Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En tredimensionell teknik för visualisering av mitokondriella ultrastrukturella förändringar i bukspottskörtelcancerceller

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver hur man rekonstruerar mitokondriella cristae för att uppnå 3D-avbildning med hög noggrannhet, hög upplösning och hög genomströmning.

Abstract

Att förstå de dynamiska egenskaperna hos cellorganellens ultrastruktur, som inte bara är rik på okänd information utan också sofistikerad ur ett tredimensionellt (3D) perspektiv, är avgörande för mekanistiska studier. Elektronmikroskopi (EM) erbjuder bra bilddjup och möjliggör rekonstruktion av högupplösta bildstaplar för att undersöka den ultrastrukturella morfologin hos cellulära organeller även på nanometerskala; därför blir 3D-rekonstruktion allt viktigare på grund av dess ojämförliga fördelar. Svepelektronmikroskopi (SEM) ger en bildinsamlingsteknik med hög genomströmning som gör det möjligt att rekonstruera stora strukturer i 3D från samma intresseområde i på varandra följande skivor. Därför blir tillämpningen av SEM i storskalig 3D-rekonstruktion för att återställa den sanna 3D-ultrastrukturen hos organeller allt vanligare. I detta protokoll föreslår vi en kombination av seriell ultratunn sektion och 3D-rekonstruktionstekniker för att studera mitokondriella cristae i bukspottskörtelcancerceller. Detaljerna om hur dessa tekniker utförs beskrivs i detta protokoll steg för steg, inklusive osmium-tiokarbohydrazid-osmiummetoden (OTO), den seriella ultratunna sektionsavbildningen och visualiseringsdisplayen.

Introduction

Mitokondrier är en av de viktigaste organellerna i cellen. De fungerar som det centrala navet för cellulär bioenergetik och metabolism 1,2 och spelar en avgörande roll i cancer3. Bukspottkörtelcancer (PC) är en av de svåraste cancerformerna4 att behandla på grund av dess snabba spridning och höga dödlighet. Mitokondriell dysfunktion, som främst orsakas av förändringar i mitokondriell morfologi 3,5,6,7, har kopplats till de sjukdomsmekanismer som ligger till grund för PC8. Mitokondrier är också mycket dynamiska, vilket återspeglas av de frekventa och dynamiska förändringarna i deras nätverksanslutning och cristae-struktur9. Omformningen av cristae-strukturen kan direkt påverka mitokondriell funktion och cellulärt tillstånd10,11, som förändras signifikant under tumörcelltillväxt, metastaser och tumörmikromiljöförändringar12,13.

Under de senaste åren har forskare studerat denna organell med EM-observation14,15,16,17; Till exempel har forskare analyserat mitokondriell dynamik med hjälp av 3D-rekonstruktionstekniker 6,7,18,19. Det allmänna konceptet och metoden för 3D-rekonstruktion av elektronmikroskopibilder etablerades formellt redan 196820 och involverade att kombinera elektronmikroskopi, elektrondiffraktion och datorbildbehandling för att rekonstruera T4-fagsvansen. Hittills har elektronmikroskopi 3D-avbildningsteknik gjort betydande framsteg när det gäller bildupplösning 21, automatiseringsgrad 22 och bearbetningsvolym23 och har använts i allt bredare skala inom biologisk forskning, från vävnadsnivå till organellultrastrukturnivå på nanometerskala24. Under de senaste åren har elektronmikroskopi 3D-avbildning också blivit en lovande teknik för ett brett spektrum av applikationer25,26,27.

Den växande uppmärksamheten på mitokondriella kristor illustrerar särskilt de väsentliga kraven för ultrastrukturell volymavbildning. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) har använts för att visualisera prover som samlats in på ett kopparnät (400 mesh)28, med elektronstrålen som passerar genom sektionen. På grund av kopparnätets begränsade räckvidd är det emellertid omöjligt att helt avbilda kontinuerliga skivor av samma prov29. Detta komplicerar studiet av målstrukturer under TEM-avbildning. Dessutom förlitar sig TEM på tidskrävande och felbenägna manuella uppgifter, inklusive skärning och insamling av flera skivor och avbildning av dem sekventiellt21, så det är inte anpassat för ultrastrukturella rekonstruktioner av stora volymprover23. För närvarande uppnås högupplöst rekonstruktion av provavbildning i stora volymer genom användning av specialutrustning, såsom TEMCA-kameramatrisen (TEMCA)30 eller två andra generationens TEMCA-system (TEMCA2)31, som möjliggör automatiserad avbildning med hög genomströmning på kort tid. Denna typ av avbildning har dock inte fördelen att den är lätt att få och universell på grund av kravet på anpassad utrustning.

