Summary
12-24時間寄生した後、スズメバチ胚をルシリア・セリカータ蛹から解剖し、アルコールと10%次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄して無菌胚を得た。無菌胚を飼育し、in vitroで成長・発育するためのナソニア飼育培地を供給した後、無菌ナソニア成虫を得た。
Abstract
無菌飼育技術は、無菌またはほぼ無菌の条件下で昆虫を培養する方法であり、昆虫微生物叢に対する外部微生物の影響を効果的に排除し、昆虫微生物叢研究の急速な発展を促進することができます。 ナソニア (スズメバチ属)は、寿命が短い、遺伝的変異が高い、操作が簡単など、多くの利点を持つ寄生バチ昆虫であり、昆虫モデルシステムとして広く使用されています。動物の微生物の数を減らすことしかできない抗生物質処理とは異なり、無菌飼育技術は動物の微生物の組成と量の両方を制御することができ、宿主と微生物の相互作用の研究をさらに容易にします。ただし、以前のバージョンの ナソニア 飼育培地(NRM)には、複雑で時間のかかる調製プロセス、細菌や真菌による汚染の容易さ、保管時間の短縮など、いくつかの欠陥や問題があります。そこで本研究では、NRM調製工程で使用するツール、保管条件、成分比を最適化することで、これらの課題を解決した。最適化された培地は、-20°Cで少なくとも3ヶ月間保存することができ、無菌スズメバチの給餌中にNRM汚染の可能性を排除することができます。これにより、無菌性ナソニアの生存率と健康レベルがさらに向上し 、 微生物研究のモデルとして ナソニア を使用する上で重要です。
Introduction
無菌動物とは、検出可能な生きた微生物や寄生虫を持たない動物です1。無菌胚は、無菌条件下で母親を解剖し、続いてバリアシステム2で飼育することによって得ることができる。このような動物は、腸内細菌叢、免疫系、代謝など、動物に対する微生物の影響を研究するために使用できます1。特定の技術的手段により、多くの昆虫や哺乳類でさえも無菌にすることができます3,4。無菌動物は独自の役割を持ち、微生物学研究のさまざまな側面で広く使用されています5。たとえば、無菌のナソニアバチの使用は、微生物が長期的な外因性環境ストレスの下で宿主が新しい環境に適応するのを助けることができることを明らかにしました6,7。
ナソニア寄生生物は、ハエの蛹に卵を注入する小さな寄生バチです4。ナソニアには、ナソニア・ビトリペンニス、ナソニア・ロンギコルニス、ナソニア・ジローティ、ナソニア・オナイダ8の4種が知られています。N. vitripennisは世界中で見られますが、他の3種は北米では範囲が限られています4。 ナソニア寄生バチは、栽培が容易で、繁殖周期が短く、ゲノム配列が配列決定され、休眠が長期であるなどの特徴から、理想的なモデル昆虫と見なされています8,9。それらは、昆虫の進化、遺伝学、発生、行動、および共生のさまざまな側面を研究するために使用できます10。さらに、ナソニア寄生バチは、農業や病気における有害なハエを制御するのにも役立ちます11。無菌昆虫系の確立を成功させるには、(1)胚の滅菌と(2)in vitroでの幼虫への無菌餌の提供という2つの主要なステップが含まれます。無菌食品を得るために、ブルッカーとボーデンシュタイン12は、抗生物質、漂白剤、ウシ胎児血清などの化学物質を使用して細菌12を殺すことにより、2012年にナソニア飼育培地(NRMv1)を開発しました。しかし、化学滅菌法は、N. vitripennis13の生存率と溶出率が低くなりました。その後、2016年にShropshire et al.は、抗生物質やその他の物質の危険性を排除するために、化学滅菌法の代わりにフィルター滅菌法を使用してNRMv2を開発し、育種プロセスを最適化しました13。残念ながら、この方法には、培地の調製と使用に関連する課題や、胚、幼虫、閉鎖蛹の溺死、摂食不足、脱水のリスクなど、依然としていくつかの欠点があります14。WangとBrucker14は最近、Nasonia飼育培地バージョン3(NRMv3)と無菌飼育バージョン2(GFRv2)プロトコルを改善しました。これらの改善により、コストとメディア消費量が削減されました。ただし、NRMv3は保管時間が非常に短く、汚染の影響を非常に受けやすいです。
