Summary

Optimering af opdrætsproceduren for kimfrie hveps

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Nasonia hvepseembryoner blev dissekeret fra Lucillia sericata pupper efter parasitering i 12-24 timer og vasket med alkohol og 10% natriumhypochloritopløsning for at opnå kimfrie embryoner. Efter opdræt af de kimfrie embryoner og levering af Nasonia-opdrætsmedium til at vokse og udvikle in vitro, blev kimfrie Nasonia-voksne opnået.

Abstract

Aseptisk opdrætsteknologi er en metode til dyrkning af insekter under sterile eller næsten sterile forhold, som effektivt kan eliminere eksterne mikroorganismers indflydelse på insekters mikrobiota og dermed fremme den hurtige udvikling af forskning i insektmikrobiota. Nasonia (hvepseslægt) er et parasitisk hvepseinsekt, der har mange fordele, såsom en kort levetid, høj genetisk variation, nem betjening osv., Og bruges i vid udstrækning som et insektmodelsystem. I modsætning til antibiotikabehandling, som kun kan reducere antallet af mikroorganismer hos dyr, kan aseptiske opdrætsteknikker kontrollere både sammensætningen og mængden af mikroorganismer hos dyr, hvilket yderligere letter undersøgelsen af interaktioner mellem vært og mikrober. Tidligere versioner af Nasonia-opdrætsmedium (NRM) har dog nogle defekter og problemer, såsom en kompleks og tidskrævende forberedelsesproces, let forurening med bakterier eller svampe og kort opbevaringstid. Derfor løser denne undersøgelse disse problemer ved at optimere de værktøjer, der anvendes i NRM-forberedelsesprocessen, opbevaringsforhold og komponentforhold. Det optimerede medium kan tillade opbevaring ved -20 °C i mindst 3 måneder og eliminere muligheden for NRM-kontaminering under fodring af sterile hvepse. Dette forbedrer yderligere overlevelsesraten og sundhedsniveauet for aseptisk Nasonia , hvilket er vigtigt for at bruge Nasonia som model for mikrobiel forskning.

Introduction

Kimfrie dyr er dyr, der ikke har påviselige levende mikroorganismer og parasitter1. Kimfrie embryoner kan opnås ved at dissekere moderen under aseptiske forhold og efterfølgende opfostres i barrieresystemer2. Sådanne dyr kan bruges til at studere virkningerne af mikroorganismer på dyr, såsom på tarmmikrobiotaen, immunsystemet og stofskiftet1. Med visse tekniske midler kan mange insekter og endda pattedyr gøres sterile 3,4. Bakteriefrie dyr spiller en unik rolle og har været meget udbredt i forskellige aspekter af mikrobiologisk forskning5. For eksempel har brugen af kimfri Nasonia-hvepse afsløret, at mikroorganismer kan hjælpe værter med at tilpasse sig nye miljøer under langvarig eksogen miljøbelastning 6,7.

Nasonia parasitoider er små parasitære hveps, der injicerer deres æg i fluens pupper4. Der er fire kendte arter af Nasonia, herunder Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti og Nasonia oneida8. N. vitripennis findes over hele verden, mens de tre andre arter har begrænsede områder i Nordamerika4. Nasonia parasitoide hvepse betragtes som ideelle modelinsekter på grund af deres egenskaber, såsom let dyrkning, kort reproduktionscyklus, sekventeret genom og langvarig diapause 8,9. De kan bruges til at studere forskellige aspekter af insektudvikling, genetik, udvikling, adfærd og symbiose10. Desuden kan Nasonia parasitoide hvepse også hjælpe med at kontrollere skadelige fluer i landbruget og sygdom11. En vellykket etablering af et sterilt insektsystem indebærer to hovedtrin: (1) sterilisering af embryonerne og (2) levering af steril mad til larverne in vitro. For at opnå steril mad udviklede Brucker og Bordenstein 12 Nasonia-opdrætsmedium (NRMv1) i 2012 ved at bruge kemikalier som antibiotika, blegemiddel og føtalt bovin serum til at dræbe bakterier12. Den kemiske steriliseringsmetode resulterede imidlertid i lave overlevelses- og eclosionsrater af N. vitripennis13. Derefter udviklede Shropshire et al. i 2016 NRMv2 ved hjælp af en filtersteriliseringsmetode i stedet for en kemisk steriliseringsmetode for at eliminere farerne ved antibiotika og andre stoffer og optimerede avlsprocessen13. Desværre har denne metode stadig nogle ulemper, såsom udfordringerne forbundet med forberedelse og brug af mediet samt risikoen for drukning, underfodring eller dehydrering for embryoner, larver og lukkede pupper14. Wang og Brucker14 forbedrede for nylig Nasonia opdrætsmedier version 3 (NRMv3) og de kimfri opdræt version 2 (GFRv2) protokoller. Disse forbedringer reducerede omkostningerne og medieforbruget. NRMv3 har dog en meget kort opbevaringstid og er meget modtagelig for kontaminering.