Jämfört med TEM förbättrar metoden för att automatiskt generera tusentals seriella volymetriska bilder för stora områden baserat på SEM 32,33 effektiviteten och tillförlitligheten hos seriell avbildning och ger högre z-upplösningar34. Till exempel har seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) och fokuserad jonstråleskanningselektronmikroskopi (FIB-SEM) båda gjort det möjligt att uppnå 3D-rekonstruktion av ultrastruktur med hög hastighet, effektivitet och upplösning35,36. Det är emellertid oundvikligt att blockytan rakas mekaniskt av SBF-SEM:s diamantkniv eller genom fräsning med den fokuserade jonstrålen på FIB-SEM33,37. På grund av de två metodernas destruktivitet för proverna är det inte möjligt att rekonstruera samma målstruktur igen för vidare analys38,39,40. Dessutom har få studier försökt rekonstruera 3D-organellens ultrastruktur av cancerceller med hjälp av EM för att observera patologiska förändringar12. Av dessa skäl, för att ytterligare belysa de patologiska mekanismerna hos cancerceller, såsom bukspottskörtelcancerceller, föreslår vi en ny teknik för 3D-rekonstruktion av seriella sektionsbilder med hjälp av en ultramikrotom och ett fältemissionsskanningselektronmikroskop (FE-SEM) för att analysera mitokondriell ultrastruktur på cristae-nivå; Med denna teknik kan högupplösta data förvärvas med en effektiv och tillgänglig metod. De seriella ultratunna sektionerna gjorda med hjälp av en ultramikrotom kan lagras semi-permanent i ett rutnätfodral och reimaged flera gånger, även efter flera år41. FE-SEM värderas högt som ett verktyg inom olika forskningsområden på grund av dess förmåga att tillhandahålla högupplöst bildbehandling, hög förstoring och mångsidighet42. I ett försök att visa organellernas fina struktur i 3D kan tekniken för att producera seriella 2D-bildstaplar med användbar upplösning med hjälp av bakåtspridda elektroner producerade av FE-SEM 43,44 också användas för att uppnå hög genomströmning och flerskalig avbildning av målregioner eller deras associerade strukturer utan specialutrustning 45. Genereringen av laddningsartefakter påverkar direkt kvaliteten på de förvärvade bilderna, så det är särskilt viktigt att hålla uppehållstiden kort.

Således utarbetar föreliggande studie de experimentella procedurerna som används i denna SEM-teknik för att rekonstruera 3D-strukturen hos mitokondriella cristae46. Specifikt visar vi processen som utvecklats för att uppnå den halvautomatiska segmenteringen av mitokondriella regioner och digitalisera 3D-rekonstruktionen med hjälp av Amira-programvaran, vilket också innebär att man gör skivprover med den konventionella OTO-provberedningsmetoden44,47, slutför sektionssamlingen med ultramikrotomskivning och förvärvar sekventiell 2D-data med FE-SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av material