NRMv3に基づいて、この研究ではNRM調製ツールの保存方法と栄養素比が最適化されました。この方法論の改良により、微生物叢研究のモデルとしてN.ビトリペンニスを使用することが容易になります。Wangらが開発したNRMv3と比較して14、NRM原料の1つであるサルコファガブラタ蛹を圧搾するための改良ツールは、Wangらが使用した底穴のある60mLシリンジと比較して、S. bullata蛹組織液の生産効率を大幅に向上させます14。NRMの栄養比を調整したところ、無菌ナソニアバチの発育時間に影響を与えることなく、生存率が一定の増加につながりました。さらに、NRMを小容量遠沈管(1.5mL)に詰め、-20°Cの冷蔵庫で凍結して保存時間を延長しました。NRM調製の宿主および供給源としてイエバエのLucilia sericataを使用したが、このプロトコルは実験室で利用可能な他のNasonia宿主に適応できる可能性が高いことは注目に値する。
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Protocol
1.無菌 ナソニア 飼育培地の調製
- 市販の L. sericata 蛹( 材料表を参照)を、トレイや紙など、すべての蛹を収容できる表面に置きます。未発達の幼虫、暗い古い蛹、空の蛹の殻、おがくず、またはその他の不純物を捨てます。茶色がかった赤色の若い蛹だけを飼い、ビーカー(約3,000〜4,000匹の蛹)に移します。
注:多くの実験を行った後、暗い古い蛹から作られた培地は簡単に暗くなり、無菌ハチの発生を止めることがわかりました。この現象は、若い茶色がかった赤い蛹を使用して培地を生産するときには発生しませんでした。この理由はまだ不明であり、それを検証するにはさらなる調査が必要です。 - 蛹の表面全体を覆うのに十分な脱イオン水をビーカーに加えます。ビーカーの口をティンフォイルまたはガーゼで包み、ビーカーを振って蛹の表面の不純物を取り除き、水を注ぎます。3〜5回繰り返します。
- 洗浄したL. sericataの蛹をニンニクプレスのフィルタータンクに入れ、強く絞って、50mLの滅菌遠心チューブにL.sericataの蛹の組織液を集めます。次に、蛹のカスを注ぎ、すべてが絞られるまでニンニクプレスのフィルタータンクに新しい蛹を入れます。
注:Wangら14が使用した針押し出し装置と比較して、ニンニクプレスはより便利で、間質液をより完全に分離することができます。この進歩は、NRMの大規模生産と長期保管の基礎を築きます。 - 混合物を4°C(25,000 x g)で10分間遠心分離します。遠心分離後、混合物は下から上に沈殿物層、タンパク質層、脂肪層の3つの層に分離されます(図1)。
- ろ過中の目詰まりを防ぐために、18 Gの滅菌針を使用してタンパク質層を吸引し、新しい50 mLの円錐形の滅菌ポリプロピレン遠心分離管に移します。
- 市販の液体 ショウジョウバエ 培地( 材料表を参照)をタンパク質抽出物に1:1の比率で加えます。
注:NRMv3と比較して、より簡便な市販の L.セリカータ を宿主およびNRM原料として使用しました。したがって、栄養比は、無菌 ナソニア の成長と発達により適したNRMv3に基づいて1:2から1:1に調整されました(図2)。 - 混合培地(ショウジョウバエ 培地および L. sericata pupaのタンパク質抽出物)を、異なる孔径(8、1.2、0.8、および0.45μm; 材料の表を参照)の真空ろ過システムを使用してろ過し、異なるサイズの粒子を除去します。目詰まりを防ぐために、流れが遅くなったらろ紙を交換してください。
注:ろ過ごとに新しい50mL滅菌遠心チューブを使用する必要があります。 - 液体を4°C(15,000 x g)で10分間遠心分離し、0.22 μmシリンジフィルターを通して上清培地を滅菌します。上記の手順を一度繰り返します。
- 長期保存のために分注後、培養液を-20°Cで保存します(図3A)。
注意: 汚染や凍結融解の繰り返しを防ぐために、包装後に培地を使用する場合は、NRMの各チューブを一度だけ開くことをお勧めします(図3A)。
2.無菌卵収集
- 子孫のオスとメスの比率を安定させるために、一倍体の遺伝的特徴(オスは一倍体細胞から発生し、メスは受精卵に起因する二倍体細胞から発生する)のために、蛹の段階で50人のメス対15人のオスの比率でショウジョウバエバイアルに入れます)4,15。
- 成虫になった後、雄と雌を1.5日間交尾させてから、約40 L. sericata の蛹をバイアルに入れます。寄生後12〜24時間以内に、滅菌解剖針を使用して、実体顕微鏡下で蛹殻の一端を注意深く開きます(図4)。
