Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man rekonstruerer mitokondriecristae for at opnå 3D-billeddannelse med høj nøjagtighed, høj opløsning og højt gennemløb.
Abstract
Forståelse af de dynamiske træk ved celleorganellens ultrastruktur, som ikke kun er rig på ukendt information, men også sofistikeret fra et tredimensionelt (3D) perspektiv, er afgørende for mekanistiske studier. Elektronmikroskopi (EM) giver god billeddybde og giver mulighed for rekonstruktion af billedstakke i høj opløsning for at undersøge den ultrastrukturelle morfologi af cellulære organeller selv på nanometerskala; derfor får 3D-rekonstruktion betydning på grund af dens uforlignelige fordele. Scanning elektronmikroskopi (SEM) giver en high-throughput billedoptagelsesteknologi, der gør det muligt at rekonstruere store strukturer i 3D fra det samme område af interesse i på hinanden følgende skiver. Derfor bliver anvendelsen af SEM i storstilet 3D-rekonstruktion for at genoprette den ægte 3D-ultrastruktur af organeller stadig mere almindelig. I denne protokol foreslår vi en kombination af seriel ultratynd sektion og 3D-rekonstruktionsteknikker til at studere mitokondrie-cristae i kræftceller i bugspytkirtlen. Detaljerne om, hvordan disse teknikker udføres, beskrives i denne protokol trin for trin, herunder osmium-thiocarbohydrazid-osmium (OTO) -metoden, den serielle ultratynde sektionsbilleddannelse og visualiseringsdisplayet.
Introduction
Mitokondrier er en af de vigtigste organeller i cellen. De tjener som det centrale knudepunkt for cellulær bioenergetik og metabolisme 1,2 og spiller en kritisk rolle i kræft3. Kræft i bugspytkirtlen (PC) er en af de sværeste kræftformer4 at behandle på grund af dens hurtige spredning og høje dødelighed. Mitokondriel dysfunktion, som hovedsageligt skyldes ændringer i mitokondriemorfologien 3,5,6,7, har været forbundet med sygdomsmekanismerne bag PC8. Mitokondrier er også meget dynamiske, hvilket afspejles af de hyppige og dynamiske ændringer i deres netværksforbindelse og cristae-struktur9. Omformningen af cristaestrukturen kan direkte påvirke mitokondriefunktionen og cellulær tilstand10,11, som ændres signifikant under tumorcellevækst, metastase og tumormikromiljøændringer12,13.
I de senere år har forskere studeret denne organel ved hjælp af EM-observation14,15,16,17; for eksempel har forskere analyseret mitokondriedynamikken ved hjælp af 3D-rekonstruktionsteknikker 6,7,18,19. Det generelle koncept og metode til 3D-rekonstruktion af elektronmikroskopibilleder blev formelt etableret allerede i 196820 og involverede kombination af elektronmikroskopi, elektrondiffraktion og computerbilledbehandling for at rekonstruere T4-faghalen. Indtil nu har elektronmikroskopi 3D-billeddannelsesteknologi gjort betydelige fremskridt med hensyn til billedopløsning 21, automatiseringsgrad 22 og behandlingsvolumen23 og er blevet brugt i stadig bredere skala inden for biologisk forskning, fra vævsniveau til organel ultrastrukturniveau på nanometerskala24. I de senere år er elektronmikroskopi 3D-billeddannelse også blevet en lovende teknologi til en bred vifte af applikationer25,26,27.
