Optimering af opdrætsproceduren for kimfrie hveps

Summary

Nasonia hvepseembryoner blev dissekeret fra Lucillia sericata pupper efter parasitering i 12-24 timer og vasket med alkohol og 10% natriumhypochloritopløsning for at opnå kimfrie embryoner. Efter opdræt af de kimfrie embryoner og levering af Nasonia-opdrætsmedium til at vokse og udvikle in vitro, blev kimfrie Nasonia-voksne opnået.

Abstract

Aseptisk opdrætsteknologi er en metode til dyrkning af insekter under sterile eller næsten sterile forhold, som effektivt kan eliminere eksterne mikroorganismers indflydelse på insekters mikrobiota og dermed fremme den hurtige udvikling af forskning i insektmikrobiota. Nasonia (hvepseslægt) er et parasitisk hvepseinsekt, der har mange fordele, såsom en kort levetid, høj genetisk variation, nem betjening osv., Og bruges i vid udstrækning som et insektmodelsystem. I modsætning til antibiotikabehandling, som kun kan reducere antallet af mikroorganismer hos dyr, kan aseptiske opdrætsteknikker kontrollere både sammensætningen og mængden af mikroorganismer hos dyr, hvilket yderligere letter undersøgelsen af interaktioner mellem vært og mikrober. Tidligere versioner af Nasonia-opdrætsmedium (NRM) har dog nogle defekter og problemer, såsom en kompleks og tidskrævende forberedelsesproces, let forurening med bakterier eller svampe og kort opbevaringstid. Derfor løser denne undersøgelse disse problemer ved at optimere de værktøjer, der anvendes i NRM-forberedelsesprocessen, opbevaringsforhold og komponentforhold. Det optimerede medium kan tillade opbevaring ved -20 °C i mindst 3 måneder og eliminere muligheden for NRM-kontaminering under fodring af sterile hvepse. Dette forbedrer yderligere overlevelsesraten og sundhedsniveauet for aseptisk Nasonia , hvilket er vigtigt for at bruge Nasonia som model for mikrobiel forskning.

Introduction

Kimfrie dyr er dyr, der ikke har påviselige levende mikroorganismer og parasitter¹. Kimfrie embryoner kan opnås ved at dissekere moderen under aseptiske forhold og efterfølgende opfostres i barrieresystemer². Sådanne dyr kan bruges til at studere virkningerne af mikroorganismer på dyr, såsom på tarmmikrobiotaen, immunsystemet og stofskiftet¹. Med visse tekniske midler kan mange insekter og endda pattedyr gøres sterile ^3,4. Bakteriefrie dyr spiller en unik rolle og har været meget udbredt i forskellige aspekter af mikrobiologisk forskning⁵. For eksempel har brugen af kimfri Nasonia-hvepse afsløret, at mikroorganismer kan hjælpe værter med at tilpasse sig nye miljøer under langvarig eksogen miljøbelastning ^6,7.