- もう一方の端を手で持ち、スズメバチの胚を見つけます。解剖針を使用して、 L. sericata の蛹組織の表面からリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む滅菌細胞ストレーナーに胚を移します14。
注:乾燥したL.セリカタの蛹組織は胚を移植しやすいため、寄生には古いL.セリカタの蛹を使用する必要があります。L. sericataの蛹の組織表面からの卵子のスムーズな移動を確実にするために、解剖針が蛹ケースを開くときに組織を穿刺しないように注意して、間質液が流出しないように注意してください。
- 20〜30個の胚をセルストレーナーに置き、1,000 μLの10%市販次亜塩素酸ナトリウム溶液( 材料の表を参照)で均一に洗浄した後、1,000 μLの1x滅菌PBSで再度洗浄します。その後、1,000 μLの70%エタノール溶液で1回洗浄し、1,000 μLの1x滅菌PBSで3回洗浄します。
- まず、1x PBSで事前に湿潤した直径5 mmのポリプロピレンメッシュシート( 材料の表を参照)を24ウェルプレートに入れます。次に、滅菌した小さなブラシを使用して、スズメバチの胚を細胞ストレーナー上のポリプロピレンメッシュシート上にそっとブラシをかけます。これは、24ウェルプレートの垂直カラム内の4つのウェルすべてに対して行うことができます。
3.無菌ハチ飼育
- 50 μLのNRMを層流フード内の各ウェルに加えます。増殖のための湿度の高い環境を維持するために、24ウェルプレートの各ウェル間に1 mLの滅菌水を追加します。30mLの滅菌水を含む小さなビーカーを、24ウェルプレートを備えた5Lの滅菌プラスチックボックスに入れることもできます。
- 実験全体を通して、滅菌プラスチックボックスと24ウェルプレートを25±2°Cの一定温度の恒温恒温恒温室内に保ち、一定の光の下に保管してください。
- NRMを毎日移して追加する前に、冷凍NRMを層流ベンチで解凍してください。無菌環境では、アルコール消毒したピンセットを使用して、幼虫が入ったポリプロピレンメッシュをあるウェルから別のウェルに移します。最後に、室温に平衡化されたNRMを50μL添加します(図3B)。蛹が観察されるまで毎日上記の操作を繰り返します。
注:スズメバチの発生に伴い、無菌ハチが十分な栄養を持っていることを確認するために、NRMの量を適切に増やす必要があります。例えば、4齢幼虫には60〜70μLのNRMが供給された。同じウェルに異なる発達段階が共存する可能性があるため、滅菌ブラシを使用して蛹を移します。残りの幼虫に少量のNRMを追加します。微生物の侵入や汚染を避けるために無菌技術を使用してください。 - 9〜11日間摂食した後、幼虫の80%以上が白または黄色の蛹に成長します。この時点で、フィルターをクリーンウェルプレートに移動し、培地の追加を停止して、エクローションを待ちます。
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Representative Results
NRMの調製効率は、調製ツールの改善により大幅に改善されました。さらに、給餌プロセスにおけるNRM汚染の問題は、戦略と保存方法を最適化することによって排除されました。同時に、調整されたNRMは、 L. sericata を宿主とする無菌ハチの成長と発達により適した栄養比を示しました。幼虫から蛹までの無菌バチの生存率は、GFRv2を用いてNRMv3で飼育した無菌バチと比較して有意に改善されました(図2)。また、無菌スズメバチと従来飼育スズメバチとの間で発生期間に差はなかった(世代あたり約14日)(図5)。これらの改良は、 Nasonia モデル生物の開発や宿主と微生物の相互作用機構の研究にとって非常に重要です。
図1:遠心分離により分離した混合物。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:各トランスウェルにおける幼虫と蛹の生存率。 生存率は、GFRv2でNRMv3で飼育された無菌雌と比較して有意に改善した(2つの独立したサンプルT検定、*p < 0.05)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NRM調剤と無菌スズメバチ飼育の模式図。 (a)50 mL遠沈管からろ過したNRMを滅菌済みの1.5 mL遠沈管に分注し、凍結した。NRMの各チューブは一度だけ開かれました。