Den voksende opmærksomhed på mitokondrie-cristae illustrerer især de væsentlige krav til ultrastrukturel volumenbilleddannelse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er blevet brugt til at visualisere prøver indsamlet på et kobbergitter (400 mesh)28, hvor elektronstrålen passerer gennem sektionen. På grund af kobbergitterets begrænsede rækkevidde er det imidlertid umuligt fuldt ud at afbilde kontinuerlige skiver af den samme prøve29. Dette komplicerer undersøgelsen af målstrukturer under TEM-billeddannelse. Derudover er TEM afhængig af tidskrævende og fejlbehæftede manuelle opgaver, herunder skæring og indsamling af flere skiver og billeddannelse af dem sekventielt21, så det er ikke tilpasset til ultrastrukturelle rekonstruktioner af prøver i store mængder23. På nuværende tidspunkt opnås rekonstruktion i høj opløsning af prøvebilleddannelse i store mængder ved brug af specialudstyr, såsom TEM-kameraarrayet (TEMCA)30 eller to andengenerations-TEMCA-systemer (TEMCA2)31, som muliggør automatiseret billeddannelse med høj kapacitet på kort tid. Denne type billeddannelse har imidlertid ikke fordelen ved at være let at opnå og universel på grund af kravet om tilpasset udstyr.
Sammenlignet med TEM forbedrer metoden til automatisk generering af tusindvis af serielle volumetriske billeder til store områder baseret på SEM 32,33 effektiviteten og pålideligheden af seriel billeddannelse og leverer højere z-opløsninger34. For eksempel har seriel blokfladescanningelektronmikroskopi (SBF-SEM) og fokuseret ionstrålescanningelektronmikroskopi (FIB-SEM) begge gjort det muligt at opnå 3D-rekonstruktion af ultrastruktur med høj hastighed, effektivitet og opløsning35,36. Det er imidlertid uundgåeligt, at blokoverfladen barberes mekanisk af SBF-SEM's diamantkniv eller ved fræsning med den fokuserede ionstråle i FIB-SEM33,37. På grund af de to metoders destruktivitet over for prøverne er det ikke muligt at rekonstruere den samme målstruktur igen til yderligere analyse38,39,40. Derudover har få undersøgelser forsøgt at rekonstruere 3D-organelultrastrukturen af kræftceller ved hjælp af EM for at observere patologiske ændringer12. Af disse grunde foreslår vi for yderligere at belyse de patologiske mekanismer i kræftceller, såsom kræftceller i bugspytkirtlen, en ny teknologi til 3D-rekonstruktion af serielle sektionsbilleder ved hjælp af et ultramikrotomt og et feltemissionsscanningelektronmikroskop (FE-SEM) til at analysere mitokondrie-ultrastrukturen på cristae-niveau; Med denne teknologi kan data i høj opløsning erhverves ved hjælp af en effektiv og tilgængelig metode. De serielle ultratynde sektioner lavet ved hjælp af et ultramikrotomt kan gemmes semi-permanent i et gitterhus og genafbildes flere gange, selv efter flere år41. FE-SEM er højt værdsat som et værktøj inden for forskellige forskningsområder på grund af dets evne til at levere billeddannelse i høj opløsning, høj forstørrelse og alsidighed42. I et forsøg på at vise organellernes fine struktur i 3D kan teknikken til fremstilling af serielle 2D-billedstakke med nyttig opløsning ved hjælp af tilbagespredte elektroner produceret af FE-SEM 43,44 også bruges til at opnå billeddannelse med høj gennemstrømning og multiskala af målregioner eller deres tilknyttede strukturer uden specielt udstyr 45. Genereringen af ladningsartefakter påvirker direkte kvaliteten af de erhvervede billeder, så det er især vigtigt at holde opholdstiden kort.
Således uddyber denne undersøgelse de eksperimentelle procedurer, der anvendes i denne SEM-teknik til at rekonstruere 3D-strukturen af mitokondrie-cristae46. Specifikt viser vi processen udviklet til at opnå den halvautomatiske segmentering af mitokondrieregioner og digitalisere 3D-rekonstruktionen ved hjælp af Amira-software, som også involverer fremstilling af skiveprøver ved hjælp af den konventionelle OTO-prøveforberedelsesmetode44,47, færdiggørelse af sektionssamlingen ved hjælp af ultramicrotomskæring og erhvervelse af sekventielle 2D-data af FE-SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materiale forberedelse
- Dyrkning 2 x 106 Panc02-celler i 12 ml DMEM-medium (10% føtalt bovint serum og 100 E / ml penicillin-streptomycin) og opretholdes ved 37 ° C og 95% fugtighed i en atmosfære på 5% kuldioxid og 95% luft i 48 timer.
