Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تقنية ثلاثية الأبعاد لتصور التغيرات الهيكلية للميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إعادة بناء cristae الميتوكوندريا لتحقيق التصوير 3D بدقة عالية ودقة عالية وإنتاجية عالية.

Abstract

إن فهم السمات الديناميكية للبنية الفائقة لعضية الخلية ، والتي ليست غنية بالمعلومات غير المعروفة فحسب ، بل متطورة أيضا من منظور ثلاثي الأبعاد (3D) ، أمر بالغ الأهمية للدراسات الميكانيكية. يوفر المجهر الإلكتروني (EM) عمق تصوير جيد ويسمح بإعادة بناء مكدسات الصور عالية الدقة للتحقيق في التشكل الفائق للعضيات الخلوية حتى على مقياس النانومتر. لذلك ، تكتسب إعادة الإعمار 3D أهمية بسبب مزاياها التي لا تضاهى. يوفر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) تقنية الحصول على الصور عالية الإنتاجية التي تسمح بإعادة بناء الهياكل الكبيرة في 3D من نفس المنطقة ذات الاهتمام في شرائح متتالية. لذلك ، أصبح تطبيق SEM في إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع لاستعادة البنية التحتية ثلاثية الأبعاد الحقيقية للعضيات شائعا بشكل متزايد. في هذا البروتوكول ، نقترح مزيجا من المقطع التسلسلي فائق النحافة وتقنيات إعادة البناء 3D لدراسة cristae الميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس. يتم وصف تفاصيل كيفية تنفيذ هذه التقنيات في هذا البروتوكول بطريقة خطوة بخطوة ، بما في ذلك طريقة الأوزميوم - ثيوكربوهيدرازيد - الأوزميوم (OTO) ، والتصوير التسلسلي للمقطع فائق النحافة ، وعرض التصور.

Introduction

الميتوكوندريا هي واحدة من أهم العضيات في الخلية. إنها بمثابة المحور المركزي للطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 1,2 وتلعب دورا مهما في السرطان3. سرطان البنكرياس (PC) هو واحد من أصعب أنواع السرطان4 لعلاج بسبب انتشاره السريع وارتفاع معدل الوفيات. تم ربط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والذي يحدث بشكل رئيسي بسبب التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا3،5،6،7 ، بآليات المرض الكامنة وراء PC8. الميتوكوندريا هي أيضا ديناميكية للغاية ، وهو ما ينعكس في التغييرات المتكررة والديناميكية في اتصال الشبكة وهيكل cristae9. يمكن أن تؤثر إعادة تشكيل بنية cristae بشكل مباشر على وظيفة الميتوكوندريا والحالة الخلوية 10,11 ، والتي تتغير بشكل كبير أثناء نمو الخلايا السرطانية ، ورم خبيث ، وتغيرات البيئة الدقيقة للورم 12,13.

في السنوات الأخيرة ، درس العلماء هذه العضية باستخدام مراقبة EM14،15،16،17 ؛ على سبيل المثال ، قام الباحثون بتحليل ديناميكيات الميتوكوندريا باستخدام تقنيات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد6،7،18،19. تم تأسيس المفهوم العام وطريقة إعادة بناء 3D لصور المجهر الإلكتروني رسميا في وقت مبكر من 196820 وتضمنت الجمع بين المجهر الإلكتروني وحيود الإلكترون ومعالجة صور الكمبيوتر لإعادة بناء ذيل العاثية T4. حتى الآن ، حققت تقنية التصوير المجهري الإلكتروني 3D تقدما كبيرا من حيث دقة الصورة 21 ، ودرجة الأتمتة22 ، وحجم المعالجة23 ، وقد تم استخدامها على نطاق واسع بشكل متزايد في البحوث البيولوجية ، من مستوى الأنسجة إلى مستوى البنية التحتية للعضيات على مقياسنانومتر 24. في السنوات الأخيرة ، أصبح التصوير المجهري الإلكتروني 3D أيضا تقنية واعدة لمجموعة واسعة من التطبيقات25،26،27.

يوضح الاهتمام المتزايد بكريستا الميتوكوندريا بشكل خاص المتطلبات الأساسية لتصوير حجم البنية الفائقة. تم استخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتصور العينات التي تم جمعها على شبكة نحاسية (400 شبكة)28 ، مع مرور حزمة الإلكترون عبر القسم. ومع ذلك ، نظرا للنطاق المحدود للشبكة النحاسية ، من المستحيل تصوير شرائح مستمرة من نفس العينة29 بشكل كامل. هذا يعقد دراسة الهياكل المستهدفة أثناء التصوير TEM. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد TEM على المهام اليدوية المستهلكة للوقت والمعرضة للخطأ ، بما في ذلك قص وجمع شرائح متعددة وتصويرها بالتتابع21 ، لذلك لا يتم تكييفه لإعادة بناء البنية التحتية للعينات كبيرةالحجم 23. في الوقت الحاضر ، يتم تحقيق إعادة بناء عالية الدقة لتصوير العينات كبيرة الحجم من خلال استخدام معدات متخصصة ، مثل صفيف كاميرا TEM (TEMCA) 30 أو نظامين من الجيل الثاني من TEMCA (TEMCA2) 31 ، مما يتيح التصوير الآلي عالي الإنتاجية في وقت قصير. ومع ذلك ، لا يتمتع هذا النوع من التصوير بسهولة الحصول عليه وعالمي بسبب متطلبات المعدات المخصصة.

بالمقارنة مع TEM ، فإن طريقة إنشاء الآلاف من الصور الحجمية التسلسلية تلقائيا لمناطق كبيرة استنادا إلى SEM 32,33 تعزز كفاءة وموثوقية التصوير التسلسلي وتوفر دقة z أعلى34. على سبيل المثال ، أتاح كل من المجهر الإلكتروني الماسح التسلسلي للوجه (SBF-SEM) والمجهر الإلكتروني الماسح الأيوني المركز (FIB-SEM) تحقيق إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبنية التحتية بسرعة عالية وكفاءة ودقة35,36. ومع ذلك ، فمن المحتم أن يتم حلق سطح الكتلة ميكانيكيا بواسطة سكين الماس في SBF-SEM أو عن طريق الطحن باستخدام الحزمة الأيونية المركزة ل FIB-SEM33,37. نظرا لتدمير الطريقتين للعينات ، لا يمكن إعادة بناء نفس الهيكل المستهدف مرة أخرى لمزيد من التحليل38،39،40. بالإضافة إلى ذلك ، حاولت دراسات قليلة إعادة بناء البنية التحتية للعضيات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية باستخدام EM لمراقبة التغيرات المرضية12. لهذه الأسباب ، من أجل زيادة توضيح الآليات المرضية للخلايا السرطانية ، مثل خلايا سرطان البنكرياس ، نقترح تقنية جديدة لإعادة بناء 3D لصور المقطع التسلسلي باستخدام المجهر الفائق والمجهر الإلكتروني الماسح للانبعاثات الميدانية (FE-SEM) لتحليل البنية التحتية للميتوكوندريا على مستوى cristae ؛ باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على بيانات عالية الدقة باستخدام طريقة فعالة ويمكن الوصول إليها. يمكن تخزين المقاطع التسلسلية فائقة النحافة المصنوعة باستخدام ultramicrotome بشكل شبه دائم في علبة شبكية وإعادة تصويرها عدة مرات ، حتى بعد عدة سنوات41. تحظى FE-SEM بتقدير كبير كأداة في مختلف المجالات البحثية نظرا لقدرتها على توفير تصوير عالي الدقة وتكبير عالي وتعدد الاستخدامات42. في محاولة لعرض البنية الدقيقة للعضيات في 3D ، يمكن أيضا استخدام تقنية إنتاج مكدسات صور 2D التسلسلية بدقة مفيدة باستخدام الإلكترونات المبعثرة الخلفية التي تنتجها FE-SEM 43,44 لتحقيق تصوير عالي الإنتاجية ومتعدد المقاييس للمناطق المستهدفة أو الهياكل المرتبطة بها بدون معدات خاصة 45. يؤثر إنشاء القطع الأثرية المشحونة بشكل مباشر على جودة الصور التي تم الحصول عليها ، لذلك من المهم بشكل خاص الحفاظ على وقت المكوث قصيرا.

وهكذا ، توضح الدراسة الحالية الإجراءات التجريبية المستخدمة في تقنية SEM هذه لإعادة بناء بنية 3D لكريستي الميتوكوندريا46. على وجه التحديد ، نعرض العملية التي تم تطويرها لتحقيق التجزئة شبه التلقائية لمناطق الميتوكوندريا ورقمنة إعادة الإعمار 3D باستخدام برنامج Amira ، والذي يتضمن أيضا عمل عينات شرائح باستخدام طريقة تحضير عينة OTO التقليدية44,47 ، واستكمال مجموعة الأقسام باستخدام تشريح ultramicrotome ، والحصول على بيانات 2D متسلسلة بواسطة FE-SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المواد

  1. مزرعة 2 × 106 خلايا Panc02 في 12 مل من وسط DMEM (10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين) ، والحفاظ على 37 درجة مئوية ورطوبة 95٪ في جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء لمدة 48 ساعة.
  2. جمع خلايا Panc02 ، وأجهزة الطرد المركزي في 28 × غرام لمدة 2 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية. تأكد من أن العينة ذات حجم مناسب (1 × 107 خلايا) ، وإلا فإن خطوات التثبيت والجفاف التالية لن تعمل بشكل جيد.
  3. أضف 1 مل من 2.5٪ جلوتارالدهيد كمثبت لإصلاح خلايا Panc02 الطازجة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب طرد العينات بالطرد المركزي عند 1006 × جم لمدة 5 دقائق في كل خطوة من الخطوات التالية (الخطوات 1.3-1.11).
  4. قم بشفط المثبت ، واشطف العينات مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.1 متر (PBS) ، ثم اشطفه مرتين بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  5. أضف 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم (OsO 4) و 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم بنسبة 1: 1 عند4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ، شطف مرتين مع 0.1 M PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة ، وشطف مع ddH2O لمدة 10 دقائق أخرى.
  6. أضف 1 مل من 1٪ ثيوكاربوهيدرازيد (TCH) ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ، ثم اشطف ب ddH2O أربع مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.
  7. أضف 50 ميكرولتر من 1٪ OsO4 ، وثبته في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، ثم اشطفه ب ddH2O أربع مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.
  8. أضف 1 مل من أسيتات اليورانيل 2٪ عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، ثم اشطفها ب ddH2O أربع مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.
  9. أضف 1 مل من محلول والتون (0.066 جم من نترات الرصاص المذابة في 10 مل من 0.03 مول / لتر من محلول مخزون حمض الأسبارتيك) عند 60 درجة مئوية للحصول على 1 ساعة إضافية من الحضانة.
  10. شطف مع ddH2O أربع مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة ، ثم يجفف في سلسلة الكحول متدرج لمدة 10 دقائق في كل مرة: 50 ٪ الكحول ، 70 ٪ الكحول ، 80 ٪ الكحول ، و 90 ٪ الكحول 1x ، و 100 ٪ الكحول 2x. ثم جفف في الأسيتون بنسبة 100٪ مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة. استخدم 1 مل من كل محلول للجفاف.
  11. امزج 200 ميكرولتر من الأسيتون مع راتنجات الإيبوكسي Pon 812 بنسبة 3: 1 و 1: 1 و 1: 3. انقع العينة في الراتنج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة و 4 ساعات و 4 ساعات على التوالي ، ثم خذ راتنجات الايبوكسي Pon 812 بنسبة 100٪ للتلقيح طوال الليل.
    ملاحظة: عند تنفيذ خطوات التلوين وتضمين الراتنج ، من المهم العمل في غطاء دخان لأن هذه مواد سامة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ارتداء معاطف المختبر والقفازات المقاومة للمذيبات أثناء التجربة.
  12. ضع العينات في قالب تضمين ، ثم ضعها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة للبلمرة. استخدم التضمين المسطح29 لتقليل ظهور الراتنج حول العينة. هذا يبسط تركيب العينة ويقلل من تأثير شحن القطع الأثرية على تجزئة الصورة اللاحقة.
    ملاحظة: لتوليد سطح قطع أفقي لاحقا ، يمكن إضافة كمية صغيرة من الراتنج إلى فتحة القالب ، مع الحرص على عدم ملئها بشكل زائد.
  13. قم بإعداد رقائق السيليكون عن طريق غسلها أولا ثم تجفيفها بالماء بمحلول H 2 SO4 /H2O2 المركز لمدة 30 دقيقة. اجمع شرائح شرائح متسلسلة بسمك 70 نانومتر على رقائق السيليكون المجففة بالماء باستخدام ميكروتوم فائق ، وجففها في فرن 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: التقط الشريحة ببطء بينما تطفو الشريحة على سطح الرقائق لمنع فقدان الشريحة أو تشوهها.

2. الحصول على الصور وإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد

  1. قبل تركيب رقاقة السيليكون على المسرح ، اغسل الأقسام بالماء المقطر ثلاث مرات ، وجففها في الهواء. اقطع شريطا كربونيا موصلا بحجم 1 سم × 0.5 سم ، وألصقه بين رقاقة السيليكون ومرحلة عينة SEM لإكمال إعداد العينة (الشكل 2E).
  2. اضبط معلمة الجهد المتسارع FE-SEM على 2 كيلو فولت بمسافة عمل 4 مم (الشكل 3 ب والجدول 1).
    ملاحظة: لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل التشويش في الصورة، راقب عند التكبير المنخفض كلما أمكن ذلك. مع زيادة المضاعف ، ينخفض نطاق المسح الضوئي ل SEM ، مما يؤدي إلى زيادة تراكم الشحن على الصور.
  3. انقر على أيقونة H / L في شريط القائمة العلوي. أولا ، عند التكبير المنخفض ، قم بتوجيه القسم الأول من شرائط الشريحة المستهدفة ، ثم انقر مرة أخرى على خيار H / L (الشكل 3A) للتبديل إلى وضع التكبير العالي ؛ اجمع صورة مناسبة لهيكل الاهتمام عن طريق ضبط سطوع الصورة وتباينها وتكبيرها.
  4. حدد عرض المشروع > البيانات المفتوحة، واستورد ملفات الصور لتحليلها إلى البرنامج.
  5. قم بمحاذاة الصور بالنقر فوق محاذاة الشرائح > تحرير (الشكل 4 ب) ، واضبط قيمة نطاق الكثافة في شريط القائمة السفلي الأيسر عن طريق تعديل شفافية الصورة. هنا ، استخدم استراتيجية محاذاة شبه تلقائية ؛ على وجه التحديد ، من خلال المحاذاة التلقائية ، اجعل الصور تتداخل مع صورة سابقة ، ثم قم بإجراء الضبط اليدوي.
    ملاحظة: في هذا العمل ، أثناء عملية المحاذاة ، تم استخدام الصورة السابقة كمرجع، وتم استخدام عمليات النقل والتدوير لتداخل أقصى قدر من الهيكل المستهدف للصورتين. يمكن أن يساعد النقر فوق محاذاة زوج الشرائح الحالي في محاذاة الصور تلقائيا ، ولكن قد يحدث في غير موضعها.
  6. حدد الوحدة النمطية Extract Subvolume، وقم بقص مجموعات البيانات المحاذية لتلائم حجم الجزء المتداخل من المكدس بأكمله.
  7. ضمن القسم الفرعي التجزئة (الشكل 4C) ، حدد إعادة العينة > تجزئة > حفظ. اختر عتبة العصا السحرية وحجم أداة الفرشاة لتحديد النطاق الصحيح. هنا مرة أخرى ، اعتمد طريقة تجزئة شبه تلقائية باستخدام العصا السحرية أولا لتحديد مساحة كبيرة مناسبة تلقائيا ، ثم استخدم الفرشاة لوصف التفاصيل بدقة.
    ملاحظة: يمكن تطبيق العصا السحرية على الصور المقطعة بناء على الاختلافات الواضحة في كثافة البكسل الموجودة بين بنية الاهتمام والهياكل المحيطة عن طريق تغيير قيمة الإخفاء واستخدام خط حد الرسم. إنه غير قادر على تمييز القطع الأثرية المشحونة التي تم إنشاؤها أثناء التقاط الصور. لذلك ، قد يؤدي إلى تجزئة غير صحيحة للمناطق المستهدفة. يمكن استخدام أداة الفرشاة للتقسيم يدويا لإعادة بناء الهياكل البيولوجية بدقة.
  8. ضمن تجزئة > التحديد ، انقر فوق الرمز + لإضافة المنطقة المحددة (الشكل 4C).
  9. كرر الخطوة أعلاه (2.8) لتحديد نفس البنية المستهدفة في صور مختلفة حتى يكتمل التحديد لإعادة بناء البنى المجهرية ذات الأهمية.
    ملاحظة: أثناء عمليات إعادة تشكيل الميتوكوندريا ، يجب إجراء اختيار الكائن المستهدف من الصورة في منتصف مجموعة من الصور المتسلسلة. إذا تم تحديد المنطقة المطلوبة من الصورة الأولى أو الأخيرة ، فلن تتمكن نتيجة إعادة الإعمار من تقديم تصور 3D كامل.
  10. بعد الانتهاء من التجزئة الإقليمية ، قم بإنشاء ملف الصورة وفقا لأفضل النتائج لحجم الكائن ودقة الصورة. انقر فوق محرر المحاصيل ، ثم أدخل الرقم 6 في مربع التمرير الافتراضي (الشكل 4C).
  11. في القائمة المنسدلة على اليسار ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق المنطقة الرمادية ضمن القسم الفرعي Project ، وحدد إنشاء Surface > إنشاء > تطبيق. في الملف الذي تم إنشاؤه، استخدم وحدة Surface View لإنشاء بنية السطح وتمثيل 3D.

3. القياس الكمي

  1. انقر فوق إزالة البقع الصغيرة > تطبيق (الشكل 4D). ضمن القسم الفرعي المشروع ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق المنطقة الرمادية ، وحدد تحليل الملصقات > تطبيق (الشكل 4D).
  2. قم بتخصيص اسم العمود، واختر مجموعة قياس. حدد Volume3d و Long3d من مربع القياسات الأصلية.
  3. انقر فوق الزر "تطبيق" في الزاوية اليسرى السفلية من الشاشة. انسخ البيانات والرسم البياني في البرنامج الإحصائي ، مثل GraphPad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أثناء زراعة الخلايا (الشكل 1 أ) ، قمنا أولا بتقسيم خلايا سرطان البنكرياس إلى مجموعة تحكم مستزرعة بوسط زراعة كامل ، ومجموعة (1S ، 3R) -RSL348 (RSL3 ، منشط فيروبتوسيس ، 100 نانومتر) ، ومجموعة RSL3 (100 نانومتر) بالإضافة إلى فيروستاتين -149 (Fer-1 ، مثبط داء الحديديات ، 100 نانومتر). من خلال الخطوات التجريبية المذكورة أعلاه ، حصل المجهر الإلكتروني الماسح على 38 (الشكل التكميلي 1) و 43 (الشكل التكميلي 2) و 44 (الشكل التكميلي 3) صور متسلسلة للمجموعة الضابطة ومجموعة RSL3 ومجموعة المثبطات (مجموعة RSL3 + Fer-1) ، على التوالي. تم التقاط الصور بدقة 1280 × 960 بكسل بتكبير 8000 ضعف (بدقة 12.40 نانومتر / بكسل). لم يلاحظ كل من التجاعيد والتلوث في منطقة الخلية فوق الأقسام. يمكن لصور المجهر الإلكتروني أن تميز بوضوح العضيات ، مثل الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية ، في الخلايا (الشكل 1E).

أظهرت ملاحظة صور 2D بواسطة FE-SEM أنه في المجموعة الضابطة للخلايا السرطانية (الشكل 5A) ، تم توزيع الميتوكوندريا في جميع أنحاء السيتوبلازم ، وكان معظمها كرويا أو بيضاويا وممتلئا بالتساوي. بالإضافة إلى ذلك ، كانت بنية cristae المنتظمة نسبيا والممدودة مرئية بوضوح. على العكس من ذلك ، في مجموعة RSL3 (الشكل 5D) ، أظهرت غالبية الميتوكوندريا مورفولوجيا متقلصة ، وزيادة في كثافة الغشاء ، وبنية cristae غامضة نسبيا. كشف الفحص الدقيق لصور SEM (الشكل 5E) أنه ليس كل كريستا الميتوكوندريا تدهورت أو اختفت ، حيث ظل عدد صغير نسبيا من cristae سليما. بالمقارنة مع مجموعة RSL3 ، في المجموعة المثبطة ، حافظت معظم الميتوكوندريا على البنية المتكاملة لكريستاي الميتوكوندريا ، ولم تكن سوى أقلية من هياكل cristae الميتوكوندريا غير واضحة (الشكل 5G).

بينما تظهر معلومات 2D اختلافات في مورفولوجيا الميتوكوندريا ، يمكن أن تؤدي في بعض الأحيان إلى فهم متحيز لهيكل 3D المفصل والحقيقي50,51. كانت هياكل cristae للمجموعة الضابطة تحت شرط 3D (الشكل 5C) متسقة مع الصور ثنائية الأبعاد ، لكنها كانت مختلفة بالنسبة لمجموعة RSL3. بالنسبة لهذه المجموعة ، يمكن أيضا ملاحظة وجود كريستا الميتوكوندريا الكاملة في الصور ثنائية الأبعاد (الشكل 5E) ، لكن الميتوكوندريا تحت 3D (الشكل 5F) كانت غير منتظمة ومفرغة بشكل عام في المنتصف. أظهرت المجموعة المثبطة (الشكل 5I) أشكالا متنوعة من cristae ، مع بعض cristae الميتوكوندريا فقط التي تظهر انهيارا موضعيا. وبالتالي ، من نتائج مجموعة RSL3 ، يمكن ملاحظة أن استخدام تحليل 2D فقط قد يؤدي إلى فهم أحادي الجانب للنتائج. نتائج الصور ثنائية الأبعاد متحيزة مقارنة بالنتائج المقدمة عند تكديس مجموعة من الصور لعرض 3D ، لذلك لا يمكن تعميم النتائج المنتجة فقط من خلال معلومات 2D. لتوضيح تأثيرات RSL3 على الميتوكوندريا بشكل أكثر موضوعية ، تم استخدام بيانات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لتحديد وقياس تغيرات الميتوكوندريا52. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، انخفض طول وحجم الميتوكوندريا ثلاثية الأبعاد في مجموعة RSL3 بشكل ملحوظ ، لكن نتائج القياس الكمي لمجموعة المثبطات انخفضت بين نتائج المجموعتين الأخريين (الشكل 5J ، K). تشير هذه البيانات الكمية إلى أن RSL3 ينتج ميتوكوندريا أصغر ومتدهورة ، وإضافة مثبطات يقلل من هذا التأثير.

كما هو موضح في الشكل 6B والشكل 6C ، تم تحديد أن محفز ferroptosis RSL3 تسبب في خلل في الميتوكوندريا وأثر على التمثيل الغذائي الخلوي عن طريق تغيير مورفولوجيا الميتوكوندريا 53,54 واستنباط داء الحديديات ، والذي قد يمثل شكلا في كل مكان من موت الخلايا الديناميكي في علاج السرطان الناجم عنRSL3 55.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل العام لإعادة بناء 3D للميتوكوندريا خلية سرطان البنكرياس. يتم عرض سير العمل العام لتجارب إعادة الإعمار 3D الموضحة في هذا البروتوكول. أ: زراعة خلايا سرطان البنكرياس. (ب) تحضير كتلة الراتنج. (ج) جمع المقاطع التسلسلية باستخدام ميكروتوم فوق مصغر. (د) الحصول على صور 2D باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح للانبعاث الميداني. (ه) وضع الميتوكوندريا المستهدفة في صور SEM المتسلسلة. (F) تحليل الميتوكوندريا في 3D. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: جهاز لشرائط الشرائح يركب شرائح متصلة على رقاقة سيليكون مجففة بالماء. (أ) مناور زاوية قابل للتعديل مع ملقط لعقد الرقاقة. (ب) إطار حامل الرقاقة الموضوع بجوار الميكروتوم الفائق. (ج) وضع رقاقة السيليكون في الفتحة الزرقاء التي تحتوي على السكين الماسي. (د) لقطة مقربة توضح العلاقة الموضعية بين رقاقة السيليكون وشفرة السكين الماسية. (ه) رقاقة سيليكون مع شرائط شرائح متصلة بمرحلة عينة SEM مع غراء كربون موصل. (F) لقطة مقربة توضح النظرة العامة لشرائط الشرائح التسلسلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: عملية تحديد المعلمات والحصول على الصور. (A) شريط القوائم الخاص ب FE-SEM (يشير السهم إلى خيار H / L). (ب) جدول معلمات وظروف التصوير. (ج) نظرة عامة على صور 2D المتتالية في ثلاث مجموعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: دليل خطوة بخطوة لتصور الميتوكوندريا في 3D باستخدام Amira. ( أ) استيراد صور من مجلد معين. (ب) محاذاة مكدسات الصور وفقا للهيكل المستهدف. (ج) تجزئة وإضافة منطقة الاهتمام. (د) إعادة بناء هيكل 3D وإضافة بيانات القياس الكمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مورفولوجيا الميتوكوندريا 2D و 3D في كل مجموعة. مورفولوجيا الخلايا السرطانية 2D للمجموعة الضابطة عند (A) تكبير 8000 ضعف و (B) تكبير 15000 ضعف. (ج) تمثيل 3D لمورفولوجيا الميتوكوندريا للمجموعة الضابطة. مورفولوجيا الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد لمجموعة RSL3 عند تكبير (D) 8000 ضعف وتكبير (E) 15000 ضعف. (F) تمثيل ثلاثي الأبعاد لمورفولوجيا الميتوكوندريا لمجموعة RSL3. مورفولوجيا الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد لمجموعة RSL3 + Fer-1 (المانع) عند تكبير (G) 8000 ضعف وتكبير (H) 15000 ضعف. (I) تمثيل ثلاثي الأبعاد لمورفولوجيا الميتوكوندريا لمجموعة RSL3 + Fer-1 (المانع). البيانات الكمية لطول (J) ومتوسط حجم الميتوكوندريا (K) في كل مجموعة. يشار إلى فروق ذات دلالة إحصائية بالعلامات النجميةوتم حسابها باستخدام اختبار t للطالب (مقابل المجموعة الضابطة ، * p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 ، *** p ≤ 0.001.) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الاختلافات في مورفولوجيا الميتوكوندريا للخلايا السرطانية عند مستويات 2D و 3D. (أ) مورفولوجيا الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد لمجموعة RSL3 عند تكبير 8000 ضعف. (ب) مورفولوجيا الميتوكوندريا 2D عند تكبير أعلى. (ج) تمثيل 3D لميتوكوندريا محددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معلمات التصوير شروط
حجم البيانات 1280 × 960
بيكسل سايز 12.40234
تسريع الجهد 2000 فولت
مسافة العمل 3700 ميكرومتر
تيار الانبعاث 13700 nA
شعاع الحالي 10 ميكروأمبير
فتحة الحد الحالية رقم 2 صريف FE-SEM
وقت المكوث 32 ميكروثانية / بكسل
عدد الخلايا 107
وحدات التخزين المصورة 10×8×2.66 ميكرومتر ، 212.8 ميكرومتر مكعب
10×8×3.01 ميكرومتر ، 240.8 ميكرومتر مكعب
10×8×3.08 ميكرومتر ، 246.4 ميكرومتر مكعب

الجدول 1: ملخص لظروف التسجيل ومعلمات مجموعة البيانات للحصول على الصورة.

الشكل التكميلي 1: نظرة عامة على صور 38 مقطع دقيق للخلايا السرطانية من المجموعة الضابطة. يتم ترتيب رقم الصورة لكل مقطع دقيق من الأعلى إلى الأسفل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: نظرة عامة على صور 43 مقطع مجهري للخلايا السرطانية من مجموعة RSL3. يتم ترتيب رقم الصورة لكل مقطع دقيق من الأعلى إلى الأسفل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: Overview لصور 44 مقطع مجهري للخلايا السرطانية من مجموعة RSL3 + Fer-1 (المانع). يتم ترتيب رقم الصورة لكل مقطع دقيق من الأعلى إلى الأسفل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا هي دليل مفيد خطوة بخطوة لتطبيق تقنية إعادة الإعمار 3D ، والتي تتضمن تطبيق المجهر الإلكتروني وتكنولوجيا معالجة الصور على تكديس وتجزئة الصور المقطعية 2D المتولدة من المقاطع التسلسلية فائقة النحافة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على قيود على صور 2D التي يمكن معالجتها من خلال التصور 3D للبنية التحتية للعضية ، والتي تتميز بمزايا التكاثر القوي للهياكل بمستوى دقة عالية ودقة أعلى. الأهم من ذلك ، يمكن تطبيق هذا التصور 3D على الخلايا السرطانية لجعل دراسة الآليات المرضية أكثر وضوحا وموثوقية. تم فحص هذه التقنية في هذا العمل لتصور الهياكل المجسمة لكريستاي الميتوكوندريا من خلال مقارنة ثلاث مجموعات من المقاطع التسلسلية في ظل ظروف مختلفة ، وبالتالي التحقق من صحة تدهور غشاء cristae الناجم عن الميتوكوندريا RSL3 الذي يحدث في الخلايا السرطانية56. توفر هذه النتائج نظرة ثاقبة حول آلية عمل RSL3 كدواء مضاد لسرطان البنكرياس.

يلعب الحصول على صور 2D عالية الدقة دورا مهما في عملية إعادة بناء 3D57 من cristae الميتوكوندريا ، وتؤثر جودة الصورة بشكل مباشر على نتائج إعادة الإعمار 22,58. لذلك ، تحتوي هذه الطريقة أيضا على بعض القيود ، مثل أدوات الشحن التي تم إنشاؤها في صور SEM59 ، والتي بدورها يمكن أن تؤدي إلى تجزئة غير صحيحة للهياكل المستهدفة. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق تقصير وقت مسح الشريحة ، وتجهيز SEM بمعوض شحنة بؤري34,60 ، واستخدام طريقة OTO ، والتي يمكن أن يؤدي استخدام TCH إلى جعل العينة أكثر توصيلا للإلكترونات عن طريق تلطيخها بمعادن إضافية 61. يميل الاعتماد على تجزئة الصورة التلقائية إلى أن يكون غير دقيق من حيث تحديد نطاق الهيكل ، في حين أن التجزئة اليدوية تستغرق وقتاطويلا 58. لذلك ، على أساس ميزة المسح السريع ل SEM لتحقيق جمع الصور62 ، يمكن استخدام التجزئة شبه الآلية في برنامج Amira لتمكين التصوير الفعال وإعادة البناء ؛ يمكن أن يؤدي استخدام برنامج Amira أيضا إلى جعل النتيجة أكثر دقة ودقة من استخدام FIJI و MIB63. الخطوة الرئيسية في التصوير 3D هي الحصول على أقسام فائقة النحافة. غالبا ما تحدث مشكلات مثل الحذف والكسر والتشويه ، والتي تؤثر على استمرارية الصورة ، أثناء جمع المقطع. من أجل حل مشاكل مثل فقدان وكسر الشرائح ، استخدمنا رقائق السيليكون المجففة بالماء كدعم لجمع شرائط الشرائح.

على الرغم من أن SBF-SEM و FIB-SEM يمكن أن تقلل من تشوه أو عيوب في الأقسام ، إلا أن هذه التقنيات لها سرعة تصوير بطيئة ، وتتطلب أدوات باهظة الثمن ، وغير قادرة على إعادة تصور هيكل الاهتمام64،65،66. يفتقر FIB-SEM إلى استقرار النظام أثناء التصوير ، بينما يتم إعاقة SBF-SEM بسبب خطوات إعداد العينات المعقدة وسير العملالشاق 34. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق التصوير المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) تدريجيا لدراسة بنية الميتوكوندريا. تراقب هذه الطريقة صورا 3D في الوقت الفعلي لكريستا الميتوكوندريا في الخلايا الحية من خلال بناء مجسات لوضع العلامات على الميتوكوندريا67. يمكن أن يكشف وضع العلامات على الصبغة الفلورية عن عمليات التغيير في cristaeأثناء اندماج الميتوكوندريا والانشطار68. ومع ذلك ، فإن الخلايا الحية لديها تحمل محدود للضوء الشديد ، لذلك من الصعب استخدام هذه التقنية في التصوير طويل المدى للأمراض المنقولة جنسيا68. بالإضافة إلى ذلك ، فإن STED مقيد بالدقة وعمق التصوير ورقمالبكسل 69.

بالمقارنة مع التقنيات الأخرى ، فإن استخدام المقاطع فائقة النحافة المستمرة جنبا إلى جنب مع تقنية إعادة البناء 3D لمراقبة البنية التحتية للعضيات من مجال رؤية واسع لا يسمح فقط بالتصوير عالي الإنتاجية في فترة زمنية قصيرة ولكنه يتيح أيضا فحص الصور عالية الدقة للهياكل المستهدفة في أوقات منفصلة21، وبالتالي تحسين معدل التصوير ومرونة إعادة البناء. علاوة على ذلك ، يمكن فحص التغيرات المورفولوجية للعضيات والروابط المكانية مع العضيات الأخرى. يمكن قياس هذه الجوانب ، ويمكن الكشف عن آليات التغيير بشكل أكثر دقة من خلال إعادة بناء العضيات المجاورة لعرض علاقاتها الموضعية70,71. تكشف تقنية إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والتصوير التسلسلي باستخدام Amira58 عن العلاقة بين الأمراض والتغيرات الهيكلية الفائقة للعضيات على المقياس النانوي72 ، وقد استخدمت على نطاق واسع في الطب والبيولوجيا وغيرها من المجالات ، وتمهد الطريق لتطوير علاجات جديدة فعالة73،74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من خلال منح مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ (Z23H290001 ، LY19H280001) ؛ منح المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274364 و 81673607 و 81774011) ؛ بالإضافة إلى مشروع أبحاث الرفاهية العامة لمنحة هوتشو للعلوم والتكنولوجيا (2021GY49 ، 2018GZ24). نحن نقدر المساعدة الكبيرة والدعم الفني والدعم التجريبي من المنصة العامة لمركز البحوث الطبية ، أكاديمية العلوم الطبية الصينية ، جامعة تشجيانغ الطبية الصينية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 196 ، خلية سرطان البنكرياس ، الميتوكوندريا ، البنية التحتية ، إعادة البناء 3D ، المسح المجهري الإلكتروني (SEM) ، إعداد عينة OTO
تقنية ثلاثية الأبعاد لتصور التغيرات الهيكلية للميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong,… More

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter