12-24時間寄生した後、スズメバチ胚をルシリア・セリカータ蛹から解剖し、アルコールと10%次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄して無菌胚を得た。無菌胚を飼育し、in vitroで成長・発育するためのナソニア飼育培地を供給した後、無菌ナソニア成虫を得た。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
無菌飼育技術は、無菌またはほぼ無菌の条件下で昆虫を培養する方法であり、昆虫微生物叢に対する外部微生物の影響を効果的に排除し、昆虫微生物叢研究の急速な発展を促進することができます。 ナソニア (スズメバチ属)は、寿命が短い、遺伝的変異が高い、操作が簡単など、多くの利点を持つ寄生バチ昆虫であり、昆虫モデルシステムとして広く使用されています。動物の微生物の数を減らすことしかできない抗生物質処理とは異なり、無菌飼育技術は動物の微生物の組成と量の両方を制御することができ、宿主と微生物の相互作用の研究をさらに容易にします。ただし、以前のバージョンの ナソニア 飼育培地(NRM)には、複雑で時間のかかる調製プロセス、細菌や真菌による汚染の容易さ、保管時間の短縮など、いくつかの欠陥や問題があります。そこで本研究では、NRM調製工程で使用するツール、保管条件、成分比を最適化することで、これらの課題を解決した。最適化された培地は、-20°Cで少なくとも3ヶ月間保存することができ、無菌スズメバチの給餌中にNRM汚染の可能性を排除することができます。これにより、無菌性ナソニアの生存率と健康レベルがさらに向上し 、 微生物研究のモデルとして ナソニア を使用する上で重要です。
概要
無菌動物とは、検出可能な生きた微生物や寄生虫を持たない動物です1。無菌胚は、無菌条件下で母親を解剖し、続いてバリアシステム2で飼育することによって得ることができる。このような動物は、腸内細菌叢、免疫系、代謝など、動物に対する微生物の影響を研究するために使用できます1。特定の技術的手段により、多くの昆虫や哺乳類でさえも無菌にすることができます3,4。無菌動物は独自の役割を持ち、微生物学研究のさまざまな側面で広く使用されています5。たとえば、無菌のナソニアバチの使用は、微生物が長期的な外因性環境ストレスの下で宿主が新しい環境に適応するのを助けることができることを明らかにしました6,7。
ナソニア寄生生物は、ハエの蛹に卵を注入する小さな寄生バチです4。ナソニアには、ナソニア・ビトリペンニス、ナソニア・ロンギコル....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1.無菌 ナソニア 飼育培地の調製
- 市販の L. sericata 蛹( 材料表を参照)を、トレイや紙など、すべての蛹を収容できる表面に置きます。未発達の幼虫、暗い古い蛹、空の蛹の殻、おがくず、またはその他の不純物を捨てます。茶色がかった赤色の若い蛹だけを飼い、ビーカー(約3,000〜4,000匹の蛹)に移します。
注:多くの実験を行った後、暗い古い蛹から作られた培地は簡単に暗くなり、無菌ハチの発生を止めることがわかりました。この現象は、若い茶色がかった赤い蛹を使用して培地を生産するときには発生しませんでした。この理由はまだ不明であり、それを検証するにはさらなる調査が必要です。 - 蛹の表面全体を覆うのに十分な脱イオン水をビーカーに加えます。ビーカーの口をティンフォイルまたはガーゼで包み、ビーカーを振って蛹の表面の不純物を取り除き、水を注ぎます。3〜5回繰り返します。
- 洗浄したL. sericataの蛹をニンニクプレスのフィルタータンクに入れ、強く絞って、50mLの滅菌遠心チューブにL.sericataの蛹の組織液を集めます。次に、蛹のカスを注ぎ、すべてが絞られるまでニンニクプレスのフィルタータンクに新しい蛹を入れます。
注:Wangら14が使用....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
NRMの調製効率は、調製ツールの改善により大幅に改善されました。さらに、給餌プロセスにおけるNRM汚染の問題は、戦略と保存方法を最適化することによって排除されました。同時に、調整されたNRMは、 L. sericata を宿主とする無菌ハチの成長と発達により適した栄養比を示しました。幼虫から蛹までの無菌バチの生存率は、GFRv2を用いてNRMv3で飼育した無菌バチと比較して有意に改善されました(図2)。また、無菌スズメバチと従来飼育スズメバチとの間で発生期間に差はなかった(世代あたり約14日)(図5)。これらの改良は、 Nasonia モデル生物の開発や宿主と微生物の相互作用機構の研究にとって非常に重要です。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ゲノミクスやメタボロミクスなどのハイスループット検出技術の適用により、研究者は腸内細菌叢に大きな遺伝的多様性と代謝の複雑さがあることに徐々に気づきました16。これらの共生細菌は、宿主17との複雑な相互作用を通じて、宿主の栄養代謝、腫瘍、免疫、老化などの様々な生理学的または病理学的状態に密接に関連している。しかし、宿主における微生物集団の組成と機能のネットワークに関する研究は、各自然個体における微生物の組成がまったく同じではないため、非常に困難です16。したがって、微生物と宿主の間の相互作用および関連するメカニズムを探索するには、理想的なモデルが必要です。 ナソニア ハチは、その多くの生物学的利点と無菌ハチの特性により、マイクロバイオーム分野で理想的なモデルとして使用できます6。抗生物質治療と比較して、無菌動物を使用することで、微生物の機能を研究するために重要な微生物の組成と量を制御できます。さらに、抗生物質治療は、抗生物質耐性、腸.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
資金提供:この研究は、中国国家科学財団(32270538)、中国国家重点研究開発プログラム(2022YFF0710603)、北京自然科学財団(6222046)、およびG.H.W.に授与されたCAS-CSIRO資金スキーム(152111KYSB20210011) による CAS戦略的資金提供によって支援されました。 著者の貢献:すべての著者がレビューの範囲と焦点を開発し、原稿の執筆に貢献しました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22滅菌真空フィルターNEST | 331011 | ||
| 10%次亜塩素酸ナトリウム | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS溶液 | Solarbio | P1020 | |
| 200メッシュナイロンネット | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24ウェルプレート | NEST | 702001 | |
| 8、1.2、0.8、および0.45 µmフィルター | 上海Xingya浄化材料工場 | HN-AA-JT-10079 | |
| 絶対エチルアルコール | マックリン | E809057-500ml | |
| 細胞ス | トレーナーBIOLOGIX | 15-1100 | |
| 商業ショウジョウバエ中型 | Boer | B645446-500ml | |
| 解剖針 | Bioroyee | 17-9140 | |
| ガーリックプレス | 淘宝網 | 番号なし | 淘宝網 |
| Lucillia sericata 蛹 | 合肥大園バイオテクノロジー株式会社 | カタログ番号なし | オバオで購入 |
| 小さな筆 | セスティデュール | BL0508 | |
| ステレオスコープ | SOPTOP | RX50 | |
| ピンセット | SALMART | A109001-56 |
参考文献
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551(2021).
- Pang, X., et al. Inter-specie....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