Nasonia parasitoider er små parasitære hveps, der injicerer deres æg i fluens pupper⁴. Der er fire kendte arter af Nasonia, herunder Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti og Nasonia oneida⁸. N. vitripennis findes over hele verden, mens de tre andre arter har begrænsede områder i Nordamerika⁴. Nasonia parasitoide hvepse betragtes som ideelle modelinsekter på grund af deres egenskaber, såsom let dyrkning, kort reproduktionscyklus, sekventeret genom og langvarig diapause ^8,9. De kan bruges til at studere forskellige aspekter af insektudvikling, genetik, udvikling, adfærd og symbiose¹⁰. Desuden kan Nasonia parasitoide hvepse også hjælpe med at kontrollere skadelige fluer i landbruget og sygdom¹¹. En vellykket etablering af et sterilt insektsystem indebærer to hovedtrin: (1) sterilisering af embryonerne og (2) levering af steril mad til larverne in vitro. For at opnå steril mad udviklede Brucker og Bordenstein 12 Nasonia-opdrætsmedium (NRMv1) i 2012 ved at bruge kemikalier som antibiotika, blegemiddel og føtalt bovin serum til at dræbe bakterier¹². Den kemiske steriliseringsmetode resulterede imidlertid i lave overlevelses- og eclosionsrater af N. vitripennis¹³. Derefter udviklede Shropshire et al. i 2016 NRMv2 ved hjælp af en filtersteriliseringsmetode i stedet for en kemisk steriliseringsmetode for at eliminere farerne ved antibiotika og andre stoffer og optimerede avlsprocessen¹³. Desværre har denne metode stadig nogle ulemper, såsom udfordringerne forbundet med forberedelse og brug af mediet samt risikoen for drukning, underfodring eller dehydrering for embryoner, larver og lukkede pupper¹⁴. Wang og Brucker¹⁴ forbedrede for nylig Nasonia opdrætsmedier version 3 (NRMv3) og de kimfri opdræt version 2 (GFRv2) protokoller. Disse forbedringer reducerede omkostningerne og medieforbruget. NRMv3 har dog en meget kort opbevaringstid og er meget modtagelig for kontaminering.

Med udgangspunkt i NRMv3 blev NRM-forberedelsesværktøjets opbevaringsmetode og næringsstofforhold optimeret i denne undersøgelse. Denne metodologiske forbedring letter brugen af N. vitripennis som model for mikrobiomundersøgelser. Sammenlignet med NRMv3 udviklet af Wang et al.14 forbedrer det forbedrede værktøj til presning af Sarcophaga bullata puppe, et af NRM-råmaterialerne, i høj grad produktionseffektiviteten af S. bullata puppevævsvæske sammenlignet med 60 ml sprøjten med et bundhul, der anvendes af Wang et al.14. Vi justerede næringsstofforholdet mellem NRM, hvilket førte til en vis stigning i overlevelsesraten for kimfrie Nasonia-hvepse uden at påvirke deres udviklingstid. Derudover blev NRM pakket i centrifugerør med lille kapacitet (1,5 ml) og frosset i et køleskab på -20 °C for at forlænge opbevaringstiden. Det er værd at bemærke, at mens vi brugte stuefluen Lucilia sericata som vært og kilde til NRM-forberedelse, kan denne protokol sandsynligvis tilpasses til andre Nasonia-værter, der er tilgængelige i laboratoriet.

