गहन है। यदि फ्लाई प्यूपे में भूमिका निभाने वाले विशिष्ट पोषक तत्वों की पहचान की जा सकती है, तो उन्हें खरीदा जा सकता है और सीधे माध्यम में जोड़ा जा सकता है, जिससे एनआरएम तैयारी की दक्षता में काफी सुधार होगा। यह उम्मीद की जाती है कि इस पद्धति को भविष्य के शोध में और अनुकूलित किया जाएगा।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
फंडिंग: इस काम को चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (32270538), चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2022वाईएफएफ0710603), बीजिंग के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (6222046), और सीएएस-सीएसआईआरओ फंडिंग स्कीम (152111केवाईएसबी20210011) के माध्यम से सीएएस रणनीतिक वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