(B)ナソニアスズメバチの胚の下にポリプロピレンメッシュシートがありました。遠沈管には包装されたNRMが含まれていました。「14日目っぽい」とは、成虫の出現が約14日目に起こることを意味します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:実体顕微鏡下で移したスズメバチの卵の画像。ナソニアハチが産んだ卵は赤い破線の箱の中にあります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:開発時間の比較。 無菌雌の発育時間(約14日)は、この研究の改良されたNRMを使用した場合、従来の飼育スズメバチの発育時間と有意差はありませんでした(2つの独立したサンプルT検定、ns、有意ではない、p > 0.05)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ゲノミクスやメタボロミクスなどのハイスループット検出技術の適用により、研究者は腸内細菌叢に大きな遺伝的多様性と代謝の複雑さがあることに徐々に気づきました16。これらの共生細菌は、宿主17との複雑な相互作用を通じて、宿主の栄養代謝、腫瘍、免疫、老化などの様々な生理学的または病理学的状態に密接に関連している。しかし、宿主における微生物集団の組成と機能のネットワークに関する研究は、各自然個体における微生物の組成がまったく同じではないため、非常に困難です16。したがって、微生物と宿主の間の相互作用および関連するメカニズムを探索するには、理想的なモデルが必要です。 ナソニア ハチは、その多くの生物学的利点と無菌ハチの特性により、マイクロバイオーム分野で理想的なモデルとして使用できます6。抗生物質治療と比較して、無菌動物を使用することで、微生物の機能を研究するために重要な微生物の組成と量を制御できます。さらに、抗生物質治療は、抗生物質耐性、腸の機能障害、腸のバリアの損傷など、いくつかの副作用を引き起こす可能性があります18。したがって、無菌スズメバチを得るためのより効率的な方法を開発することは、宿主と微生物叢の相互作用を研究する上で非常に重要です。
無菌ナソニアの獲得には、主に無菌胚の入手と無菌食品の提供という2つのステップが含まれます。胚は、N. vitripennis寄生の12〜24時間後にL. sericata蛹をステレオスコープ13で解剖することによって得られた。このステップでは、胚をより速く、細胞ストレーナーに損傷を与えることなく移動させるのに十分なスキルが必要でした。経験に基づいて、黒い古いL.セリカタ蛹を解剖する方が便利です。しかしながら、若い赤色L.セリカタ蛹は、NRMを調製するために好ましい。
さらに、無菌胚の正常な発生は、無菌食品の生産および毎日培地を交換する操作プロセスに依存していた12。我々は、Wangらの14GFRv2による無菌ハチの飼育の主な汚染源がNRMであることがわかった。そこで、本研究では培養液を-20°Cの冷蔵庫に詰めて保存し、各培地が1回だけ開封されるようにした。これは、ナソニアバチの成長と発達に影響を与えなかっただけでなく、培地の保存時間を大幅に延長し、NRM汚染の可能性を排除しました。全体として、この方法は無菌ハチの生存率をさらに高めた。
しかしながら、本方法は依然としていくつかの欠点を有する。例えば、24ウェルプレートでの滅菌胚の毎日の移動は、汚染のリスクを高める可能性があります。さらに、大量のハエの蛹を絞るプロセスもまた、時間と労働集約的である。ハエの蛹で役割を果たす特定の栄養素を特定できれば、それらを購入して培地に直接添加することができ、NRM調製の効率が大幅に向上します。本手法は、今後の研究においてさらなる最適化が期待されます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
資金提供:この研究は、中国国家科学財団(32270538)、中国国家重点研究開発プログラム(2022YFF0710603)、北京自然科学財団(6222046)、およびG.H.W.に授与されたCAS-CSIRO資金スキーム(152111KYSB20210011) による CAS戦略的資金提供によって支援されました。 著者の貢献:すべての著者がレビューの範囲と焦点を開発し、原稿の執筆に貢献しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
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