Protocol

1. Fremstilling af kimfritNasonia-opdrætsmedium 

1. Placer de kommercielt tilgængelige L. sericata pupper (se Tabel over materialer) på en overflade, der kan rumme alle pupperne, såsom en bakke eller et ark papir. Kassér eventuelle underudviklede larver, mørke gamle pupper, tomme puppeskaller, savsmuld eller andre urenheder. Opbevar kun unge pupper, der er brunrøde i farven, og overfør dem til et bægerglas (ca. 3.000-4.000 pupper).
   BEMÆRK: Efter at have udført mange eksperimenter blev det konstateret, at mediet fremstillet af de mørke gamle pupper let blev mørkt og stoppede udviklingen af kimfrie hveps. Dette fænomen forekom ikke, når man brugte de unge brunrøde pupper til at producere medium. Årsagen til dette er stadig uklar og kræver yderligere undersøgelse for at verificere det.
2. Tilsæt nok deioniseret vand til bægerglasset til at dække hele puppernes overflade. Pakk bægerglassets mund med stanniol eller gasbind, ryst bægerglasset for at rense urenhederne på overfladen af pupperne, og hæld derefter vandet ud. Gentag tre til fem gange.
3. Anbring de rensede L. sericata pupper i filtertanken i en hvidløgspresse, klem hårdt og opsaml vævsvæsken fra L. sericata pupper i et 50 ml sterilt centrifugerør . Hæld derefter puppedråberne ud og læg nye pupper i hvidløgspressens filtertank, indtil alle er presset.
   BEMÆRK: Sammenlignet med nåleekstruderingsenheden, der anvendes af Wang et ^al.14, er hvidløgspressen mere praktisk og kan adskille den interstitielle væske mere grundigt. Dette fremskridt lægger grundlaget for storskala produktion og langtidslagring af NRM.
4. Centrifuger blandingen ved 4 °C (25.000 x g) i 10 min. Efter centrifugering adskilles blandingen i tre lag fra bund til top: sedimentlag, proteinlag og fedtlag (figur 1).
5. For at forhindre tilstopning under filtrering aspireres proteinlaget med en 18 G steril nål og overføres til et nyt 50 ml konisk sterilt polypropylencentrifugerør.
6. Tilsæt kommercielt flydende Drosophila-medium (se materialetabel) til proteinekstraktet i forholdet 1:1.
   BEMÆRK: Mere praktisk kommercialiseret L. sericata blev brugt som værts- og NRM-råmateriale sammenlignet med NRMv3. Derfor blev ernæringsforholdet justeret fra 1:2 til 1:1 baseret på NRMv3, som var mere egnet til vækst og udvikling af steril Nasonia (figur 2).
7. Filtrer det blandede medium (Drosophila-medium og proteinekstrakt af L. sericata pupa) ved hjælp af et vakuumfiltreringssystem med forskellige porestørrelser (8, 1,2, 0,8 og 0,45 μm; se materialetabel) for at fjerne partikler af forskellig størrelse. For at forhindre tilstopning skal du skifte filterpapir, når strømmen bliver langsommere.
   BEMÆRK: Brug af et nyt 50 ml sterilt centrifugerør er påkrævet til hver filtrering.
8. Væsken centrifugeres igen ved 4 °C (15.000 x g) i 10 minutter og supernatantsubstratet steriliseres gennem et 0,22 μm sprøjtefilter. Gentag ovenstående trin én gang.
9. Dyrkningsmediet opbevares ved -20 °C efter aliquotering (figur 3A) til langtidsopbevaring.
   BEMÆRK: For at forhindre kontaminering og gentagen frysning og optøning anbefales det kun at åbne hvert rør NRM én gang, når dyrkningsmediet anvendes efter emballering (figur 3A).

2. Kimfri ægopsamling

1. For at sikre et stabilt forhold mellem mænd og kvinder hos afkom skal pupperne placeres i et hætteglas med Drosophila i puppestadiet i et forhold på 50 hunner til 15 hanner på grund af deres haploide genetiske egenskaber (hanner udvikler sig fra haploide celler, mens hunner udvikler sig fra diploide celler, der er resultatet af befrugtede æg)^4,15.
   1. Efter at være kommet frem til voksne, lad hannerne og hunnerne parre sig i 1,5 dage, og sæt derefter ca. 40 L. sericata pupper i hætteglasset. Inden for 12-24 timer efter parasitering skal du bruge en steril dissekeringsnål til forsigtigt at åbne den ene ende af puppeskallen under et stereomikroskop (figur 4).
   2. Hold den anden ende i hånden og find hvepseembryonerne. Brug en disseknål til at overføre embryoner fra overfladen af L. sericata puppevævet til en steril cellesi med fosfatbufret saltvand (PBS)¹⁴.
      BEMÆRK: Ældre L. sericata pupper bør anvendes til parasitisme, fordi det tørre L. sericata puppevæv er lettere at overføre embryoner. For at sikre en jævn overførsel af æg fra L. sericata puppevævsoverfladen skal du prøve at være forsigtig med ikke at punktere vævet, når disseknålen åbner puppehuset, så den interstitielle væske ikke strømmer ud.
2. Anbring 20-30 embryoner på en cellesi og vask dem jævnt med 1.000 μL 10% kommerciel natriumhypochloritopløsning (se materialetabel), efterfulgt af en anden vask med 1.000 μL 1x steril PBS. Derefter vaskes en gang med 1.000 μL 70% ethanolopløsning og vaskes tre gange med 1.000 μL 1x steril PBS.
3. Først anbringes et polypropylennetark med en diameter på 5 mm (se materialetabellen), der er forvædet med 1x PBS, i en plade med 24 brønde. Derefter børstes hvepseembryonerne forsigtigt på cellesilen på polypropylennetpladen ved hjælp af en steriliseret lille børste. Dette kan gøres for alle fire brønde i en lodret søjle af 24-brøndpladen.

