Summary
Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.
Abstract
Sadece bilinmeyen bilgiler açısından zengin değil, aynı zamanda üç boyutlu (3D) bir bakış açısıyla da sofistike olan hücre organeli üst yapısının dinamik özelliklerinin anlaşılması, mekanik çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Elektron mikroskobu (EM) iyi bir görüntüleme derinliği sunar ve nanometre ölçeğinde bile hücresel organellerin ultrastrüktürel morfolojisini araştırmak için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarının yeniden yapılandırılmasına izin verir; bu nedenle, 3D rekonstrüksiyon, eşsiz avantajları nedeniyle önem kazanmaktadır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), aynı ilgi bölgesinden büyük yapıların ardışık dilimler halinde 3D olarak yeniden yapılandırılmasına olanak tanıyan yüksek verimli bir görüntü elde etme teknolojisi sağlar. Bu nedenle, organellerin gerçek 3D ultrayapısını eski haline getirmek için büyük ölçekli 3D rekonstrüksiyonda SEM uygulaması giderek daha yaygın hale geliyor. Bu protokolde, pankreas kanseri hücrelerinde mitokondriyal kristaları incelemek için seri ultra ince kesit ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerinin bir kombinasyonunu öneriyoruz. Bu tekniklerin nasıl uygulandığının ayrıntıları, osmiyum-tiyokarbohidrazid-osmiyum (OTO) yöntemi, seri ultra ince kesit görüntüleme ve görselleştirme ekranı dahil olmak üzere bu protokolde adım adım açıklanmaktadır.
Introduction
Mitokondri, hücredeki en önemli organellerden biridir. Hücresel biyoenerjetik ve metabolizmanın merkezi olarak hizmet ederler 1,2 ve kanserde kritik bir rol oynarlar3. Pankreas kanseri (PK), hızlı yayılımı ve yüksek ölüm oranı nedeniyle tedavisi en zor kanserlerdenbiridir. Esas olarak mitokondriyal morfolojideki 3,5,6,7 değişikliklerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyon, PC8'in altında yatan hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendirilmiştir. Mitokondriler de oldukça dinamiktir, bu da ağ bağlantılarındaki ve cristae yapılarındaki sık ve dinamik değişikliklerle yansıtılır9. Cristae yapısının yeniden şekillendirilmesi, tümör hücresi büyümesi, metastaz ve tümör mikroçevre değişiklikleri sırasında önemli ölçüde değişen mitokondriyal fonksiyonu vehücresel durumu 10,11 doğrudan etkileyebilir12,13.
Son yıllarda, bilim adamları bu organeli EM gözlemi14,15,16,17; örneğin, araştırmacılar 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak mitokondriyal dinamiklerianaliz ettiler 6,7,18,19. Elektron mikroskobu görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için genel konsept ve yöntem resmi olarak 196820 gibi erken bir tarihte oluşturuldu ve T4 faj kuyruğunu yeniden yapılandırmak için elektron mikroskobu, elektron kırınımı ve bilgisayar görüntü işlemenin birleştirilmesini içeriyordu. Şimdiye kadar, elektron mikroskobu 3D görüntüleme teknolojisi, görüntü çözünürlüğü 21, otomasyon derecesi22 ve işlem hacmi 23 açısından önemli ilerlemeler kaydetmiş ve biyolojik araştırmalarda doku seviyesinden nanometre ölçeğindeorganel ultrayapı seviyesine kadar giderek daha geniş bir ölçekte kullanılmaktadır24. Son yıllarda, elektron mikroskobu 3D görüntüleme de çok çeşitli uygulamalar için umut verici bir teknoloji haline gelmiştir25,26,27.