Med udgangspunkt i NRMv3 blev NRM-forberedelsesværktøjets opbevaringsmetode og næringsstofforhold optimeret i denne undersøgelse. Denne metodologiske forbedring letter brugen af N. vitripennis som model for mikrobiomundersøgelser. Sammenlignet med NRMv3 udviklet af Wang et al.14 forbedrer det forbedrede værktøj til presning af Sarcophaga bullata puppe, et af NRM-råmaterialerne, i høj grad produktionseffektiviteten af S. bullata puppevævsvæske sammenlignet med 60 ml sprøjten med et bundhul, der anvendes af Wang et al.14. Vi justerede næringsstofforholdet mellem NRM, hvilket førte til en vis stigning i overlevelsesraten for kimfrie Nasonia-hvepse uden at påvirke deres udviklingstid. Derudover blev NRM pakket i centrifugerør med lille kapacitet (1,5 ml) og frosset i et køleskab på -20 °C for at forlænge opbevaringstiden. Det er værd at bemærke, at mens vi brugte stuefluen Lucilia sericata som vært og kilde til NRM-forberedelse, kan denne protokol sandsynligvis tilpasses til andre Nasonia-værter, der er tilgængelige i laboratoriet.

Protocol

1. Fremstilling af kimfritNasonia-opdrætsmedium  Placer de kommercielt tilgængelige L. sericata pupper (se Tabel over materialer) på en overflade, der kan rumme alle pupperne, såsom en bakke eller et ark papir. Kassér eventuelle underudviklede larver, mørke gamle pupper, tomme puppeskaller, savsmuld eller andre urenheder. Opbevar kun unge pupper, der er brunrøde i farven, og overfør dem til et bægerglas (ca. 3.000-4.000 pupper).B…

Representative Results

Forberedelseseffektiviteten af NRM blev stærkt forbedret ved at forbedre forberedelsesværktøjerne. Derudover blev problemet med NRM-forurening i fodringsprocessen elimineret ved at optimere strategien og bevaringsmetoden. Samtidig havde den justerede NRM et mere passende ernæringsforhold til vækst og udvikling af kimfrie hvepse med L. sericata som værter. Overlevelsesraten for bakteriefrie hvepse fra larver til pupper blev signifikant forbedret sammenlignet med kimfrie hvepse opdrættet med NRMv3 ved hjæl…

Discussion

Med anvendelsen af high-throughput detektionsteknologier såsom genomik og metabolomics har forskere gradvist indset, at der er enorm genetisk mangfoldighed og metabolisk kompleksitet i tarmmikrobiota16. Disse symbiotiske bakterier er tæt forbundet med forskellige fysiologiske eller patologiske tilstande, såsom værtens ernæringsmæssige metabolisme, tumorer, immunitet og aldring gennem komplekse interaktioner med værten17. Forskningen relateret til netværket af sammen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation of China (32270538), National Key R&D Program of China (2022YFF0710603), Natural Science Foundation of Beijing (6222046) og CAS strategiske finansiering via CAS-CSIRO-finansieringsordningen (152111KYSB20210011) tildelt G.H.W. Forfatterbidrag: alle forfattere udviklede omfanget og fokus for gennemgangen og bidrog til skrivningen af manuskriptet.

Materials

0.22 Sterile vacuum filter NEST 331011
10% SodiumHypochlorite LIRCON XB-84BS-1
1x PBS solution Solarbio P1020
200 mesh nylon net BIOBYING BY-378Z
24 well-plate NEST 702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters Shanghai Xingya Purification Material Factory HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol Macklin E809057-500ml
Cell Strainer BIOLOGIX 15-1100
Commercial Drosophila Medium Boer B645446-500ml
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Garlic press Taobao No Catalog numbers Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. No Catalog numbers Purchase on Taobao
Small writing brush Cestidur BL0508
Stereoscope SOPTOP RX50
Tweezers SALMART A109001-56

References

  1. Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
  2. Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
  3. Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
  4. Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
  5. Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
  6. Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
  7. Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
  8. Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
  9. Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
  10. Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
  11. Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
  12. Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
  13. Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
  14. Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
  15. Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
  16. Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
  17. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
  18. Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).

Play Video

Cite This Article
Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps. J. Vis. Exp. (197), e65292, doi:10.3791/65292 (2023).

View Video