3. Kimfri hvepseopdræt

1. Der tilsættes 50 μL NRM til hvert hul i en laminar strømningshætte. For at opretholde et fugtigt miljø for vækst tilsættes 1 ml sterilt vand mellem hver brønd i 24-brøndpladen. Et lille bægerglas indeholdende 30 ml sterilt vand kan også placeres i 5 L steril plastkasse med 24-brøndpladen.
   1. Under hele forsøget opbevares den sterile plastkasse og pladen med 24 brønde i et klimakammer ved en konstant temperatur på 25 ± 2 °C og under konstant lys.
2. Før du overfører og tilføjer NRM hver dag, skal du optø den frosne NRM på en laminar flowbænk. I et sterilt miljø skal du bruge alkoholdesinficeret pincet til at overføre polypropylennettet med larver på det fra den ene brønd til den anden. Til sidst tilsættes 50 μL NRM, der er ekvilibreret til stuetemperatur (figur 3B). Gentag ovenstående operationer hver dag, indtil pupper observeres.
   BEMÆRK: Med udviklingen af hvepse bør mængden af NRM øges passende for at sikre, at de bakteriefrie hvepse har tilstrækkelig ernæring. For eksempel blev de fjerde stjernelarver forsynet med 60 til 70 μL NRM. Da forskellige udviklingsstadier kan eksistere sammen i samme brønd, skal du bruge en steriliseret børste til at overføre pupperne. Tilsæt en lille mængde NRM til de resterende larver. Brug aseptiske teknikker til at undgå mikrobiel invasion og forurening.
3. Efter fodring i 9 til 11 dage udvikler mere end 80% af larverne sig til hvide eller gule pupper. På dette tidspunkt skal du flytte filteret til en ren brøndplade og stoppe med at tilføje kulturmedium for at vente på eclosion.

Representative Results

Forberedelseseffektiviteten af NRM blev stærkt forbedret ved at forbedre forberedelsesværktøjerne. Derudover blev problemet med NRM-forurening i fodringsprocessen elimineret ved at optimere strategien og bevaringsmetoden. Samtidig havde den justerede NRM et mere passende ernæringsforhold til vækst og udvikling af kimfrie hvepse med L. sericata som værter. Overlevelsesraten for bakteriefrie hvepse fra larver til pupper blev signifikant forbedret sammenlignet med kimfrie hvepse opdrættet med NRMv3 ved hjælp af GFRv2 (figur 2). Endvidere var generationsperioden ikke forskellig mellem de aseptiske hvepse og de konventionelt opdrættede hvepse (ca. 14 dage pr. generation) (figur 5). Disse forbedringer er meget vigtige for udviklingen af Nasonia-modelorganismen og studiet af værtsmikroorganismeinteraktionsmekanismen.