Mitokondriyal kristalara artan ilgi, özellikle ultrastrüktürel hacim görüntüleme için temel gereksinimleri göstermektedir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), bir bakır ızgara (400 mesh)28 üzerinde toplanan numuneleri, kesitten geçen elektron ışını ile görselleştirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bakır ızgaranın sınırlı aralığı nedeniyle, aynı numunenin sürekli dilimlerini tam olarak görüntülemekimkansızdır 29. Bu, TEM görüntüleme sırasında hedef yapıların incelenmesini zorlaştırır. Ek olarak, TEM, birden fazla dilimin kesilmesi ve toplanması ve bunların sırayla görüntülenmesi21 dahil olmak üzere zaman alıcı ve hataya açık manuel görevlere dayanır, bu nedenle büyük hacimli numunelerin ultrastrüktürel rekonstrüksiyonları için uyarlanmamıştır23. Şu anda, büyük hacimli numune görüntülemenin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonu, TEM kamera dizisi (TEMCA)30 veya iki ikinci nesil TEMCA sistemi (TEMCA2)31 gibi kısa sürede otomatik yüksek verimli görüntülemeye olanak tanıyan özel ekipmanların kullanılmasıyla gerçekleştirilmektedir. Bununla birlikte, bu tür görüntüleme, özelleştirilmiş ekipman gereksinimi nedeniyle elde edilmesi kolay ve evrensel olma avantajına sahip değildir.
TEM ile karşılaştırıldığında, SEM32,33'e dayalı geniş alanlar için otomatik olarak binlerce seri hacimsel görüntü oluşturma yöntemi, seri görüntülemenin verimliliğini ve güvenilirliğini artırır ve daha yüksek z-çözünürlükleri sunar 34. Örneğin, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) ve odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM), yüksek hız, verimlilik veçözünürlük 35,36 ile ultrayapının 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır. Bununla birlikte, blok yüzeyinin SBF-SEM'in elmas bıçağı ile veya FIB-SEM33,37'nin odaklanmış iyon ışını ile frezelenerek mekanik olarak traşlanması kaçınılmazdır. İki yöntemin numunelere zarar vermesi nedeniyle, daha fazla analiz için aynı hedef yapıyı tekrar oluşturmak mümkün değildir38,39,40. Ek olarak, az sayıda çalışma, patolojik değişiklikleri gözlemlemek için EM kullanarak kanser hücrelerinin 3D organel ultrayapısını yeniden yapılandırmaya çalışmıştır12. Bu nedenlerden dolayı, pankreas kanseri hücreleri gibi kanser hücrelerinin patolojik mekanizmalarını daha fazla aydınlatmak için, mitokondriyal üst yapıyı kristae seviyesinde analiz etmek için bir ultramikrotom ve bir alan emisyon taramalı elektron mikroskobu (FE-SEM) kullanarak seri kesit görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için yeni bir teknoloji öneriyoruz; Bu teknoloji ile verimli ve erişilebilir bir yöntem kullanılarak yüksek çözünürlüklü veriler elde edilebilir. Bir ultramikrotom kullanılarak yapılan seri ultra ince kesitler, bir ızgara kutusunda yarı kalıcı olarak saklanabilir ve birkaç yıl sonra bile birden çok kez yeniden görüntülenebilir41. FE-SEM, yüksek çözünürlüklü görüntüleme, yüksek büyütme ve çok yönlülük sağlama yeteneği nedeniyle çeşitli araştırma alanlarında bir araç olarak oldukça değerlidir42. Organellerin ince yapısını 3D olarak sergilemek amacıyla, FE-SEM43,44 tarafından üretilen geri saçılan elektronları kullanarak faydalı çözünürlüğe sahip seri 2D görüntü yığınları üretme tekniği, özel ekipman olmadan hedef bölgelerin veya bunlarla ilişkili yapıların yüksek verimli ve çok ölçekli görüntülemesini elde etmek için de kullanılabilir 45. Yük artefaktlarının oluşturulması, elde edilen görüntülerin kalitesini doğrudan etkiler, bu nedenle bekleme süresini kısa tutmak özellikle önemlidir.
Bu nedenle, bu çalışma, mitokondriyal cristae46'nın 3 boyutlu yapısını yeniden yapılandırmak için bu SEM tekniğinde kullanılan deneysel prosedürleri detaylandırmaktadır. Spesifik olarak, mitokondriyal bölgelerin yarı otomatik segmentasyonunu elde etmek ve geleneksel OTO numune hazırlama yöntemi44,47 kullanılarak dilim numuneleri yapmayı da içeren Amira yazılımını kullanarak 3D rekonstrüksiyonu dijitalleştirmek için geliştirilen süreci gösteriyoruz, ultramikrotom dilimleme kullanarak kesit koleksiyonunu tamamlama ve FE-SEM ile sıralı 2D veriler elde etme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malzeme hazırlığı
- 12 mL DMEM ortamında (%10 fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin-streptomisin) 2 x 106 Panc02 hücresini kültürleyin ve 48 saat boyunca %5 karbondioksit ve %95 hava atmosferinde 37 °C ve %95 nemde muhafaza edin.
- Panc02 hücrelerini toplayın, 28 x g'de 2 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Numunenin uygun boyutta (1 x 107 hücre) olduğundan emin olun, aksi takdirde aşağıdaki fiksasyon ve dehidrasyon adımları iyi çalışmayacaktır.
- Taze Panc02 hücrelerini 1.5 mL mikro santrifüj tüplerine gece boyunca 4 °C'de sabitlemek için fiksatif olarak 1 mL %2.5 glutaraldehit ekleyin.
NOT: Numunelerin, aşağıdaki adımların her birinde (adım 1.3-1.11) 5 dakika boyunca 1.006 x g'da santrifüjlenmesi gerekir. - Fiksatifi aspire edin ve numuneleri 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez durulayın ve ardından her biri 10 dakika oda sıcaklığında çift damıtılmış su (ddH2O) ile iki kez durulayın.
- 1 saat boyunca 4 ° C'de 1:1 oranında% 1 osmiyum tetroksit (OsO4) ve% 1.5 potasyum ferrosiyanür içeren 50 μL çözelti ekleyin. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca 0.1 M PBS ile iki kez durulayın ve 10 dakika daha ddH2O ile durulayın.
- 1 mL% 1 tiyokarbohidrazid (TCH) ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika ila 1 saat inkübe edin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.
- 50 μL% 1 OsO4 ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat sabitleyin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.
- Gece boyunca 4 °C'de 1 mL %2 uranil asetat ekleyin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.
- İlave 1 saatlik inkübasyon için 60 ° C'de 1 mL Walton çözeltisi (10 mL 0.03 mol / L aspartik asit stok çözeltisi içinde çözülmüş 0.066 g kurşun nitrat) ekleyin.
- ddH2O ile her seferinde 10 dakika boyunca dört kez durulayın ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca kademeli bir alkol serisinde kurutun:% 50 alkol,% 70 alkol,% 80 alkol ve% 90 alkol 1x ve% 100 alkol 2x. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca iki kez %100 asetonda kurutun. Dehidrasyon için her çözeltiden 1 mL kullanın.
- 200 μL asetonu Pon 812 epoksi reçine ile 3:1, 1:1 ve 1:3 oranında karıştırın. Numuneyi sırasıyla 2 saat, 4 saat ve 4 saat oda sıcaklığında reçineye batırın ve ardından gece boyunca emprenye etmek için %100 Pon 812 epoksi reçineyi alın.
NOT: Boyama ve reçine gömme adımlarını gerçekleştirirken, bunlar toksik maddeler olduğundan çeker ocakta çalıştırılması önemlidir. Ek olarak, deney sırasında laboratuvar önlükleri ve solvente dayanıklı eldivenler giyilmelidir. - Numuneleri bir gömme kalıba koyun ve ardından polimerize olması için 48 saat boyunca 60 °C'de bir fırına koyun. Numunenin etrafındaki reçine görünümünü azaltmak için düz gömme29 kullanın. Bu, numune kurulumunu basitleştirir ve şarj artefaktlarının sonraki görüntü segmentasyonu üzerindeki etkisini azaltır.
NOT: Daha sonra yatay bir kesme yüzeyi oluşturmak için, aşırı doldurmamaya dikkat ederek kalıp deliğine az miktarda reçine eklenebilir. - Silikon gofretleri önce yıkayarak ve ardından konsantreH2S04/H2O2solüsyonu ile 30 dakika hidrofilize ederek hazırlayın. Hidrofilize silikon gofretler üzerinde 70 nm kalınlığında seri dilim şeritleri ultramikrotom kullanarak toplayın ve 60 °C fırında 10 dakika kurutun.
NOT: Dilim kaybını veya deformasyonunu önlemek için dilim gofretlerin yüzeyine doğru yüzerken dilimi yavaşça yakalayın.
2. Görüntü elde etme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon
- Sahneye bir silikon gofret monte etmeden önce, bölümleri üç kez damıtılmış suyla yıkayın ve havayla kurutun. 1 cm x 0,5 cm boyutunda iletken bir karbon bant kesin ve numune kurulumunu tamamlamak için bunu silikon gofret ile SEM numune aşaması arasına yapıştırın (Şekil 2E).
- FE-SEM hızlandırma voltajı parametresini 2 mm çalışma mesafesi ile 4 kV'a ayarlayın (Şekil 3B ve Tablo 1).
NOT: Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek ve görüntüdeki paraziti azaltmak için, mümkün olduğunca düşük büyütme oranlarında gözlemleyin. Çoklu arttıkça, SEM'in tarama aralığı azalır ve bu da görüntülerde yük birikiminde bir artışa yol açar. - Üst menü çubuğundaki H/L simgesine tıklayın. İlk olarak, düşük büyütmede, hedef dilim şeritlerinin ilk bölümünü yönlendirin ve ardından yüksek büyütme moduna geçmek için Y /Y seçeneğine (Şekil 3A) tekrar tıklayın; Görüntü parlaklığını, kontrastını ve büyütmesini ayarlayarak ilgilenilen yapıya uygun bir görüntü toplayın.
- Proje Görünümü > Açık Veri'yi seçin ve analiz edilecek görüntü dosyalarını yazılıma aktarın.
- Dilimleri Hizala > Düzenle'ye tıklayarak resimleri hizalayın (Şekil 4B) ve görüntü saydamlığını değiştirerek sol alt menü çubuğundaki Yoğunluk Aralığı değerini ayarlayın. Burada yarı otomatik bir hizalama stratejisi kullanın; Özellikle, otomatik hizalama yoluyla, resimlerin önceki bir resimle çakışmasını sağlayın ve ardından manuel ince ayar yapın.
NOT: Bu çalışmada, hizalama işlemi sırasında, bir önceki görüntü referans olarak kullanılmış ve iki görüntünün hedef yapısını maksimum düzeyde örtüştürmek için taşıma ve döndürme işlemlerinden yararlanılmıştır. Geçerli Dilim Çiftini Hizala'ya tıklamak, görüntülerin otomatik olarak hizalanmasına yardımcı olabilir, ancak yanlış yerleştirme meydana gelebilir. - Alt Birimi Ayıkla modülünü seçin ve hizalanmış veri kümelerini tüm yığının çakışan kısmının boyutuna sığacak şekilde kırpın.
- Segmentasyon alt bölümünün altında (Şekil 4C), Segmentasyon > Kaydet> Yeniden Örnekle'yi seçin. Sihirli Değnek eşiğini ve boyutunu seçin Fırça doğru aralığı seçmek için araç. Burada yine, uygun bir geniş alanı otomatik olarak seçmek için önce Sihirli Değnek'i kullanarak yarı otomatik bir segmentasyon yöntemini benimseyin ve ardından ayrıntıları doğru bir şekilde tanımlamak için Fırçayı kullanın.
NOT: Sihirli Değnek , Maskeleme değerini değiştirerek ve Çizim Sınırı Çizgisi kullanılarak, ilgilenilen yapı ile çevresindeki yapılar arasında var olan piksel yoğunluğundaki bariz farklılıklara dayalı olarak görüntüleri bölümlere ayırmak için uygulanabilir. Görüntü alımı sırasında oluşan şarj artefaktlarını ayırt edemez. Bu nedenle, hedef bölgeler için yanlış segmentasyona neden olabilir. Fırça aracı, biyolojik yapıları doğru bir şekilde yeniden yapılandırmak için manuel olarak bölümlere ayırmak için kullanılabilir. - Segmentasyon > Seçimi altında, seçilen alanı eklemek için + simgesine tıklayın (Şekil 4C).
- İlgilenilen mikro yapıları yeniden oluşturmak için seçim tamamlanana kadar farklı görüntülerde aynı hedef yapıyı seçmek için yukarıdaki adımı (2.8) tekrarlayın.
NOT: Mitokondriyal yeniden modelleme işlemleri sırasında, hedef nesnenin seçimi, bir grup ardışık görüntünün ortasındaki resimden yapılmalıdır. Gerekli alan ilk veya son resimden seçilirse, rekonstrüksiyon sonucu tam bir 3D görselleştirme sunamayacaktır. - Bölgesel segmentasyonu tamamladıktan sonra, nesnenin boyutu ve resim çözünürlüğü için en iyi sonuçlara göre görüntü dosyasını oluşturun. Kırpma Düzenleyicisi'ne tıklayın ve ardından Sanal Kaydırıcı kutusuna 6 sayısını girin (Şekil 4C).
- Soldaki açılır menüde, Proje alt bölümünün altındaki gri alana sağ tıklayın ve Yüzey Oluştur > Oluştur > Uygula'yı seçin. Oluşturulan dosyada, yüzey yapısını ve 3B gösterimi oluşturmak için Yüzey Görünümü modülünü kullanın.
3. Niceleme
- Küçük Noktaları Kaldır'a tıklayın > uygulayın (Şekil 4D). Proje alt bölümünün altında, gri alana sağ tıklayın ve Etiket Analizi > Uygula'yı seçin (Şekil 4D).
- Sütunun adını özelleştirin ve bir ölçü grubu seçin. Yerel Ölçümler kutusundan Volume3d ve Length3d'yi seçin.
- Ekranın sol alt köşesindeki Uygula düğmesine tıklayın. Verileri kopyalayın ve GraphPad gibi istatistiksel yazılımlarda grafik çizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre kültürü sırasında (Şekil 1A), önce pankreas kanseri hücrelerini tam kültür ortamı ile kültürlenmiş bir kontrol grubuna, bir (1S, 3R)-RSL348 (RSL3, bir ferroptoz aktivatörü, 100 nM) grubuna ve bir RSL3 (100 nM) artı ferrostatin-149 (Fer-1, bir ferroptoz inhibitörü, 100 nM) grubuna ayırdık. Yukarıdaki deneysel adımlar sayesinde, taramalı elektron mikroskobu kontrol grubu, RSL3 grubu ve inhibitör grubu (RSL3 + Fer-1 grubu) için sırasıyla 38 (Ek Şekil 1), 43 (Ek Şekil 2) ve 44 (Ek Şekil 3) sıralı görüntü elde etti. 1.280 x 960 piksellik görüntüler 8.000 kat büyütmede (12.40 nm/piksel çözünürlükte) yakalandı. Hücre bölgesinde hem kırışıklıklar hem de kirlilik kesitlerin üzerinde gözlenmedi. Elektron mikroskobu resimleri, hücrelerdeki mitokondri ve endoplazmik retikulum gibi organelleri açıkça ayırt edebilir (Şekil 1E).
2D görüntülerin FE-SEM ile gözlemlenmesi, kanser hücrelerinin kontrol grubunda (Şekil 5A), mitokondrinin sitoplazma boyunca dağıldığını ve çoğunun küresel veya oval ve eşit derecede dolgun olduğunu gösterdi. Ek olarak, nispeten düzenli, uzun cristae mimarisi açıkça görülüyordu. Tersine, RSL3 grubunda (Şekil 5D), mitokondrinin çoğunluğu küçülen bir morfoloji, zar yoğunluğunda bir artış ve nispeten belirsiz bir cristae yapısı sergiledi. SEM resimlerinin daha yakından incelenmesi (Şekil 5E), nispeten az sayıda cristae bozulmadan kaldığı için tüm mitokondriyal cristaların dejenere olmadığını veya kaybolmadığını ortaya koydu. RSL3 grubu ile karşılaştırıldığında, inhibitör grubunda, mitokondrinin çoğu mitokondriyal cristae'nin integral yapısını korudu ve mitokondriyal cristae yapılarının sadece bir azınlığı belirgin değildi (Şekil 5G).
2D bilgi, mitokondriyal morfolojide farklılıklar gösterirken, bazen ayrıntılı ve gerçek 3D yapının önyargılı bir şekilde anlaşılmasına neden olabilir50,51. Kontrol grubunun 3D koşulu altındaki cristae yapıları (Şekil 5C) 2D görüntülerle tutarlıydı, ancak RSL3 grubu için farklıydı. Bu grup için, 2D görüntülerde tam mitokondriyal cristae'nin varlığı da gözlemlenebilir (Şekil 5E), ancak 3D altındaki mitokondri (Şekil 5F) düzensizdir ve genellikle ortada vakuollenmiştir. İnhibitör grubu (Şekil 5I) çeşitli krista şekilleri gösterdi, sadece bazı mitokondriyal kristalar lokalize çöküş sergiledi. Bu nedenle, RSL3 grubunun sonuçlarından, yalnızca 2D analizin kullanılmasının sonuçların tek taraflı olarak anlaşılmasına yol açabileceği görülebilir. 2D görüntülerin sonuçları, 3D görüntüleme için bir dizi görüntü istiflenirken sunulan sonuçlara kıyasla önyargılıdır, bu nedenle yalnızca 2D bilgi yoluyla üretilen sonuçları genelleştirmek mümkün değildir. RSL3'ün mitokondri üzerindeki etkilerini daha objektif bir şekilde göstermek için, mitokondriyal değişiklikleri ölçmek ve ölçmek için 3D rekonstrüksiyon verileri kullanıldı52. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, RSL3 grubundaki 3D mitokondrinin uzunluğu ve hacmi önemli ölçüde azaldı, ancak inhibitör grubunun kantitasyon sonuçları diğer iki grubun sonuçları arasında kaldı (Şekil 5J, K). Bu nicel veriler, RSL3'ün daha küçük ve bozulmuş mitokondri ürettiğini ve inhibitörlerin eklenmesinin bu etkiyi azalttığını göstermektedir.
Şekil 6B ve Şekil 6C'de gösterildiği gibi, ferroptoz indükleyicisi RSL3'ün mitokondriyal disfonksiyona neden olduğu ve mitokondriyal morfolojiyi 53,54 değiştirerek hücresel metabolizmayı etkilediği veRSL3 55 tarafından indüklenen kanser tedavisinde her yerde bulunan dinamik hücre ölümü formunu temsil edebilen ferroptozu ortaya çıkardığı belirlenmiştir.
Şekil 1: Pankreas kanseri hücresi mitokondrisinin 3D rekonstrüksiyonu için genel iş akışı. Bu protokolde açıklanan 3B rekonstrüksiyon deneyleri için genel bir iş akışı gösterilmiştir. (A) Pankreas kanseri hücrelerinin kültürü. (B) Reçine bloğunun hazırlanması. (C) Bir ultramikrotom kullanılarak seri kesitlerin toplanması. (D) Alan emisyon taramalı elektron mikroskobu kullanılarak 2D görüntülerin elde edilmesi. (E) Hedeflenen mitokondrinin sıralı SEM görüntülerinde konumlandırılması. (F) Mitokondrinin 3 boyutlu analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sürekli dilimlerin hidrofilize silikon gofret üzerine montajını dilim şeritleri için bir cihaz. (A) Gofretleri tutmak için forsepsli ayarlanabilir bir açı manipülatörü. (B) Ultramikrotomun yanına yerleştirilmiş gofret tutucunun çerçevesi. (C) Silikon gofretin elmas bıçağı içeren mavi yuvaya yerleştirilmesi. (D) Silikon gofret ile elmas bıçak bıçağı arasındaki konumsal ilişkiyi gösteren bir yakın çekim. (E) İletken karbon yapıştırıcı ile SEM'in numune aşamasına tutturulmuş dilim şeritlere sahip bir silikon gofret. (F) Seri dilim şeritlerinin genel görünümünü gösteren bir yakın çekim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Parametreleri ayarlama ve görüntüleri alma işlemi. (A) FE-SEM'in menü çubuğu (ok H/L seçeneğini gösterir). (B) Görüntüleme parametreleri ve koşulları tablosu. (C) Üç grupta ardışık 2D görüntülere genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Amira kullanarak mitokondriyi 3D olarak görselleştirmek için adım adım kılavuz. (A) Belirli bir klasörden görüntüleri içe aktarma. (B) Görüntü yığınlarını hedef yapıya göre hizalama. (C) İlgilenilen bölgeyi bölümlere ayırma ve ekleme. (D) 3B yapının yeniden yapılandırılması ve niceleme verilerinin eklenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Her gruptaki mitokondrinin 2B ve 3B morfolojisi. Kontrol grubunun (A) 8.000 kat büyütme ve (B) 15.000 kat büyütmede 2D kanser hücresi morfolojisi. (C) Kontrol grubunun mitokondriyal morfolojisinin 3 boyutlu gösterimi. RSL3 grubunun (D) 8.000 kat büyütme ve (E) 15.000 kat büyütmede 2D kanser hücresi morfolojisi. (F) RSL3 grubunun mitokondriyal morfolojisinin 3 boyutlu gösterimi. (G) 8.000 kat büyütme ve (H) 15.000 kat büyütmede RSL3 + Fer-1 (inhibitör) grubunun 2D kanser hücresi morfolojisi. (I) RSL3 + Fer-1 (inhibitör) grubunun mitokondriyal morfolojisinin 3 boyutlu gösterimi. Her gruptaki mitokondrinin (J) uzunluğu ve (K) ortalama hacmi için nicel veriler. Anlamlı farklılıklar yıldız işaretleriyle gösterilmiş ve Student t-testi kullanılarak hesaplanmıştır (kontrol grubuna kıyasla, *p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001.) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 2D ve 3D seviyelerinde kanser hücrelerinin mitokondriyal morfolojisindeki farklılıklar. (A) 8.000 kat büyütmede RSL3 grubunun 2D kanser hücresi morfolojisi. (B) Daha yüksek büyütmede 2D mitokondriyal morfoloji. (C) Belirli mitokondrinin 3 boyutlu gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Görüntüleme Parametreleri | Koşul -ları |
| Veri Boyutu | 1280 × 960 |
| Piksel Boyutu | 12.40234 |
| Hızlanma Gerilimi | 2000 Volt |
| Çalışma Mesafesi | 3700μm |
| Emisyon Akımı | 13700 deniz mili |
| Işın akımı | 10μA |
| Akım sınırlayıcı diyafram açıklığı | FE-SEM'in 2 numaralı ızgarası |
| Bekleme süresi | 32 μs/piksel |
| Hücre sayısı | 107 |
| Görüntülü birimler | 10×8×2.66μm, 212.8μm³ |
| 10×8×3.01μm, 240.8μm³ | |
| 10×8×3.08μm, 246.4μm³ |
Tablo 1: Görüntü alımı için kayıt koşullarının ve veri kümesi parametrelerinin özeti.
Ek Şekil 1: Kontrol grubundan 38 kanser hücresi mikrokesitinin görüntülerine genel bakış. Her mikrokesitin görüntü numarası yukarıdan aşağıya doğru düzenlenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: RSL3 grubundan 43 kanser hücresi mikrokesitinin görüntülerine genel bakış. Her mikrokesitin görüntü numarası yukarıdan aşağıya doğru düzenlenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3:RSL3 + Fer-1 (inhibitör) grubundan 44 kanser hücresi mikrokesitinin görüntülerinin görüntülenmesi. Her mikrokesitin görüntü numarası yukarıdan aşağıya doğru düzenlenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem, seri ultra ince kesitlerden oluşturulan 2D tomografik görüntülerin istiflenmesine ve segmentasyonuna elektron mikroskobu ve görüntü işleme teknolojisinin uygulanmasını içeren 3D rekonstrüksiyon tekniğini uygulamak için adım adım yararlı bir kılavuzdur. Bu protokol, yapıların yüksek çözünürlük düzeyinde güçlü tekrarlanabilirliği ve daha yüksek doğrulukta avantajlarına sahip olan organel üst yapısının 3D görselleştirilmesi ile ele alınabilecek 2D görüntülerin bir sınırlamasını vurgulamaktadır. Daha da önemlisi, bu 3D görselleştirme, patolojik mekanizmaların incelenmesini daha basit ve güvenilir hale getirmek için tümör hücrelerine uygulanabilir. Bu teknik, bu çalışmada, farklı koşullar altında üç set seri kesiti karşılaştırarak mitokondriyal kristaların stereoskopik yapılarını görselleştirmek ve böylece kanser hücrelerinde meydana gelen RSL3 kaynaklı mitokondriyal krista membran bozulmasını doğrulamak için incelenmiştir56. Bu sonuçlar, bir anti-pankreas kanseri ilacı olarak RSL3'ün etki mekanizması hakkında fikir vermektedir.
Yüksek çözünürlüklü 2D görüntülerin elde edilmesi, mitokondriyal cristae'nin 3D rekonstrüksiyonu57 sürecinde önemli bir rol oynar ve görüntü kalitesi, rekonstrüksiyon sonuçlarını 22,58 doğrudan etkiler. Bu nedenle, bu yöntemin SEM görüntülerinde59 oluşturulan şarj artefaktları gibi bazı sınırlamaları da vardır ve bu da hedef yapıların yanlış bölümlenmesine yol açabilir. Bu sorun, dilim tarama süresinin kısaltılması, SEM'in bir odak yük kompansatörü 34,60 ile donatılması ve TCH kullanımının ek metallerle boyama yoluyla numuneyi elektronlara daha iletken hale getirebileceğiOTO yöntemi kullanılarak çözülebilir 61. Otomatik görüntü segmentasyonuna güvenmek, yapının kapsamını belirleme açısından yanlış olma eğilimindeyken, manuel segmentasyon zaman alıcıdır58. Bu nedenle, görüntü toplamayıgerçekleştirmek için SEM'in hızlı tarama avantajı 62 temelinde, Amira yazılımındaki yarı otomatik segmentasyon, verimli görüntüleme ve yeniden yapılandırma sağlamak için kullanılabilir; Amira yazılımını kullanmak, sonucu FIJI ve MIB63 kullanmaktan daha doğru ve kesin hale getirebilir. 3D görüntülemede en önemli adım, ultra ince kesitler elde etmektir. Görüntü sürekliliğini etkileyen ihmal, kırılma ve bozulma gibi sorunlar genellikle kesit toplama sırasında ortaya çıkar. Dilimlerin kaybolması ve kırılması gibi sorunları çözmek için, dilim şeritlerinin toplanmasına destek olarak hidrofilize silikon gofretler kullandık.
SBF-SEM ve FIB-SEM, kesitlerdeki deformasyonu veya kusurları azaltabilse de, bu teknikler yavaş bir görüntüleme hızına sahiptir, pahalı aletler gerektirir ve ilgilenilen yapıyı yeniden görüntüleyemez64,65,66. FIB-SEM, görüntüleme sırasında sistem kararlılığından yoksundur, SBF-SEM ise karmaşık numune hazırlama adımları ve sıkıcı bir iş akışı nedeniyle engellenir34. Son zamanlarda, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobik görüntüleme, mitokondriyal yapının incelenmesine kademeli olarak uygulanmıştır. Bu yöntem, mitokondriyal etiketleme için probların yapımı yoluyla canlı hücrelerde mitokondriyal cristae'nin 3D gerçek zamanlı görüntülerini izler67. Floresan boya etiketlemesi, kristae sırasında mitokondriyal füzyon ve fisyondaki değişim süreçlerini ortaya çıkarabilir68. Bununla birlikte, canlı hücrelerin yoğun ışığa karşı sınırlı toleransı vardır, bu nedenle bu tekniği uzun süreli STED görüntülemede kullanmak zordur68. Ek olarak, STED çözünürlüğü, görüntüleme derinliği ve69 piksel sayısı ile sınırlıdır.
Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, organel üst yapısını geniş bir görüş alanından gözlemlemek için 3D rekonstrüksiyon teknolojisi ile birleştirilmiş sürekli ultra ince kesitlerin kullanılması, yalnızca kısa sürede yüksek verimli görüntülemeye izin vermekle kalmaz, aynı zamanda hedef yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülerinin ayrık zamanlarda incelenmesini de sağlar21, böylece görüntüleme hızını ve rekonstrüksiyon esnekliğini artırır. Ayrıca, organel morfolojik değişiklikleri ve diğer organellerle mekansal bağlantılar daha fazla incelenebilir. Bu yönler ölçülebilir ve değişim mekanizmaları, konumsal ilişkilerini göstermek için bitişik organellerin yeniden yapılandırılmasıyla daha doğru bir şekilde ortaya çıkarılabilir70,71. Amira58 kullanan bu 3D rekonstrüksiyon ve seri kesit görüntüleme teknolojisi, nano ölçekte 72 hastalıklar ve organel ultrastrüktürel değişiklikleri arasındaki ilişkiyi ortaya koymakta, tıpta, biyolojide ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve etkili yeni terapötiklerin geliştirilmesinin önünü açmaktadır73,74.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (Z23H290001, LY19H280001) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (82274364, 81673607 ve 81774011); Huzhou Bilim ve Teknoloji Hibesi'nin Kamu Refahı Araştırma Projesi'nin yanı sıra (2021GY49, 2018GZ24). Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Tıbbi Araştırma Merkezi Kamu Platformu'ndan gelen büyük yardım, teknik destek ve deneysel destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetone | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
| Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
| Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
| Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
| Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
| Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
| Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 |
References
- Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
- Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
- Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
- Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
- Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
- Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
- Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
- Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
- Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
- Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
- Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
- Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L.
- Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
- Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
- Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
- Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
- Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Kittelmann, M.
- Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
- Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
- Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
- Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
- Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
- Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
- Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
- Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
- Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
- Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
- Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
- Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
- Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
- Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
- Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
- Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
- Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
- Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
- Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
- Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
- Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
- Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
- Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
- Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
- Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
- Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
- Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
- Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
- Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A.
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
- Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
- Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
- Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
- Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).