- Panc02-celler opsamles, centrifugeres ved 28 x g i 2 min., og supernatanten kasseres derefter. Sørg for, at prøven har en passende størrelse (1 x 107 celler), da ellers fungerer følgende fikserings- og dehydreringstrin ikke godt.
- Tilsæt 1 ml 2,5% glutaraldehyd som fikseringsmiddel for at fiksere de friske Panc02-celler i 1,5 ml mikrocentrifugeglas natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Prøverne skal centrifugeres ved 1.006 x g i 5 minutter i hvert af følgende trin (trin 1.3-1.11). - Opsug fikseringsmidlet, og skyl prøverne to gange med 0,1 M fosfatbufret saltvand (PBS), og skyl derefter to gange med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) ved stuetemperatur i 10 minutter hver.
- Der tilsættes 50 μL af en opløsning indeholdende 1 % osmiumtetroxid (OsO4) og 1,5 % kaliumferrocyanid i forholdet 1:1 ved 4 °C i 1 time. Skyl derefter to gange med 0,1 M PBS i 10 minutter hver gang, og skyl med ddH2O i yderligere 10 minutter.
- Tilsæt 1 ml 1% thiocarbohydrazid (TCH), inkuber ved stuetemperatur i 30 min til 1 time, og skyl derefter med ddH2O fire gange i 10 minutter hver gang.
- Tilsæt 50 μL 1% OsO4, fiks ved stuetemperatur i 1 time, og skyl derefter med ddH2O fire gange i 10 minutter hver gang.
- Tilsæt 1 ml 2% uranylacetat ved 4 °C natten over, og skyl derefter med ddH2O fire gange i 10 minutter hver gang.
- Der tilsættes 1 ml Waltonopløsning (0,066 g blynitrat opløst i 10 ml 0,03 mol/l stamopløsning af asparaginsyre) ved 60 °C til yderligere 1 times inkubation.
- Skyl med ddH2O fire gange i 10 minutter hver gang, og dehydrer derefter i en sorteret alkoholserie i 10 minutter hver gang: 50% alkohol, 70% alkohol, 80% alkohol og 90% alkohol 1x og 100% alkohol 2x. Derefter dehydreres i 100% acetone to gange i 10 minutter hver gang. Brug 1 ml af hver opløsning til dehydrering.
- Bland 200 μL acetone med Pon 812 epoxyharpiks i forholdet 3: 1, 1: 1 og 1: 3. Blødgør prøven i harpiks ved stuetemperatur i henholdsvis 2 timer, 4 timer og 4 timer, og tag derefter 100% Pon 812 epoxyharpiksen for at imprægnere natten over.
BEMÆRK: Når du udfører farvnings- og harpiksindlejringstrinnene, er det vigtigt at operere i en stinkhætte, da disse er giftige stoffer. Derudover skal laboratoriefrakker og opløsningsmiddelresistente handsker bæres under eksperimentet. - Sæt prøverne i en indlejringsform, og sæt dem derefter i en ovn ved 60 ° C i 48 timer for at polymerisere. Brug flad indlejring29 for at reducere forekomsten af harpiks omkring prøven. Dette forenkler prøveinstallationen og mindsker virkningen af opladningsartefakter på den efterfølgende billedsegmentering.
BEMÆRK: For efterfølgende at generere en vandret skæreflade kan der tilsættes en lille mængde harpiks i formhullet, idet man passer på ikke at overfylde det. - Forbered siliciumskiver ved først at vaske dem og derefter hydrofilisere med en koncentreretH2SO4/H2O2-opløsningi 30 min. Skivestrimler med en tykkelse på 70 nm opsamles serielt på de hydrofile siliciumskiver ved hjælp af et ultramikrotomt, og tør dem i en ovn på 60 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Indfang langsomt skiven, når skiven flyder til overfladen af skiverne for at forhindre udsnitstab eller deformation.
