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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit comment reconstruire des cristae mitochondriales pour obtenir une imagerie 3D avec une grande précision, une haute résolution et un débit élevé.

Abstract

Comprendre les caractéristiques dynamiques de l’ultrastructure de l’organite cellulaire, qui est non seulement riche en informations inconnues, mais aussi sophistiquée d’un point de vue tridimensionnel (3D), est essentiel pour les études mécanistes. La microscopie électronique (EM) offre une bonne profondeur d’imagerie et permet la reconstruction d’empilements d’images à haute résolution pour étudier la morphologie ultrastructurale des organites cellulaires, même à l’échelle nanométrique; par conséquent, la reconstruction 3D gagne en importance en raison de ses avantages incomparables. La microscopie électronique à balayage (MEB) fournit une technologie d’acquisition d’images à haut débit qui permet de reconstruire de grandes structures en 3D à partir de la même région d’intérêt dans des tranches consécutives. Par conséquent, l’application du MEB dans la reconstruction 3D à grande échelle pour restaurer la véritable ultrastructure 3D des organites devient de plus en plus courante. Dans ce protocole, nous suggérons une combinaison de coupes ultraminces en série et de techniques de reconstruction 3D pour étudier les cristae mitochondriales dans les cellules cancéreuses du pancréas. Les détails de la façon dont ces techniques sont exécutées sont décrits dans ce protocole étape par étape, y compris la méthode osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), l’imagerie en série de la section ultramince et l’affichage de visualisation.

Introduction

Les mitochondries sont l’un des organites les plus importants de la cellule. Ils servent de plaque tournante de la bioénergétique cellulaire et du métabolisme 1,2 et jouent un rôle essentiel dans le cancer3. Le cancer du pancréas (CP) est l’un des cancers les plus difficiles àtraiter4 en raison de sa propagation rapide et de son taux de mortalité élevé. Le dysfonctionnement mitochondrial, qui est principalement causé par des changements dans la morphologie mitochondriale 3,5,6,7, a été lié aux mécanismes de la maladie sous-jacents PC8. Les mitochondries sont également très dynamiques, ce qui se reflète dans les changements fréquents et dynamiques de leur connectivité réseau et de leur structurecritique 9. Le remodelage de la structure des cristae peut avoir un impact direct sur la fonction mitochondriale et l’état cellulaire 10,11, qui sont considérablement modifiés au cours de la croissance des cellules tumorales, des métastases et des changements du microenvironnement tumoral 12,13.

Ces dernières années, les scientifiques ont étudié cet organite en utilisant l’observation EM14,15,16,17; par exemple, les chercheurs ont analysé la dynamique mitochondriale à l’aide de techniques de reconstruction 3D 6,7,18,19. Le concept général et la méthode de reconstruction 3D d’images de microscopie électronique ont été formellement établis dès 196820 et impliquaient la combinaison de la microscopie électronique, de la diffraction électronique et du traitement d’images par ordinateur pour reconstruire la queue du phage T4. Jusqu’à présent, la technologie d’imagerie 3D par microscopie électronique a fait des progrès significatifs en termes de résolution d’image21, de degré d’automatisation 22 et de volume de traitement 23 et a été utilisée à une échelle de plus en plus large dans la recherche biologique, du niveau tissulaire à l’ultrastructure des organites à l’échelle nanométrique24. Ces dernières années, l’imagerie 3D par microscopie électronique est également devenue une technologie prometteuse pour un large éventail d’applications25,26,27.

L’attention croissante portée aux cristae mitochondriales illustre particulièrement les exigences essentielles de l’imagerie ultrastructurale du volume. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour visualiser des échantillons prélevés sur une grille de cuivre (400 mesh)28, le faisceau d’électrons traversant la section. Cependant, en raison de la portée limitée de la grille de cuivre, il est impossible d’imager complètement des tranches continues du même échantillon29. Cela complique l’étude des structures cibles lors de l’imagerie TEM. De plus, la GDT repose sur des tâches manuelles longues et sujettes aux erreurs, y compris la découpe et la collecte de plusieurs tranches et leur imagerie séquentielle21, de sorte qu’elle n’est pas adaptée aux reconstructions ultrastructurales d’échantillons de grand volume23. À l’heure actuelle, la reconstruction à haute résolution d’échantillons d’échantillons de grand volume est réalisée grâce à l’utilisation d’équipement spécialisé, comme le réseau de caméras TEM (TEMCA)30 ou deux systèmes TEMCA de deuxième génération (TEMCA2)31, qui permettent d’obtenir rapidement des images automatisées à haut débit. Cependant, ce type d’imagerie n’a pas l’avantage d’être facile à obtenir et universel en raison de la nécessité d’un équipement personnalisé.

Par rapport à la TEM, la méthode de génération automatique de milliers d’images volumétriques série pour de grandes surfaces basée sur SEM32,33 améliore l’efficacité et la fiabilité de l’imagerie série et offre des résolutions z34 plus élevées. Par exemple, la microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBF-SEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) ont toutes deux permis de réaliser la reconstruction 3D de l’ultrastructure avec une vitesse, une efficacité et une résolution élevées35,36. Cependant, il est inévitable que la surface du bloc soit rasée mécaniquement par le couteau diamanté du SBF-SEM ou par fraisage avec le faisceau d’ions focalisé de FIB-SEM33,37. En raison du caractère destructeur des deux méthodes pour les échantillons, il n’est pas possible de reconstruire la même structure cible pour une analyse plus approfondie38,39,40. De plus, peu d’études ont tenté de reconstruire l’ultrastructure 3D des organites des cellules cancéreuses en utilisant EM pour observer des changements pathologiques12. Pour ces raisons, afin d’élucider davantage les mécanismes pathologiques des cellules cancéreuses, telles que les cellules cancéreuses du pancréas, nous proposons une nouvelle technologie pour la reconstruction 3D d’images de coupe en série à l’aide d’un ultramicrotome et d’un microscope électronique à balayage par émission de champ (FE-SEM) pour analyser l’ultrastructure mitochondriale au niveau des crêtes; Grâce à cette technologie, des données haute résolution peuvent être acquises à l’aide d’une méthode efficace et accessible. Les sections ultraminces en série réalisées à l’aide d’un ultramicrotome peuvent être stockées de manière semi-permanente dans un boîtier de grille et réimagées plusieurs fois, même après plusieurs années41. FE-SEM est un outil très apprécié dans divers domaines de recherche en raison de sa capacité à fournir une imagerie haute résolution, un grossissement élevé et une polyvalence42. Dans une tentative d’afficher la structure fine des organites en 3D, la technique de production d’empilements d’images 2D en série avec une résolution utile en utilisant des électrons rétrodiffusés produits par FE-SEM 43,44 peut également être utilisée pour obtenir une imagerie à haut débit et multi-échelle des régions cibles ou de leurs structures associées sans équipement spécial 45. La génération d’artefacts de charge affecte directement la qualité des images acquises, il est donc particulièrement important de garder le temps de séjour court.

Ainsi, la présente étude développe les procédures expérimentales employées dans cette technique SEM pour reconstruire la structure 3D des cristae mitochondriales46. Plus précisément, nous montrons le processus développé pour réaliser la segmentation semi-automatique des régions mitochondriales et numériser la reconstruction 3D à l’aide du logiciel Amira, ce qui implique également de faire des échantillons de tranches en utilisant la méthode conventionnelle de préparation des échantillons OTO44,47, de compléter la collection de sections en utilisant le découpage ultramicrotome et d’acquérir des données 2D séquentielles par FE-SEM.

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Protocol

1. Préparation du matériel

  1. Culture de 2 x 106 cellules Panc02 dans 12 mL de milieu DMEM (10 % de sérum fœtal bovin et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine), et maintenir à 37 °C et 95 % d’humidité dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air pendant 48 h.
  2. Recueillir les cellules Panc02, centrifuger à 28 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Assurez-vous que l’échantillon est d’une taille appropriée (1 x 107 cellules), sinon les étapes de fixation et de déshydratation suivantes ne fonctionneront pas bien.
  3. Ajouter 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % comme fixateur pour fixer les cellules fraîches de Panc02 dans les tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL pendant une nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Les échantillons doivent être centrifugés à 1 006 x g pendant 5 minutes dans chacune des étapes suivantes (étapes 1.3-1.11).
  4. Aspirer le fixateur et rincer les échantillons deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M, puis rincer deux fois à l’eau bidistillée (ddH2O) à température ambiante pendant 10 minutes chacun.
  5. Ajouter 50 μL d’une solution contenant 1 % de tétroxyde d’osmium (OsO4) et 1,5 % de ferrocyanure de potassium dans un rapport de 1:1 à 4 °C pendant 1 h. Ensuite, rincez deux fois avec 0,1 M PBS pendant 10 minutes à chaque fois, et rincez avec ddH2O pendant encore 10 min.
  6. Ajouter 1 mL de thiocarbohydrazide (TCH) à 1 %, incuber à température ambiante pendant 30 min à 1 h, puis rincer avec duddH2Oquatre fois pendant 10 min à chaque fois.
  7. Ajouter 50 μL d’OsO4 à 1%, fixer à température ambiante pendant 1 h, puis rincer avec du ddH2O quatrefois pendant 10 min à chaque fois.
  8. Ajouter 1 mL d’acétate d’uranyle à 2 % à 4 °C pendant une nuit, puis rincer avec duddH2Oquatre fois pendant 10 minutes à chaque fois.
  9. Ajouter 1 mL de solution Walton (0,066 g de nitrate de plomb dissous dans 10 mL de solution mère d’acide aspartique 0,03 mol/L) à 60 °C pour 1 heure supplémentaire d’incubation.
  10. Rincer avec ddH2O quatre fois pendant 10 min à chaque fois, puis déshydrater en série d’alcool gradué pendant 10 minutes à chaque fois: 50% d’alcool, 70% d’alcool, 80% d’alcool et 90% d’alcool 1x et 100% d’alcool 2x. Ensuite, déshydratez deux fois dans de l’acétone à 100% pendant 10 minutes. Utilisez 1 mL de chaque solution pour la déshydratation.
  11. Mélanger 200 μL d’acétone avec de la résine époxy Pon 812 dans un rapport de 3:1, 1:1 et 1:3. Faire tremper l’échantillon dans de la résine à température ambiante pendant 2 h, 4 h et 4 h, respectivement, puis prélever la résine époxy 100% Pon 812 pour imprégner pendant la nuit.
    REMARQUE: Lors de l’exécution des étapes de coloration et d’incorporation de résine, il est important de fonctionner dans une hotte car ce sont des substances toxiques. De plus, des blouses de laboratoire et des gants résistants aux solvants doivent être portés pendant l’expérience.
  12. Mettre les échantillons dans un moule d’encastrement, puis les placer dans une étuve à 60 °C pendant 48 h pour polymériser. Utilisez un enrobage plat29 pour réduire l’apparence de la résine autour de l’échantillon. Cela simplifie l’installation du spécimen et diminue l’impact des artefacts de charge sur la segmentation ultérieure de l’image.
    REMARQUE: Pour générer par la suite une surface de coupe horizontale, une petite quantité de résine peut être ajoutée dans le trou du moule, en prenant soin de ne pas trop le remplir.
  13. Préparer les plaquettes de silicium en les lavant d’abord puis en les hydrophilisant avec une solution concentrée deH2SO4/H2O2pendant 30 min. Recueillir en série des bandes de tranches d’une épaisseur de 70 nm sur les plaquettes de silicium hydrophilisé à l’aide d’un ultramicrotome et les sécher dans un four à 60 °C pendant 10 min.
    REMARQUE: Capturez lentement la tranche pendant que la tranche flotte à la surface des plaquettes pour éviter la perte ou la déformation de la tranche.

2. Acquisition d’images et reconstruction tridimensionnelle

  1. Avant de monter une plaquette de silicium sur la scène, lavez les sections avec de l’eau distillée trois fois et séchez-les à l’air. Découpez un ruban de carbone conducteur d’une taille de 1 cm x 0,5 cm et collez-le entre la plaquette de silicium et l’étage de l’échantillon MEB pour compléter la configuration de l’échantillon (Figure 2E).
  2. Réglez le paramètre de tension d’accélération FE-SEM sur 2 kV avec une distance de travail de 4 mm (Figure 3B et Tableau 1).
    REMARQUE: Afin d’améliorer le rapport signal sur bruit et de réduire le bruit dans l’image, observez à faible grossissement chaque fois que possible. Au fur et à mesure que le multiple augmente, la portée de balayage du MEB diminue, ce qui entraîne une augmentation de l’accumulation de charge sur les images.
  3. Cliquez sur l’icône H/L dans la barre de menu supérieure. Tout d’abord, à faible grossissement, orientez la première section des bandes de découpe cibles, puis cliquez à nouveau sur l’option H/L (Figure 3A) pour passer en mode de grossissement élevé ; Collectez une image appropriée pour la structure d’intérêt en ajustant la luminosité, le contraste et l’agrandissement de l’image.
  4. Sélectionnez Project View > Open Data et importez les fichiers image à analyser dans le logiciel.
  5. Alignez les images en cliquant sur Aligner les tranches > Modifier (Figure 4B) et ajustez la valeur Plage d’intensité dans la barre de menu inférieure gauche en modifiant la transparence de l’image. Ici, utilisez une stratégie d’alignement semi-automatique; Plus précisément, grâce à l’alignement automatique, faites en sorte que les images se chevauchent avec une image précédente, puis effectuez un réglage manuel fin.
    REMARQUE: Dans ce travail, pendant le processus d’alignement, l’image précédente a été utilisée comme référence, et les opérations de déplacement et de rotation ont été utilisées pour chevaucher au maximum la structure cible des deux images. Cliquer sur Aligner la paire de tranches actuelle peut aider à aligner les images automatiquement, mais un mauvais placement peut se produire.
  6. Sélectionnez le module Extraire le sous-volume et découpez les ensembles de données alignés pour les adapter à la taille de la partie qui se chevauche de l’ensemble de la pile.
  7. Sous la sous-section Segmentation (Figure 4C), sélectionnez Rééchantillonner > segmentation > Enregistrer. Choisissez le seuil de la baguette magique et la taille de l’outil Pinceau pour sélectionner la plage appropriée. Là encore, adoptez une méthode de segmentation semi-automatique en utilisant d’abord la baguette magique pour sélectionner automatiquement une grande surface appropriée, puis utilisez le pinceau pour décrire avec précision les détails.
    REMARQUE: La baguette magique peut être appliquée pour segmenter les images en fonction des différences évidentes d’intensité en pixels existant entre la structure d’intérêt et les structures environnantes en modifiant la valeur de masquage et en utilisant la ligne limite de dessin. Il est incapable de distinguer les artefacts de charge générés lors de l’acquisition d’images. Par conséquent, cela peut entraîner une segmentation incorrecte pour les régions cibles. L’outil Pinceau peut être utilisé pour segmenter manuellement afin de reconstruire avec précision les structures biologiques.
  8. Sous Segmentation > Selection, cliquez sur l’icône + pour ajouter la zone sélectionnée (Figure 4C).
  9. Répétez l’étape ci-dessus (2.8) pour sélectionner la même structure cible dans différentes images jusqu’à ce que la sélection soit terminée pour reconstruire les microstructures d’intérêt.
    REMARQUE: Pendant les processus de remodelage mitochondrial, la sélection de l’objet cible doit être effectuée à partir de l’image au milieu d’un groupe d’images séquentielles. Si la zone requise est sélectionnée à partir de la première ou de la dernière image, le résultat de la reconstruction ne pourra pas présenter une visualisation 3D complète.
  10. Une fois la segmentation régionale terminée, générez le fichier image en fonction des meilleurs résultats pour la taille de l’objet et la résolution de l’image. Cliquez sur Crop Editor (Éditeur de recadrage), puis entrez le chiffre 6 dans la zone Virtual Slider (Figure 4C).
  11. Dans le menu déroulant de gauche, cliquez avec le bouton droit sur la zone grise sous la sous-section Projet , puis sélectionnez Générer une surface > Créer > Appliquer. Dans le fichier généré, utilisez le module Surface View pour créer la structure de surface et la représentation 3D.

3. Quantification

  1. Cliquez sur Remove Small Spots > Apply (Supprimer les petites taches ) (Figure 4D). Dans la sous-section Projet , cliquez avec le bouton droit sur la zone grise, puis sélectionnez Analyse d’étiquette > Appliquer (Figure 4D).
  2. Personnalisez le nom de la colonne et choisissez un groupe de mesures. Sélectionnez Volume3d et Longueur3d dans la zone Mesures natives.
  3. Cliquez sur le bouton Appliquer dans le coin inférieur gauche de l’écran. Copiez les données et le graphique dans le logiciel statistique, tel que GraphPad.

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Representative Results

Au cours de la culture cellulaire (Figure 1A), nous avons d’abord divisé les cellules cancéreuses du pancréas en un groupe témoin cultivé avec un milieu de culture complet, un groupe (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activateur de la ferroptose, 100 nM) et un groupe RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, un inhibiteur de la ferroptose, 100 nM). Grâce aux étapes expérimentales ci-dessus, le microscope électronique à balayage a acquis 38 (figure supplémentaire 1), 43 (figure supplémentaire 2) et 44 (figure supplémentaire 3) images séquentielles pour le groupe témoin, le groupe RSL3 et le groupe inhibiteur (groupe RSL3 + Fer-1), respectivement. Les images de 1 280 x 960 pixels ont été capturées à un grossissement de 8 000 fois (avec une résolution de 12,40 nm/pixel). Les rides et la pollution dans la zone cellulaire n’ont pas été observées au-dessus des sections. Les images au microscope électronique ont pu distinguer clairement les organites, tels que les mitochondries et le réticulum endoplasmique, dans les cellules (Figure 1E).

L’observation des images 2D par FE-SEM a montré que, dans le groupe témoin de cellules cancéreuses (Figure 5A), les mitochondries étaient réparties dans tout le cytoplasme, et la plupart d’entre elles étaient sphériques ou ovales et uniformément dodues. De plus, l’architecture relativement régulière et allongée des cristae était clairement visible. Inversement, dans le groupe RSL3 (Figure 5D), la majorité des mitochondries présentaient une morphologie rétrécie, une augmentation de la densité membranaire et une structure cristae relativement vague. Un examen plus approfondi des images MEB (Figure 5E) a révélé que toutes les cristae mitochondriales n’ont pas dégénéré ou disparu, car un nombre relativement faible de cristae est resté intact. Par rapport au groupe RSL3, dans le groupe inhibiteur, la plupart des mitochondries ont maintenu la structure intégrale des cristae mitochondriales, et seule une minorité des structures des cristae mitochondriales n’étaient pas apparentes (Figure 5G).

Bien que les informations 2D montrent des différences dans la morphologie mitochondriale, elles peuvent parfois entraîner une compréhension biaisée de la structure 3D détaillée et réelle50,51. Les structures cristae du groupe témoin dans les conditions 3D (Figure 5C) étaient cohérentes avec les images 2D, mais elles étaient différentes pour le groupe RSL3. Pour ce groupe, la présence de cristae mitochondriales complètes a également pu être observée dans les images 2D (Figure 5E), mais les mitochondries sous 3D (Figure 5F) étaient irrégulières et généralement vacuolisées au milieu. Le groupe inhibiteur (Figure 5I) a montré diverses formes de cristae, avec seulement quelques cristae mitochondriales présentant un collapsus localisé. Ainsi, à partir des résultats du groupe RSL3, on peut voir que seule l’utilisation de l’analyse 2D peut conduire à une compréhension unilatérale des résultats. Les résultats des images 2D sont biaisés par rapport aux résultats présentés lors de l’empilement d’un ensemble d’images pour l’affichage 3D, il n’est donc pas possible de généraliser les résultats produits uniquement par des informations 2D. Pour démontrer plus objectivement les effets de RSL3 sur les mitochondries, des données de reconstruction 3D ont été utilisées pour quantifier et mesurer les altérations mitochondriales52. Par rapport au groupe témoin, la longueur et le volume des mitochondries 3D dans le groupe RSL3 ont été significativement diminués, mais les résultats de quantification du groupe inhibiteur se situaient entre les résultats des deux autres groupes (Figure 5J, K). Ces données quantitatives suggèrent que RSL3 produit des mitochondries plus petites et dégradées, et l’ajout d’inhibiteurs réduit cet effet.

Comme le montrent les figures 6B et 6C, il a été déterminé que l’inducteur de ferroptose RSL3 provoquait un dysfonctionnement mitochondrial et affectait le métabolisme cellulaire en modifiant la morphologie mitochondriale 53,54 et en provoquant la ferroptose, qui peut représenter une forme omniprésente de mort cellulaire dynamique dans le traitement du cancer induite parRSL3 55.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail général pour la reconstruction 3D des mitochondries des cellules cancéreuses du pancréas. Un flux de travail général pour les expériences de reconstruction 3D décrites dans ce protocole est démontré. (A) Culture de cellules cancéreuses du pancréas. B) Préparation du bloc de résine. (C) Collecte de sections en série à l’aide d’un ultramicrotome. D) Acquisition d’images 2D à l’aide d’un microscope électronique à balayage par émission de champ. (E) Positionnement des mitochondries ciblées dans les images SEM séquentielles. (F) Analyse des mitochondries en 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Dispositif de montage de tranches continues sur une tranche de silicium hydrophilisée. (A) Un manipulateur d’angle réglable avec pinces pour tenir la plaquette. (B) Cadre du support de plaquette placé à côté de l’ultramicrotome. (C) Positionnement de la plaquette de silicium dans la fente bleue contenant le couteau diamanté. (D) Un gros plan montrant la relation de position entre la plaquette de silicium et la lame du couteau diamanté. (E) Une plaquette de silicium avec des bandes de tranches fixées à l’étage d’échantillonnage du MEB avec de la colle de carbone conductrice. (F) Un gros plan montrant l’aperçu général des bandes de tranches de série. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Le processus de réglage des paramètres et d’acquisition des images. (A) La barre de menu du FE-SEM (la flèche pointe vers l’option H/L). (B) Tableau des paramètres et conditions d’imagerie. (C) Vue d’ensemble des images 2D consécutives en trois groupes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Un guide étape par étape pour visualiser les mitochondries en 3D à l’aide d’Amira. (A) Importation d’images à partir d’un dossier spécifique. (B) Alignement des piles d’images en fonction de la structure cible. (C) Segmentation et ajout de la région d’intérêt. (D) Reconstruire la structure 3D et ajouter les données de quantification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: La morphologie 2D et 3D des mitochondries dans chaque groupe. La morphologie des cellules cancéreuses 2D du groupe témoin à (A) un grossissement de 8 000 fois et (B) un grossissement de 15 000 fois. (C) Une représentation 3D de la morphologie mitochondriale du groupe témoin. La morphologie des cellules cancéreuses 2D du groupe RSL3 à (D) un grossissement de 8 000 fois et (E) un grossissement de 15 000 fois. (F) Une représentation 3D de la morphologie mitochondriale du groupe RSL3. La morphologie des cellules cancéreuses 2D du groupe RSL3 + Fer-1 (inhibiteur) à (G) un grossissement de 8 000 fois et (H) un grossissement de 15 000 fois. (I) Une représentation 3D de la morphologie mitochondriale du groupe RSL3 + Fer-1 (inhibiteur). Les données quantitatives pour la longueur (J) et le volume moyen (K) des mitochondries dans chaque groupe. Les différences significatives sont indiquées par des astérisques et ont été calculées à l’aide du test t de Student (vs groupe témoin, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001.) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Différences dans la morphologie mitochondriale des cellules cancéreuses aux niveaux 2D et 3D. (A) La morphologie des cellules cancéreuses 2D du groupe RSL3 à un grossissement de 8 000 fois. (B) La morphologie mitochondriale 2D à un grossissement plus élevé. (C) Une représentation 3D de mitochondries spécifiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Paramètres d’imagerie Conditions
DataSize 1280 × 960
Taille de pixel 12.40234
AccélérationTension 2000 volts
Distance de travail 3700μm
Courant d’émission 13700 nA
Courant de faisceau 10μA
Ouverture limite de courant Grille n° 2 de FE-SEM
Temps de séjour 32 μs/px
Nombre de cellules 107
Volumes imagés 10×8×2,66 μm, 212,8 μm³
10×8×3,01 μm, 240,8 μm³
10×8×3,08 μm, 246,4 μm³

Tableau 1 : Résumé des conditions d’enregistrement et des paramètres de l’ensemble de données pour l’acquisition de l’image.

Figure supplémentaire 1 : Vue d’ensemble des images de 38 microsections de cellules cancéreuses du groupe témoin. Le numéro d’image de chaque microsection est disposé de haut en bas. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Vue d’ensemble des images de 43 microsections de cellules cancéreuses du groupe RSL3. Le numéro d’image de chaque microsection est disposé de haut en bas. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Ovue d’images de 44 microsections de cellules cancéreuses du groupe RSL3 + Fer-1 (inhibiteur). Le numéro d’image de chaque microsection est disposé de haut en bas. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La méthode présentée ici est un guide étape par étape utile pour appliquer la technique de reconstruction 3D, qui implique l’application de la microscopie électronique et de la technologie de traitement d’images à l’empilement et à la segmentation d’images tomographiques 2D générées à partir de sections ultraminces en série. Ce protocole met en évidence une limitation des images 2D qui peut être abordée par la visualisation 3D de l’ultrastructure de l’organite, qui présente les avantages d’une forte reproductibilité des structures à un niveau de haute résolution et d’une plus grande précision. Plus important encore, cette visualisation 3D peut être appliquée aux cellules tumorales pour rendre l’étude des mécanismes pathologiques plus simple et fiable. Cette technique a été examinée dans ce travail pour visualiser les structures stéréoscopiques des cristae mitochondriales en comparant trois ensembles de coupes en série dans des conditions différentes, validant ainsi la dégradation de la membrane des cristae mitochondriales induite par RSL3 qui se produit dans les cellules cancéreuses56. Ces résultats donnent un aperçu du mécanisme d’action de RSL3 en tant que médicament anticancéreux du pancréas.

L’acquisition d’images 2D haute résolution joue un rôle important dans le processus de reconstruction 3D57 des cristae mitochondriales, et la qualité de l’image affecte directement les résultats de reconstruction 22,58. Par conséquent, cette méthode présente également certaines limitations, telles que les artefacts de charge générés dans les images SEM59, qui, à leur tour, peuvent entraîner une segmentation incorrecte des structures cibles. Ce problème peut être résolu en raccourcissant le temps de balayage des tranches, en équipant le MEB d’un compensateur de charge focale34,60 et en utilisant la méthode OTO, pour laquelle l’utilisation de TCH peut rendre l’échantillon plus conducteur pour les électrons en le colorant avec des métaux supplémentaires 61. S’appuyer sur la segmentation automatique des images a tendance à être inexact en termes de détermination de la portée de la structure, tandis que la segmentation manuelle prend du temps58. Par conséquent, sur la base de l’avantage de numérisation rapide du MEB pour réaliser la collecte d’images62, la segmentation semi-automatisée du logiciel Amira peut être utilisée pour permettre une imagerie et une reconstruction efficaces; l’utilisation du logiciel Amira peut également rendre le résultat plus précis que l’utilisation de FIJI et du MIB63. L’étape clé de l’imagerie 3D est l’acquisition de sections ultraminces. Des problèmes tels que l’omission, la fracture et la distorsion, qui affectent la continuité de l’image, se produisent souvent lors de la collecte de sections. Afin de résoudre des problèmes tels que la perte et la casse de tranches, nous avons utilisé des plaquettes de silicium hydrophilisé comme support pour la collecte des bandes de tranches.

Bien que SBF-SEM et FIB-SEM puissent réduire la déformation ou les défauts des sections, ces techniques ont une vitesse d’imagerie lente, nécessitent des instruments coûteux et sont incapables de réimager la structure d’intérêt64,65,66. FIB-SEM manque de stabilité du système pendant l’imagerie, tandis que SBF-SEM est entravé par des étapes compliquées de préparation des échantillons et un flux de travail fastidieux34. Récemment, l’imagerie microscopique à déplétion par émission stimulée (STED) a été progressivement appliquée à l’étude de la structure mitochondriale. Cette méthode surveille les images 3D en temps réel des cristae mitochondriales dans les cellules vivantes grâce à la construction de sondes pour le marquage mitochondrial67. Le marquage par colorant fluorescent peut révéler les processus de changement dans les critiques au cours de la fusion mitochondriale et de la fission68. Cependant, les cellules vivantes ont une tolérance limitée à la lumière intense, il est donc difficile d’utiliser cette technique dans l’imagerie STED à long terme68. De plus, STED est limité par sa résolution, sa profondeur d’image et son nombre de pixels69.

Par rapport à d’autres techniques, l’utilisation de sections ultraminces continues combinées à la technologie de reconstruction 3D pour observer l’ultrastructure des organites à partir d’un large champ de vision permet non seulement d’obtenir une imagerie à haut débit dans un court laps de temps, mais également d’examiner des images haute résolution de structures cibles à des moments discrets21, améliorant ainsi le taux d’imagerie et la flexibilité de reconstruction. De plus, les changements morphologiques des organites et les connexions spatiales avec d’autres organites peuvent être examinés plus avant. Ces aspects peuvent être quantifiés, et les mécanismes de changement peuvent être révélés plus précisément en reconstruisant des organites adjacents pour afficher leurs relations de position70,71. Cette technologie de reconstruction 3D et d’imagerie en coupe série à l’aide d’Amira58 révèle la corrélation entre les maladies et les changements ultrastructuraux des organites à l’échelle nanométrique 72, a été largement utilisée en médecine, en biologie et dans d’autres domaines, et ouvre la voie au développement de nouvelles thérapies efficaces73,74.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82274364, 81673607 et 81774011); ainsi que le projet de recherche sur le bien-être public de la subvention scientifique et technologique de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Nous apprécions l’aide, le soutien technique et le soutien expérimental de la plate-forme publique du Centre de recherche médicale, de l’Académie des sciences médicales chinoises, de l’Université médicale chinoise du Zhejiang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

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Cancer Research numéro 196 Cellules cancéreuses du pancréas mitochondries ultrastructure reconstruction 3D microscopie électronique à balayage (MEB) préparation d’échantillons OTO
Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas
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Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong,… More

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

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