Figur 1: Blanding separeret ved centrifugering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Overlevelsesraten for larver til pupper i hver transwell. Overlevelsesraten blev signifikant forbedret sammenlignet med kimfrie hunner opdrættet på NRMv3 med GFRv2 (to uafhængige prøver T-tests, *p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Skematisk diagram over NRM-dispensering og kimfri hvepseopdræt. (A) Det filtrerede NRM fra 50 ml centrifugerøret blev aliquoteret i sterile 1,5 ml centrifugeglas og frosset. Hvert rør af NRM blev kun åbnet én gang. (B) Der var et polypropylennetark under embryonerne fra Nasonia-hvepsene. Centrifugerøret indeholdt det emballerede NRM. "Dag 14-ish" betyder, at voksen fremkomst sker omkring den 14^{. dag.} Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Billeder af overførte hvepseæg under stereomikroskopet. Æggene lagt af Nasonia-hvepsen er inden for den røde stiplede kasse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Sammenligning af udviklingstid. Udviklingstiden for bakteriefrie hunner (ca. 14 dage) var ikke signifikant forskellig fra udviklingstiden for de konventionelt opdrættede hvepse, når den forbedrede NRM i denne undersøgelse blev anvendt (to uafhængige T-tests, ns, ikke signifikant, p > 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Med anvendelsen af high-throughput detektionsteknologier såsom genomik og metabolomics har forskere gradvist indset, at der er enorm genetisk mangfoldighed og metabolisk kompleksitet i tarmmikrobiota¹⁶. Disse symbiotiske bakterier er tæt forbundet med forskellige fysiologiske eller patologiske tilstande, såsom værtens ernæringsmæssige metabolisme, tumorer, immunitet og aldring gennem komplekse interaktioner med værten¹⁷. Forskningen relateret til netværket af sammensætningen og funktionen af den mikrobielle population i værten er imidlertid meget vanskelig, fordi sammensætningen af mikroorganismer i hvert naturligt individ ikke er nøjagtig den samme¹⁶. Derfor er der behov for en ideel model til at udforske interaktionen og relaterede mekanismer mellem mikroorganismer og værter. Nasonia-hvepse kan bruges som en ideel model inden for mikrobiomområdet på grund af dets mange biologiske fordele og egenskaberne ved kimfrie hvepse⁶. Sammenlignet med antibiotikabehandling giver brug af sterile dyr mulighed for kontrol over sammensætningen og mængden af mikroorganismer, hvilket er afgørende for at studere mikrobiel funktion. Derudover kan antibiotikabehandling føre til flere bivirkninger, herunder antibiotikaresistens, intestinal dysfunktion og tarmbarriereskader¹⁸. Derfor er udvikling af en mere effektiv metode til opnåelse af kimfrie hveps af stor betydning for at studere værtsmikrobiominteraktioner.

Erhvervelsen af kimfri Nasonia omfatter hovedsageligt to trin - opnåelse af sterile embryoner og levering af steril mad. Embryonerne blev opnået ved at dissekere L. sericata pupper 12-24 timer efter N. vitripennis parasitering under et stereoskop¹³. Dette trin krævede tilstrækkelig dygtighed til at flytte embryonerne hurtigere og uden at beskadige dem til cellesilen. Baseret på erfaring er det mere bekvemt at dissekere de gamle L. sericata pupper, der er sorte. Imidlertid foretrækkes unge røde L. sericata pupper til fremstilling af NRM.

Desuden var den normale udvikling af sterile embryoner afhængig af produktionen af steril mad og driftsprocessen med at skifte medium hver dag¹². Vi fandt ud af, at den vigtigste kilde til forurening til opdræt af kimfrie hvepse med Wang et al.'s¹⁴ GFRv2 var NRM. Derfor blev kulturen pakket og opbevaret i køleskabet ved -20 °C i denne undersøgelse, hvilket sikrede, at hvert medium kun åbnes én gang. Dette havde ikke kun nogen effekt på væksten og udviklingen af Nasonia-hvepse, men forlængede også dyrkningsmediets opbevaringstid kraftigt og eliminerede risikoen for NRM-forurening. I alt øgede denne metode yderligere overlevelsesraten for aseptiske hveps.

Den nuværende metode har dog stadig nogle ulemper. For eksempel kan den daglige overførsel af sterile embryoner i en 24-brøndplade øge risikoen for forurening. Derudover er processen med at klemme en masse fluepupper også tidskrævende og arbejdskrævende. Hvis de specifikke næringsstoffer, der spiller en rolle i fluepupperne, kan identificeres, kan de købes og tilsættes direkte til mediet, hvilket i høj grad ville forbedre effektiviteten af NRM-præparatet. Det forventes, at denne metode vil blive yderligere optimeret i fremtidig forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56