2. Billedoptagelse og tredimensionel rekonstruktion
- Før du monterer en siliciumskive på scenen, skal du vaske sektionerne med destilleret vand tre gange og lufttørre dem. Klip et ledende carbontape med en størrelse på 1 cm x 0,5 cm, og sæt dette mellem siliciumskiven og SEM-prøvetrinnet for at fuldføre prøveopsætningen (figur 2E).
- Indstil FE-SEM-accelerationsspændingsparameteren til 2 kV med en arbejdsafstand på 4 mm (figur 3B og tabel 1).
BEMÆRK: For at forbedre signal-støj-forholdet og reducere støjen i billedet skal du observere ved lave forstørrelser, når det er muligt. Når multipelen øges, falder SEM's scanningsområde, hvilket fører til en stigning i opladningsakkumulering på billederne. - Klik på H / L-ikonet i den øverste menulinje. Først skal du orientere den første sektion af måludsnitsstrimlerne ved lav forstørrelse og derefter klikke igen på indstillingen H/L (figur 3A) for at skifte til høj forstørrelsestilstand. Indsaml et passende billede til strukturen af interesse ved at justere billedets lysstyrke, kontrast og forstørrelse.
- Vælg Projektvisning > åbne data, og importer de billedfiler, der skal analyseres, til softwaren.
- Juster billederne ved at klikke på Juster udsnit > Rediger (figur 4B), og juster værdien for Intensitetsområde i menulinjen nederst til venstre ved at ændre billedets gennemsigtighed. Brug her en halvautomatisk justeringsstrategi; Specifikt gennem automatisk justering skal du få billederne til at overlappe med et tidligere billede og derefter udføre manuel finjustering.
BEMÆRK: I dette arbejde blev det forrige billede brugt som reference under justeringsprocessen, og flytnings- og rotationsoperationerne blev brugt til maksimalt at overlappe målstrukturen for de to billeder. Hvis du klikker på Juster aktuelt skivepar , kan det hjælpe med at justere billederne automatisk, men der kan forekomme forkert placering. - Vælg modulet Udtræk undervolumen, og klip de justerede datasæt, så de passer til størrelsen på den overlappende del af hele stakken.
- Under underafsnittet Segmentering (figur 4C) skal du vælge Resample > Segmentering > Gem. Vælg tærsklen til tryllestaven og størrelsen på penselværktøjet for at vælge det korrekte område. Her skal du igen anvende en halvautomatisk segmenteringsmetode ved først at bruge tryllestaven til automatisk at vælge et passende stort område og derefter bruge penslen til nøjagtigt at beskrive detaljerne.
BEMÆRK: Tryllestaven kan anvendes til segmentbilleder baseret på de åbenlyse forskelle i pixelintensiteten, der findes mellem strukturen af interesse og de omgivende strukturer ved at ændre maskeringsværdien og bruge Draw Limit Line. Det er ikke i stand til at skelne mellem de opladningsartefakter, der genereres under billedoptagelse. Det kan derfor resultere i forkert segmentering for målregionerne. Penselværktøjet kan bruges til at segmentere manuelt for nøjagtigt at rekonstruere de biologiske strukturer. - Under Segmentering > Valg skal du klikke på ikonet + for at tilføje det valgte område (figur 4C).
- Gentag ovenstående trin (2.8) for at vælge den samme målstruktur i forskellige billeder, indtil udvælgelsen er fuldført til rekonstruktion af de relevante mikrostrukturer.
BEMÆRK: Under mitokondrieombygningsprocesserne skal valget af målobjektet udføres fra billedet midt i en gruppe sekventielle billeder. Hvis det krævede område vælges fra det første eller sidste billede, vil rekonstruktionsresultatet ikke kunne præsentere en komplet 3D-visualisering. - Når du har afsluttet den regionale segmentering, skal du generere billedfilen i henhold til de bedste resultater for objektets størrelse og billedopløsningen. Klik på Crop Editor, og indtast derefter nummer 6 i feltet Virtual Slider (figur 4C).
- I rullemenuen til venstre skal du højreklikke på det grå område under underafsnittet Projekt og vælge Opret Surface > Opret > Anvend. I den genererede fil skal du bruge Surface View-modulet til at oprette overfladestrukturen og 3D-repræsentationen.
3. Kvantificering
- Klik på Fjern små pletter > anvende (figur 4D). Under underafsnittet Projekt skal du højreklikke på det grå område og vælge Etiketanalyse > anvende (figur 4D).
- Tilpas navnet på kolonnen, og vælg en målingsgruppe. Vælg Volumen3d og Længde3d i feltet Oprindelige mål.
- Klik på knappen Anvend i nederste venstre hjørne af skærmen. Kopier dataene og grafen i statistiksoftwaren, såsom GraphPad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under cellekultur (figur 1A) opdelte vi først kræftcellerne i bugspytkirtlen i en kontrolgruppe dyrket med komplet dyrkningsmedium, en (1S,3R)-RSL348 (RSL3, en ferroptoseaktivator, 100 nM) gruppe og en RSL3 (100 nM) plus ferrostatin-149 (Fer-1, en ferroptosehæmmer, 100 nM) gruppe. Gennem ovenstående eksperimentelle trin erhvervede scanningelektronmikroskopet 38 (supplerende figur 1), 43 (supplerende figur 2) og 44 (supplerende figur 3) sekventielle billeder til henholdsvis kontrolgruppen, RSL3-gruppen og inhibitorgruppen (RSL3 + Fer-1-gruppen). Billederne på 1.280 x 960 pixels blev taget ved 8.000 gange forstørrelse (med en opløsning på 12,40 nm/pixel). Både rynker og forurening i celleområdet blev ikke observeret over sektionerne. Elektronmikroskopbillederne kunne tydeligt skelne organellerne, såsom mitokondrier og endoplasmatisk retikulum, i cellerne (figur 1E).
Observationen af 2D-billederne af FE-SEM viste, at mitokondrierne i kontrolgruppen af kræftceller (figur 5A) blev fordelt gennem cytoplasmaet, og de fleste af dem var sfæriske eller ovale og jævnt fyldige. Derudover var den relativt regelmæssige, langstrakte cristae-arkitektur tydeligt synlig. Omvendt udviste størstedelen af mitokondrierne i RSL3-gruppen (figur 5D) en krympende morfologi, en stigning i membrantætheden og en forholdsvis vag cristae-struktur. Nærmere inspektion af SEM-billederne (figur 5E) afslørede, at ikke alle mitokondrie cristae degenererede eller forsvandt, da et relativt lille antal cristae forblev intakte. Sammenlignet med RSL3-gruppen opretholdt de fleste mitokondrier i inhibitorgruppen den integrerede struktur af mitokondrie-cristae, og kun et mindretal af mitokondrie-cristaestrukturerne var ikke synlige (figur 5G).
Mens 2D-information viser forskelle i mitokondriemorfologi, kan det undertiden resultere i en forudindtaget forståelse af den detaljerede og reelle 3D-struktur50,51. Kontrolgruppens cristaestrukturer under 3D-tilstand (figur 5C) var i overensstemmelse med 2D-billederne, men de var forskellige for RSL3-gruppen. For denne gruppe kunne tilstedeværelsen af komplet mitokondrie cristae også observeres i 2D-billederne (figur 5E), men mitokondrierne under 3D (figur 5F) var uregelmæssige og generelt vakuolerede i midten. Inhibitorgruppen (figur 5I) viste forskellige cristaeformer, hvor kun nogle mitokondrie cristae udviste lokaliseret sammenbrud. Fra resultaterne af RSL3-gruppen kan det således ses, at kun ved hjælp af 2D-analyse kan føre til en ensidig forståelse af resultaterne. Resultaterne af 2D-billeder er partiske sammenlignet med de resultater, der præsenteres, når du stabler et sæt billeder til 3D-visning, så det er ikke muligt at generalisere resultater, der kun produceres gennem 2D-information. For mere objektivt at demonstrere virkningerne af RSL3 på mitokondrier blev 3D-rekonstruktionsdata brugt til at kvantificere og måle mitokondrieændringer52. Sammenlignet med kontrolgruppen blev længden og volumenet af 3D-mitokondrierne i RSL3-gruppen signifikant reduceret, men kvantificeringsresultaterne for inhibitorgruppen faldt mellem resultaterne fra de to andre grupper (figur 5J, K). Disse kvantitative data tyder på, at RSL3 producerer mindre og nedbrudte mitokondrier, og tilsætning af inhibitorer reducerer denne effekt.
Som vist i figur 6B og figur 6C blev det fastslået, at ferroptoseinduceren RSL3 forårsagede mitokondriel dysfunktion og påvirkede den cellulære metabolisme ved at ændre mitokondriemorfologien 53,54 og fremkalde ferroptose, som kan repræsentere en allestedsnærværende form for dynamisk celledød i kræftbehandling induceret afRSL3 55.
Figur 1: Generel arbejdsgang for 3D-rekonstruktion af mitokondrier i bugspytkirtelkræftceller. En generel arbejdsgang for de 3D-rekonstruktionseksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, er demonstreret. (A) Dyrkning af kræftceller i bugspytkirtlen. B) Fremstilling af harpiksblokken. (C) Samling af serielle sektioner ved hjælp af et ultramikrotom. (D) Erhvervelse af 2D-billeder ved hjælp af et feltemissionsscanningelektronmikroskop. (E) Placering af målmitokondrierne i de sekventielle SEM-billeder. (F) Analyse af mitokondrierne i 3D. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: En anordning til skivestrimler montering af kontinuerlige skiver på en hydrofiliseret siliciumskive. (A) En justerbar vinkelmanipulator med tang til at holde waferen. (B) Skiveholderens ramme placeret ved siden af ultramikrotomet. (C) Placering af siliciumskiven i den blå åbning, der indeholder diamantkniven. (D) Et nærbillede, der viser positionsforholdet mellem siliciumskiven og diamantknivbladet. E) En siliciumskive med skivestrimler, der er fastgjort til prøvetrinnet i SEM med ledende kullim. (F) Et nærbillede, der viser den generelle oversigt over de serielle skivestrimler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Processen med at indstille parametrene og erhverve billederne. (A) Menulinjen i FE-SEM (pilen peger på indstillingen H/L). B) Tabel over billeddannelsesparametre og -betingelser. (C) Oversigt over fortløbende 2D-billeder i tre grupper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: En trinvis vejledning til visualisering af mitokondrier i 3D ved hjælp af Amira. (A) Import af billeder fra en bestemt mappe. (B) Justering af billedstakke i henhold til målstrukturen. (C) Segmentering og tilføjelse af interesseområdet. (D) Rekonstruktion af 3D-strukturen og tilføjelse af kvantificeringsdata. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Mitokondriernes 2D- og 3D-morfologi i hver gruppe. 2D-kræftcellemorfologien i kontrolgruppen ved (A) 8.000 gange forstørrelse og (B) 15.000 gange forstørrelse. (C) En 3D-repræsentation af kontrolgruppens mitokondriemorfologi. 2D-kræftcellemorfologien i RSL3-gruppen ved (D) 8.000 gange forstørrelse og (E) 15.000 gange forstørrelse. (F) En 3D-repræsentation af mitokondriemorfologien i RSL3-gruppen. 2D-kræftcellemorfologien af RSL3 + Fer-1 (inhibitor) gruppen ved (G) 8.000 gange forstørrelse og (H) 15.000 gange forstørrelse. (I) En 3D-repræsentation af mitokondriemorfologien af RSL3 + Fer-1 (inhibitor) gruppen. De kvantitative data for (J) længden og (K) det gennemsnitlige volumen af mitokondrierne i hver gruppe. Signifikante forskelle er angivet med stjerner og blev beregnet ved hjælp af elevens t-test (vs. kontrolgruppe, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001.) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Forskelle i mitokondriemorfologien af kræftceller på 2D- og 3D-niveauer . (A) RSL3-gruppens 2D-kræftcellemorfologi ved 8.000 gange forstørrelse. (B) 2D mitokondriemorfologien ved en højere forstørrelse. (C) En 3D-repræsentation af specifikke mitokondrier. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Billeddannende parametre | Kår |
| Datastørrelse | 1280 × 960 |
| Pixelstørrelse | 12.40234 |
| AccelererendeSpænding | 2000 Volt |
| Arbejdsafstand | 3700μm |
| EmissionStrøm | 13700 nA |
| Stråle strøm | 10μA |
| Strømbegrænsende blænde | Nr. 2 rist af FE-SEM |
| Dvæle tid | 32 μs/px |
| Antal celler | 107 |
| Afbildede mængder | 10×8×2,66μm, 212,8μm³ |
| 10×8×3.01μm, 240.8μm³ | |
| 10×8×3.08μm, 246.4μm³ |
Tabel 1: Oversigt over optagelsesbetingelserne og parametrene for datasættet.
Supplerende figur 1: Oversigt over billeder af 38 kræftcellemikrosektioner fra kontrolgruppen. Billednummeret for hver mikrosektion er arrangeret fra top til bund. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Oversigt over billeder af 43 kræftcellemikrosektioner fra RSL3-gruppen. Billednummeret for hver mikrosektion er arrangeret fra top til bund. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Overview af billeder af 44 kræftcellemikrosektioner fra RSL3 + Fer-1 (inhibitor) gruppen. Billednummeret for hver mikrosektion er arrangeret fra top til bund. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden, der præsenteres her, er en nyttig trinvis vejledning til anvendelse af 3D-rekonstruktionsteknikken, som indebærer anvendelse af elektronmikroskopi og billedbehandlingsteknologi til stabling og segmentering af 2D-tomografiske billeder genereret fra serielle ultratynde sektioner. Denne protokol fremhæver en begrænsning af 2D-billeder, der kan løses ved 3D-visualisering af organellens ultrastruktur, som har fordelene ved stærk reproducerbarhed af strukturerne på et højopløsningsniveau og højere nøjagtighed. Endnu vigtigere er det, at denne 3D-visualisering kan anvendes på tumorceller for at gøre undersøgelsen af patologiske mekanismer mere ligetil og pålidelig. Denne teknik blev undersøgt i dette arbejde til visualisering af de stereoskopiske strukturer af mitokondrie cristae ved at sammenligne tre sæt serielle sektioner under forskellige betingelser og derved validere den RSL3-inducerede mitokondrie cristae membrannedbrydning, der forekommer i kræftceller56. Disse resultater giver indsigt i virkningsmekanismen for RSL3 som et lægemiddel mod kræft i bugspytkirtlen.
Erhvervelsen af 2D-billeder i høj opløsning spiller en vigtig rolle i processen med 3D-rekonstruktion57 af mitokondrie-cristae, og billedkvaliteten påvirker direkte rekonstruktionsresultaterne 22,58. Derfor har denne metode også nogle begrænsninger, såsom opladningsartefakterne genereret i SEM-billeder59, hvilket igen kan føre til forkert segmentering af målstrukturerne. Dette problem kan løses ved at forkorte skivescanningstiden, udstyre SEM med en fokalladningskompensator34,60 og anvende OTO-metoden, hvor brugen af TCH kan gøre prøven mere ledende for elektroner ved farvning med yderligere metaller 61. At stole på automatisk billedsegmentering har tendens til at være unøjagtig med hensyn til at bestemme strukturens omfang, mens manuel segmentering er tidskrævende58. På baggrund af SEM's hurtige scanningsfordel til at realisere billedsamling62 kan den halvautomatiske segmentering i Amira-software derfor bruges til at muliggøre effektiv billeddannelse og rekonstruktion; brug af Amira-software kan også gøre resultatet mere præcist og præcist end at bruge FIJI og MIB63. Det vigtigste trin i 3D-billeddannelse er at erhverve ultratynde sektioner. Problemer som udeladelse, brud og forvrængning, som påvirker billedkontinuiteten, opstår ofte under sektionsindsamling. For at løse problemer som tab og brud på skiver brugte vi hydrofile siliciumskiver som støtte til indsamling af skivestrimlerne.
Selvom SBF-SEM og FIB-SEM kunne reducere deformation af eller defekter i sektionerne, har disse teknikker en langsom billeddannelseshastighed, kræver dyre instrumenter og er ude af stand til at genskabe strukturen af interesse64,65,66. FIB-SEM mangler systemstabilitet under billeddannelse, mens SBF-SEM hindres af komplicerede prøveforberedelsestrin og en kedelig arbejdsgang34. For nylig er stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopisk billeddannelse gradvist blevet anvendt til undersøgelse af mitokondriestruktur. Denne metode overvåger 3D-realtidsbilleder af mitokondrie-cristae i levende celler gennem konstruktion af sonder til mitokondriemærkning67. Fluorescerende farvestofmærkning kan afsløre forandringsprocesserne i cristaeduring mitokondriel fusion og fission68. Imidlertid har levende celler begrænset tolerance for intenst lys, så det er svært at bruge denne teknik i langvarig STED-billeddannelse68. Derudover er STED begrænset af dens opløsning, billeddybde og pixelnummer69.
Sammenlignet med andre teknikker giver brugen af kontinuerlige ultratynde sektioner kombineret med 3D-rekonstruktionsteknologi til at observere organelultrastruktur fra et bredt synsfelt ikke kun mulighed for billeddannelse med høj kapacitet på kort tid, men muliggør også undersøgelse af billeder i høj opløsning af målstrukturer på diskrete tidspunkter21, hvorved billedbehandlingshastigheden og rekonstruktionsfleksibiliteten forbedres. Desuden kan organelle morfologiske ændringer og rumlige forbindelser med andre organeller undersøges yderligere. Disse aspekter kan kvantificeres, og forandringsmekanismerne kan afsløres mere præcist ved at rekonstruere tilstødende organeller for at vise deres positionelle forhold70,71. Denne teknologi til 3D-rekonstruktion og billeddannelse i seriel sektion ved hjælp af Amira58 afslører sammenhængen mellem sygdomme og organelle ultrastrukturelle ændringer på nanoskala 72, har været meget udbredt inden for medicin, biologi og andre områder og baner vejen for udviklingen af effektive nye lægemidler73,74.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Natural Science Foundation of Zhejiang Province tilskud (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China tilskud (82274364, 81673607 og 81774011); samt det offentlige velfærdsforskningsprojekt fra Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Vi sætter pris på den store hjælp, teknisk support og eksperimentel support fra Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetone | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
| Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
| Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
| Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
| Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
| Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
| Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 |
References
- Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
- Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
- Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
- Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
- Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
- Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
- Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
- Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
- Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
- Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
- Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
- Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L.
- Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
- Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
- Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
- Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
- Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Kittelmann, M.
- Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
- Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
- Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
- Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
- Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
- Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
- Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
- Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
- Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
- Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
- Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
- Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
- Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
- Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
- Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
- Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
- Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
- Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
- Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
- Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
- Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
- Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
- Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
- Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
- Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
- Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
- Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
- Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
- Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A.
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
- Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
- Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
- Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
- Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).