  1. Odla 2 x 106 Panc02-celler i 12 ml DMEM-medium (10% fetalt bovint serum och 100 U / ml penicillin-streptomycin) och behåll vid 37 ° C och 95% luftfuktighet i en atmosfär med 5% koldioxid och 95% luft i 48 timmar.
  2. Samla Panc02-celler, centrifugera vid 28 x g i 2 minuter och kassera sedan supernatanten. Se till att provet är av lämplig storlek (1 x 107 celler), eftersom annars kommer följande fixerings- och uttorkningssteg inte att fungera bra.
  3. Tillsätt 1 ml 2,5 % glutaraldehyd som fixeringsmedel för att fixera de färska Panc02-cellerna i 1,5 ml mikrocentrifugrör över natten vid 4 °C.
    Anmärkning: Proverna måste centrifugeras vid 1,006 x g i 5 minuter i vart och ett av följande steg (steg 1.3-1.11).
  4. Aspirera fixeringsmedlet och skölj proverna två gånger med 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skölj sedan två gånger med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) vid rumstemperatur i 10 minuter vardera.
  5. Tillsätt 50 μl av en lösning innehållande 1 % osmiumtetroxid (OsO 4) och 1,5 % kaliumferrocyanid i förhållandet 1:1 vid4 °C i 1 timme. Skölj sedan två gånger med 0,1 M PBS i 10 minuter varje gång och skölj med ddH2O i ytterligare 10 minuter.
  6. Tillsätt 1 ml 1% tiokarbhydrazid (TCH), inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter till 1 h och skölj sedan med ddH2O fyra gånger i 10 minuter varje gång.
  7. Tillsätt 50 μL 1% OsO4, fixera vid rumstemperatur i 1 h och skölj sedan med ddH2O fyra gånger i 10 minuter varje gång.
  8. Tillsätt 1 ml 2 % uranylacetat vid 4 °C över natten och skölj sedan med ddH2Ofyra gånger i 10 minuter varje gång.
  9. Tillsätt 1 ml Walton-lösning (0,066 g blynitrat upplöst i 10 ml 0,03 mol/l asparaginsyralösning) vid 60 °C för ytterligare 1 timmes inkubation.
  10. Skölj med ddH2O fyra gånger i 10 minuter varje gång och torka sedan ut i en graderad alkoholserie i 10 minuter varje gång: 50% alkohol, 70% alkohol, 80% alkohol och 90% alkohol 1x och 100% alkohol 2x. Dehydrera sedan i 100% aceton två gånger i 10 minuter varje gång. Använd 1 ml av varje lösning för uttorkning.
  11. Blanda 200 μL aceton med Pon 812 epoxiharts i förhållandet 3:1, 1:1 och 1:3. Blötlägg provet i harts vid rumstemperatur i 2 timmar, 4 timmar respektive 4 timmar och ta sedan 100% Pon 812 epoxiharts för att impregnera över natten.
    OBS: När du utför inbäddningsstegen för färgning och harts är det viktigt att arbeta i en dragskåp eftersom dessa är giftiga ämnen. Dessutom måste labbrockar och lösningsmedelsbeständiga handskar bäras under experimentet.
  12. Lägg proverna i en inbäddningsform och ställ sedan in i en ugn vid 60 ° C i 48 timmar för att polymerisera. Använd platt inbäddning29 för att minska uppkomsten av harts runt provet. Detta förenklar provinstallationen och minskar effekten av laddningsartefakter på den efterföljande bildsegmenteringen.
    OBS: För att därefter generera en horisontell skäryta kan en liten mängd harts tillsättas i formhålet, var försiktig så att den inte överfylls.
  13. Bered kiselskivor genom att först tvätta dem och sedan hydrofilisera med en koncentreradH2SO4/H2O2-lösningi 30 minuter. Samla upp serieskivor med en tjocklek av 70 nm på de hydrofiliserade kiselskivorna med hjälp av en ultramikrotom och torka dem i en ugn på 60 °C i 10 minuter.
    Fånga långsamt segmentet när segmentet flyter till ytan på skivorna för att förhindra förlust eller deformation av segmentet.

2. Bildinsamling och tredimensionell rekonstruktion

  1. Innan du monterar en kiselskiva på scenen, tvätta sektionerna med destillerat vatten tre gånger och lufttorka dem. Skär en ledande koltejp med storleken 1 cm x 0,5 cm och fäst den mellan kiselskivan och SEM-provsteget för att slutföra provuppsättningen (figur 2E).
  2. Ställ in FE-SEM accelererande spänningsparameter på 2 kV med ett arbetsavstånd på 4 mm (figur 3B och tabell 1).
    OBS: För att förbättra signal-brusförhållandet och minska bruset i bilden, observera vid låga förstoringar när det är möjligt. När multipeln ökar minskar skanningsområdet för SEM, vilket leder till en ökning av laddningsackumuleringen på bilderna.
  3. Klicka på H/L-ikonen i den övre menyraden. Orientera först den första delen av målsegmentremsorna vid låg förstoring och klicka sedan igen på H /L-alternativet (figur 3A) för att växla till högförstoringsläge. Samla in en lämplig bild för strukturen av intresse genom att justera bildens ljusstyrka, kontrast och förstoring.
  4. Välj Projektvy > Öppna data och importera bildfilerna som ska analyseras till programvaran.
  5. Justera bilderna genom att klicka på Justera segment > Redigera (bild 4B) och justera värdet för intensitetsintervall i menyraden längst ned till vänster genom att ändra bildens genomskinlighet. Använd här en halvautomatisk justeringsstrategi; Genom automatisk justering gör du att bilderna överlappar en tidigare bild och utför sedan manuell finjustering.
    I det här arbetet, under justeringsprocessen, användes den föregående bilden som referens, och flytt- och rotationsoperationerna användes för att maximalt överlappa målstrukturen för de två bilderna. Att klicka på Justera aktuellt segmentpar kan hjälpa till att justera bilderna automatiskt, men felplacering kan uppstå.
  6. Välj modulen Extrahera delvolym och klipp ut de justerade datauppsättningarna så att de passar storleken på den överlappande delen av hela stacken.
  7. Under underavsnittet Segmentering (bild 4C) väljer du Sampla om > segmentering > Spara. Välj tröskeln för trollstaven och storleken på penselverktyget för att välja rätt intervall. Här igen, anta en halvautomatisk segmenteringsmetod genom att först använda Magic Wand för att automatiskt välja ett lämpligt stort område och sedan använda borsten för att exakt beskriva detaljerna.
    Trollstaven kan användas för att segmentera bilder baserat på de uppenbara skillnaderna i pixelintensitet som finns mellan strukturen av intresse och de omgivande strukturerna genom att ändra maskeringsvärdet och använda Draw Limit Line. Det kan inte skilja laddningsartefakterna som genereras under bildförvärv. Därför kan det leda till felaktig segmentering för målregionerna. Penselverktyget kan användas för att segmentera manuellt för att noggrant rekonstruera de biologiska strukturerna.
  8. Under Segmentering > markering klickar du på + -ikonen för att lägga till det valda området (bild 4C).
  9. Upprepa ovanstående steg (2.8) för att välja samma målstruktur i olika bilder tills valet är klart för rekonstruktion av mikrostrukturerna av intresse.
    OBS: Under mitokondriella ombyggnadsprocesser måste valet av målobjektet utföras från bilden i mitten av en grupp sekventiella bilder. Om det önskade området väljs från den första eller sista bilden kommer rekonstruktionsresultatet inte att kunna presentera en fullständig 3D-visualisering.
  10. När du har slutfört den regionala segmenteringen genererar du bildfilen enligt bästa resultat för objektets storlek och bildupplösning. Klicka på Crop Editor och ange sedan siffran 6 i rutan Virtual Slider (Figur 4C).
  11. I rullgardinsmenyn till vänster högerklickar du på det grå området under underavsnittet Projekt och väljer Generera Surface > Skapa > Tillämpa. I den genererade filen använder du Surface View-modulen för att skapa ytstrukturen och 3D-representationen.

3. Kvantifiering

  1. Klicka på Ta bort små fläckar > applicera (bild 4D). Under underavsnittet Projekt högerklickar du på det grå området och väljer Etikettanalys > Använd (bild 4D).
  2. Anpassa namnet på kolumnen och välj en måttgrupp. Välj Volume3d och Length3d i rutan Native Measurements.
  3. Klicka på knappen Apply längst ned till vänster på skärmen. Kopiera data och diagram i statistikprogramvaran, till exempel GraphPad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under cellodling (figur 1A) delade vi först bukspottkörtelcancercellerna i en kontrollgrupp odlad med komplett odlingsmedium, en (1S,3R)-RSL348 (RSL3, en ferroptosaktivator, 100 nM) grupp och en RSL3 (100 nM) plus ferrostatin-149 (Fer-1, en ferroptoshämmare, 100 nM) grupp. Genom ovanstående experimentella steg förvärvade svepelektronmikroskopet 38 (kompletterande figur 1), 43 (kompletterande figur 2) och 44 (kompletterande figur 3) sekventiella bilder för kontrollgruppen, RSL3-gruppen respektive inhibitorgruppen (RSL3 + Fer-1-gruppen). Bilderna på 1 280 x 960 pixlar togs med 8 000 gånger förstoring (med en upplösning på 12,40 nm / pixel). Både rynkor och föroreningar i cellområdet observerades inte ovanför sektionerna. Elektronmikroskopbilderna kunde tydligt skilja organellerna, såsom mitokondrier och endoplasmatisk retikulum, i cellerna (figur 1E).

Observationen av 2D-bilderna av FE-SEM visade att mitokondrierna i kontrollgruppen av cancerceller (figur 5A) fördelades genom cytoplasman, och de flesta av dem var sfäriska eller ovala och jämnt fylliga. Dessutom var den relativt regelbundna, långsträckta cristae-arkitekturen tydligt synlig. Omvänt, i RSL3-gruppen (figur 5D), uppvisade majoriteten av mitokondrierna en krympande morfologi, en ökning av membrandensiteten och en relativt vag cristae-struktur. Närmare granskning av SEM-bilderna (figur 5E) avslöjade att inte alla mitokondriella cristae degenererade eller försvann, eftersom ett relativt litet antal cristae förblev intakta. Jämfört med RSL3-gruppen, i inhibitorgruppen, bibehöll de flesta mitokondrierna den integrerade strukturen hos mitokondriella cristae, och endast en minoritet av mitokondriella cristae-strukturerna var inte uppenbara (figur 5G).

Medan 2D-information visar skillnader i mitokondriell morfologi kan det ibland resultera i en partisk förståelse av den detaljerade och verkliga 3D-strukturen50,51. Kontrollgruppens cristae-strukturer under 3D-förhållandet (figur 5C) överensstämde med 2D-bilderna, men de var olika för RSL3-gruppen. För denna grupp kunde närvaron av fullständiga mitokondriella cristae också observeras i 2D-bilderna (figur 5E), men mitokondrierna under 3D (figur 5F) var oregelbundna och i allmänhet vakuolerade i mitten. Inhibitorgruppen (figur 5I) visade olika cristae-former, med endast några mitokondriella cristae som uppvisade lokal kollaps. Således kan man från resultaten från RSL3-gruppen se att endast användning av 2D-analys kan leda till en ensidig förståelse av resultaten. Resultaten av 2D-bilder är partiska jämfört med de resultat som presenteras när man staplar en uppsättning bilder för 3D-visning, så det är inte möjligt att generalisera resultat som endast produceras genom 2D-information. För att mer objektivt visa effekterna av RSL3 på mitokondrier användes 3D-rekonstruktionsdata för att kvantifiera och mäta mitokondriella förändringar52. Jämfört med kontrollgruppen minskade längden och volymen av 3D-mitokondrierna i RSL3-gruppen signifikant, men kvantifieringsresultaten för inhibitorgruppen sjönk mellan resultaten för de andra två grupperna (figur 5J,K). Dessa kvantitativa data tyder på att RSL3 producerar mindre och nedbrutna mitokondrier, och tillsats av hämmare minskar denna effekt.

Som visas i figur 6B och figur 6C bestämdes att ferroptosinduceraren RSL3 orsakade mitokondriell dysfunktion och påverkade cellulär metabolism genom att ändra mitokondriell morfologi 53,54 och framkalla ferroptos, vilket kan representera en allestädes närvarande form av dynamisk celldöd vid cancerbehandling inducerad avRSL3 55.

Figure 1
Figur 1: Allmänt arbetsflöde för 3D-rekonstruktion av bukspottskörtelcancerceller. Ett generellt arbetsflöde för de 3D-rekonstruktionsexperiment som beskrivs i detta protokoll demonstreras. (A) Odling av cancerceller i bukspottskörteln. (B) Beredning av hartsblocket. (C) Samling av seriella sektioner med hjälp av en ultramikrotom. (D) Insamling av 2D-bilder med hjälp av ett svepelektronmikroskop för fältemission. (E) Placering av de riktade mitokondrierna i de sekventiella SEM-bilderna. (F) Analys av mitokondrierna i 3D. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: En anordning för skivremsor som monteras på kontinuerliga skivor på en hydrofil kiselskiva. (A) En justerbar vinkelmanipulator med pincett för att hålla skivan. (B) Ram av skivhållaren placerad bredvid ultramikrotomen. (C) Placering av kiselskivan i det blå spåret som innehåller diamantkniven. (D) En närbild som visar positionsförhållandet mellan kiselskivan och diamantknivbladet. E) En kiselskiva med skivor fästa vid provsteget i SEM med ledande kollim. (F) En närbild som visar den allmänna översikten över de seriella segmentremsorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Processen att ställa in parametrarna och hämta bilderna. (A) Menyraden för FE-SEM (pilen pekar på alternativet H/L). (B) Tabell över bilddiagnostiska parametrar och förhållanden. (C) Översikt över på varandra följande 2D-bilder i tre grupper. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: En steg-för-steg-guide för att visualisera mitokondrier i 3D med Amira. (A) Importera bilder från en specifik mapp. (B) Justera bildstaplar enligt målstrukturen. (C) Segmentering och tillägg av intresseområdet. d) Rekonstruktion av 3D-strukturen och tillägg av kvantifieringsdata. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Mitokondriernas 2D- och 3D-morfologi i varje grupp. Kontrollgruppens 2D-cancercellmorfologi vid (A) 8 000-faldig förstoring och (B) 15 000-faldig förstoring. c) En 3D-representation av kontrollgruppens mitokondriella morfologi. 2D-cancercellmorfologin hos RSL3-gruppen vid (D) 8 000-faldig förstoring och (E) 15 000-faldig förstoring. (F) En 3D-representation av RSL3-gruppens mitokondriella morfologi. 2D-cancercellmorfologin i RSL3 + Fer-1 (inhibitor) -gruppen vid (G) 8 000 gånger förstoring och (H) 15 000 gånger förstoring. (I) En 3D-representation av mitokondriell morfologi i RSL3 + Fer-1-gruppen (inhibitor). Kvantitativa data för (J) längd och (K) genomsnittlig volym för mitokondrierna i varje grupp. Signifikanta skillnader indikeras med asteriskeroch beräknades med hjälp av studentens t-test (jämfört med kontrollgrupp, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001.) Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Skillnader i mitokondriell morfologi hos cancerceller på 2D- och 3D-nivåer . (A) 2D-cancercellmorfologin hos RSL3-gruppen vid 8 000-faldig förstoring. (B) 2D-mitokondriell morfologi vid en högre förstoring. (C) En 3D-representation av specifika mitokondrier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bildparametrar Villkor
DataSize 1280 × 960
Pixelstorlek 12.40234
AccelererarSpänning 2000 Volt
Arbetsavstånd 3700μm
Emissionsström 13700 ej tillämpligt
Strålström 10μA
Strömbegränsande bländare Nr 2 galler av FE-SEM
Uppehållstid 32 μs/px
Antal celler 107
Avbildade volymer 10×8×2.66μm, 212.8μm³
10×8×3.01μm, 240.8μm³
10×8×3.08μm, 246.4μm³

Tabell 1: Sammanfattning av inspelningsvillkoren och datauppsättningsparametrarna för bildinsamlingen.

Kompletterande figur 1: Översikt över bilder av 38 cancercellsmikrosektioner från kontrollgruppen. Bildnumret för varje mikrosektion är ordnat från topp till botten. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Översikt över bilder av 43 cancercellsmikrosektioner från RSL3-gruppen. Bildnumret för varje mikrosektion är ordnat från topp till botten. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Overview av bilder av 44 cancercellsmikrosektioner från RSL3 + Fer-1 (inhibitor) gruppen. Bildnumret för varje mikrosektion är ordnat från topp till botten. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som presenteras här är en användbar steg-för-steg-guide för att tillämpa 3D-rekonstruktionstekniken, vilket innebär att elektronmikroskopi och bildbehandlingsteknik tillämpas på stapling och segmentering av 2D-tomografiska bilder genererade från seriella ultratunna sektioner. Detta protokoll belyser en begränsning av 2D-bilder som kan hanteras genom 3D-visualisering av organellens ultrastruktur, vilket har fördelarna med stark reproducerbarhet av strukturerna vid en hög upplösningsnivå och högre noggrannhet. Ännu viktigare är att denna 3D-visualisering kan tillämpas på tumörceller för att göra studien av patologiska mekanismer enklare och pålitligare. Denna teknik undersöktes i detta arbete för att visualisera de stereoskopiska strukturerna hos mitokondriella cristae genom att jämföra tre uppsättningar seriella sektioner under olika förhållanden och därigenom validera den RSL3-inducerade mitokondriella cristaemembrannedbrytningen som förekommer i cancerceller56. Dessa resultat ger insikter i verkningsmekanismen för RSL3 som ett läkemedel mot bukspottkörtelcancer.

Förvärvet av högupplösta 2D-bilder spelar en viktig roll i processen för 3D-rekonstruktion57 av mitokondriella cristae, och bildkvaliteten påverkar direkt rekonstruktionsresultaten 22,58. Därför har denna metod också vissa begränsningar, såsom laddningsartefakter som genereras i SEM-bilder59, vilket i sin tur kan leda till felaktig segmentering av målstrukturerna. Detta problem kan lösas genom att förkorta skivskanningstiden, utrusta SEM med en fokalladdningskompensator34,60 och använda OTO-metoden, för vilken användningen av TCH kan göra provet mer ledande för elektroner genom färgning med ytterligare metaller 61. Att förlita sig på automatisk bildsegmentering tenderar att vara felaktigt när det gäller att bestämma strukturens omfattning, medan manuell segmentering är tidskrävande58. Därför, på grundval av den snabba skanningsfördelen med SEM för att realisera bildinsamling62, kan den halvautomatiserade segmenteringen i Amira-programvaran användas för att möjliggöra effektiv avbildning och rekonstruktion; att använda Amira-programvara kan också göra resultatet mer exakt och exakt än att använda FIJI och MIB63. Det viktigaste steget i 3D-avbildning är att förvärva ultratunna sektioner. Problem som utelämnande, fraktur och förvrängning, som påverkar bildkontinuiteten, uppstår ofta under avsnittsinsamlingen. För att lösa problem som förlust och brott på skivor använde vi hydrofiliserade kiselskivor som stöd för insamlingen av skivremsorna.

Även om SBF-SEM och FIB-SEM kan minska deformationen av eller defekterna i sektionerna, har dessa tekniker en långsam bildhastighet, kräver dyra instrument och är oförmögna att avbilda strukturen av intresse64,65,66. FIB-SEM saknar systemstabilitet under avbildning, medan SBF-SEM hindras av komplicerade provberedningssteg och ett tråkigt arbetsflöde34. Nyligen har stimulerad utsläppsutarmning (STED) mikroskopisk avbildning gradvis tillämpats på studier av mitokondriell struktur. Denna metod övervakar 3D-realtidsbilder av mitokondriella cristae i levande celler genom konstruktion av sonder för mitokondriell märkning67. Fluorescerande färgämnesmärkning kan avslöja förändringsprocesserna i cristaeduring mitokondriell fusion och fission68. Levande celler har dock begränsad tolerans för intensivt ljus, så det är svårt att använda denna teknik vid långvarig STED-avbildning68. Dessutom begränsas STED av dess upplösning, bilddjup och pixelnummer69.

Jämfört med andra tekniker möjliggör användningen av kontinuerliga ultratunna sektioner i kombination med 3D-rekonstruktionsteknik för att observera organellens ultrastruktur från ett brett synfält inte bara avbildning med hög genomströmning på kort tid utan möjliggör också undersökning av högupplösta bilder av målstrukturer vid diskreta tider21, vilket förbättrar bildhastigheten och rekonstruktionsflexibiliteten. Dessutom kan organellmorfologiska förändringar och rumsliga förbindelser med andra organeller undersökas ytterligare. Dessa aspekter kan kvantifieras, och förändringsmekanismerna kan avslöjas mer exakt genom att rekonstruera intilliggande organeller för att visa deras positionsförhållanden70,71. Denna teknik för 3D-rekonstruktion och seriell sektionsavbildning med Amira58 avslöjar sambandet mellan sjukdomar och organell-ultrastrukturella förändringar på nanoskala72, har använts i stor utsträckning inom medicin, biologi och andra områden och banar väg för utvecklingen av effektiva nya terapier73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Natural Science Foundation of Zhejiang Province bidrag (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China beviljar (82274364, 81673607 och 81774011); samt det offentliga välfärdsforskningsprojektet för Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Vi uppskattar den stora hjälpen, teknisk support och experimentellt stöd från Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).

Tags

Cancerforskning utgåva 196 Pankreascancercell mitokondrier ultrastruktur 3D-rekonstruktion svepelektronmikroskopi (SEM) OTO-provberedning
En tredimensionell teknik för visualisering av mitokondriella ultrastrukturella förändringar i bukspottskörtelcancerceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong,… More

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter