Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשחזר כריסטה מיטוכונדריאלית כדי להשיג הדמיה תלת-ממדית בדיוק גבוה, ברזולוציה גבוהה ובתפוקה גבוהה.

Abstract

הבנת התכונות הדינמיות של מבנה העל של אברוני התא, שהוא לא רק עשיר במידע לא ידוע אלא גם מתוחכם מנקודת מבט תלת-ממדית (תלת-ממדית), היא קריטית למחקרים מכניסטיים. מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מציע עומק הדמיה טוב ומאפשר שחזור של ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה כדי לחקור את המורפולוגיה האולטרה-סטרוקטורלית של אברוני התא אפילו בקנה מידה ננומטרי; לכן, שחזור תלת מימד צובר חשיבות בשל היתרונות שאין דומה לו. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) מספק טכנולוגיית רכישת תמונה בתפוקה גבוהה המאפשרת שחזור מבנים גדולים בתלת-ממד מאותו אזור עניין בפרוסות עוקבות. לכן, היישום של SEM בשחזור תלת ממדי בקנה מידה גדול כדי לשחזר את ultrastructure 3D האמיתי של אברונים הופך נפוץ יותר ויותר. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של חתך אולטרה דק סדרתי וטכניקות שחזור תלת-ממדיות כדי לחקור קריסטות מיטוכונדריאליות בתאי סרטן הלבלב. הפרטים על האופן שבו טכניקות אלה מבוצעות מתוארים בפרוטוקול זה באופן שלב אחר שלב, כולל שיטת osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), הדמיית חתך אולטרה-דק טורי ותצוגת הדמיה.

Introduction

מיטוכונדריה הם אחד האברונים החשובים ביותר בתא. הם משמשים כמרכז המרכזי של ביו-אנרגטיקה תאית ומטבוליזם 1,2 וממלאים תפקיד קריטי בסרטן3. סרטן הלבלב (PC) הוא אחד מסוגי הסרטן הקשיםביותר לטיפול בשל התפשטותו המהירה ושיעור התמותה הגבוה. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, הנגרם בעיקר על ידי שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית 3,5,6,7, נקשר למנגנוני המחלה העומדים בבסיס PC8. מיטוכונדריה הם גם דינמיים מאוד, אשר בא לידי ביטוי על ידי שינויים תכופים ודינמיים בקישוריות הרשת שלהם ואת מבנה cristae9. העיצוב מחדש של מבנה הקריסטה יכול להשפיע ישירות על תפקוד המיטוכונדריה ועל המצב התאי10,11, אשר משתנים באופן משמעותי במהלך צמיחת תאי הגידול, גרורות ושינויים במיקרו-סביבה של הגידול12,13.

בשנים האחרונות, מדענים חקרו אברון זה באמצעות תצפית EM14,15,16,17; לדוגמה, חוקרים ניתחו את הדינמיקה המיטוכונדריאלית באמצעות טכניקות שחזור תלת-ממדיות 6,7,18,19. הרעיון הכללי והשיטה לשחזור תלת-ממדי של תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים נקבעו רשמית כבר בשנת 196820 וכללו שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים, עקיפה אלקטרונית ועיבוד תמונה ממוחשב כדי לשחזר את זנב הפאג T4. עד כה, טכנולוגיית הדמיה תלת-ממדית של מיקרוסקופ אלקטרונים עשתה התקדמות משמעותית במונחים של רזולוציית תמונה 21, דרגת אוטומציה22 ונפח עיבוד 23 ושימשה בקנה מידה רחב יותר ויותר במחקר ביולוגי, מרמת הרקמה ועד לרמת האולטרה-מבנה של אברונים בקנה מידה ננומטרי24. בשנים האחרונות, הדמיית תלת מימד במיקרוסקופ אלקטרונים הפכה גם לטכנולוגיה מבטיחה למגוון רחב של יישומים25,26,27.

תשומת הלב הגוברת על cristae מיטוכונדריאלי ממחיש במיוחד את הדרישות החיוניות עבור הדמיית נפח ultrastructural. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) שימש להמחשת דגימות שנאספו על רשת נחושת (400 רשת)28, כאשר קרן האלקטרונים עוברת דרך הקטע. עם זאת, בשל הטווח המוגבל של רשת הנחושת, אי אפשר לצלם באופן מלא פרוסות רציפות של אותו מדגם29. זה מסבך את המחקר של מבני המטרה במהלך הדמיה TEM. בנוסף, TEM מסתמך על משימות ידניות גוזלות זמן ומועדות לשגיאות, כולל חיתוך ואיסוף פרוסות מרובות והדמיה שלהן ברצף21, כך שהוא אינו מותאם לשחזורים אולטרה-מבניים של דגימות בנפח גדול23. כיום, שחזור ברזולוציה גבוהה של דימות דגימה בנפח גדול מושג באמצעות שימוש בציוד מיוחד, כגון מערך מצלמות TEM (TEMCA)30 או שתי מערכות TEMCA מהדור השני (TEMCA2)31, המאפשרות הדמיה אוטומטית בתפוקה גבוהה תוך זמן קצר. עם זאת, סוג זה של הדמיה אין את היתרון של להיות קל להשגה אוניברסלי בשל הדרישה ציוד מותאם אישית.

בהשוואה ל-TEM, השיטה ליצירה אוטומטית של אלפי תמונות נפחיות סדרתיות עבור אזורים גדולים בהתבסס על SEM 32,33 משפרת את היעילות והאמינות של הדמיה טורית ומספקת רזולוציות z גבוהות יותר34. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוקים סדרתי (SBF-SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) אפשרו שניהם להשיג שחזור תלת-ממדי של אולטרה-מבנה במהירות גבוהה, יעילות ורזולוציה35,36. עם זאת, אין מנוס מכך שמשטח הבלוק מגולח מכנית על ידי סכין היהלום של SBF-SEM או על ידי כרסום עם קרן היונים הממוקדת של FIB-SEM33,37. בשל ההרסניות של שתי השיטות לדגימות, לא ניתן לשחזר שוב את אותו מבנה מטרה לניתוח נוסף38,39,40. בנוסף, מחקרים מעטים ניסו לשחזר את מבנה העל של אברונים תלת-ממדיים של תאים סרטניים באמצעות EM כדי לצפות בשינויים פתולוגיים12. מסיבות אלה, על מנת להבהיר עוד יותר את המנגנונים הפתולוגיים של תאים סרטניים, כגון תאי סרטן הלבלב, אנו מציעים טכנולוגיה חדשנית לשחזור תלת-ממדי של תמונות חתך סדרתי באמצעות אולטרה-מיקרוטום ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה (FE-SEM) לניתוח מבנה העל המיטוכונדריאלי ברמת הקריסטה; באמצעות טכנולוגיה זו ניתן לרכוש נתונים ברזולוציה גבוהה בשיטה יעילה ונגישה. את החלקים האולטרה-דקים הסדרתיים המיוצרים באמצעות אולטרה-מיקרוטום ניתן לאחסן באופן קבוע למחצה במארז רשת ולצלם מחדש מספר פעמים, גם לאחר מספר שנים41. FE-SEM מוערך מאוד ככלי בתחומי מחקר שונים בשל יכולתו לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה, הגדלה גבוהה ורבגוניות42. בניסיון להציג את המבנה העדין של אברונים בתלת-ממד, הטכניקה לייצור ערימות תמונה דו-ממדיות סדרתיות ברזולוציה שימושית באמצעות אלקטרונים מפוזרים לאחור המיוצרים על ידי FE-SEM 43,44 יכולה לשמש גם להשגת הדמיה בתפוקה גבוהה ובקנה מידה רב של אזורי מטרה או מבנים הקשורים אליהם ללא ציוד מיוחד 45. יצירת תוצרי המטען משפיעה ישירות על איכות התמונות שנרכשו, ולכן חשוב במיוחד לשמור על זמן השהייה קצר.

לפיכך, המחקר הנוכחי מרחיב את ההליכים הניסיוניים המשמשים בטכניקת SEM זו כדי לשחזר את המבנה התלת-ממדי של cristaeמיטוכונדריאלי 46. באופן ספציפי, אנו מראים את התהליך שפותח להשגת סגמנטציה חצי-אוטומטית של אזורים מיטוכונדריאליים ודיגיטציה של השחזור התלת-ממדי באמצעות תוכנת Amira, הכוללת גם הכנת דגימות פרוסה באמצעות שיטת הכנת דגימות OTO קונבנציונלית44,47, השלמת איסוף החתכים באמצעות חיתוך אולטרה-מיקרוטומי, והשגת נתונים דו-ממדיים רציפים על ידי FE-SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת החומר

  1. תרבית 2 x 106 תאי Panc02 ב 12 מ"ל של DMEM בינוני (10% סרום בקר עוברי ו 100 U / מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין), ולשמור על 37 ° C ו 95% לחות באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ו 95% אוויר במשך 48 שעות.
  2. לאסוף תאי Panc02, צנטריפוגה ב 28 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant. ודא כי הדגימה היא בגודל מתאים (1 x 107 תאים), אחרת, שלבי הקיבוע וההתייבשות הבאים לא יפעלו היטב.
  3. הוסף 1 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד כחומר קיבוע כדי לתקן את תאי Panc02 הטריים בצינורות מיקרו-צנטריפוגות 1.5 מ"ל למשך הלילה ב -4 ° C.
    הערה: הדגימות צריכות להיות צנטריפוגות במהירות של 1,006 x גרם למשך 5 דקות בכל אחד מהשלבים הבאים (שלבים 1.3-1.11).
  4. יש לשאוף את חומר הקיבוע, ולשטוף את הדגימות פעמיים במי מלח חוצצים בפוספט 0.1M (PBS), ולאחר מכן לשטוף פעמיים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כל אחת.
  5. הוסף 50 μL של תמיסה המכילה 1% osmium tetroxide (OsO4) ו 1.5% אשלגן ferrocyanide ביחס של 1: 1 ב 4 ° C במשך 1 שעות. לאחר מכן, שטפו פעמיים עם PBS של 0.1 M במשך 10 דקות בכל פעם, ושטפו עם ddH2O במשך 10 דקות נוספות.
  6. הוסף 1 מ"ל של 1% thiocarbohydrazide (TCH), לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עד 1 שעה, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
  7. יש להוסיף 50 μL של 1% OsO4, לתקן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
  8. יש להוסיף 1 מ"ל של 2% אורניל אצטט ב-4°C למשך הלילה, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
  9. הוסף 1 מ"ל של תמיסת וולטון (0.066 גרם של חנקת עופרת מומסת ב 10 מ"ל של 0.03 mol/L תמיסת מלאי חומצה אספרטית) ב 60 ° C עבור 1 שעה נוספת של דגירה.
  10. יש לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם, ולאחר מכן לייבש בסדרת אלכוהול מדורגת למשך 10 דקות בכל פעם: 50% אלכוהול, 70% אלכוהול, 80% אלכוהול, 90% אלכוהול 1x ו-100% אלכוהול 2x. לאחר מכן, יש לייבש ב-100% אצטון פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם. השתמש 1 מ"ל של כל פתרון עבור התייבשות.
  11. ערבבו 200 מיקרוליטר אצטון עם שרף אפוקסי Pon 812 ביחס של 3:1, 1:1 ו-1:3. השרו את הדגימה בשרף בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, 4 שעות ו-4 שעות, בהתאמה, ולאחר מכן קחו את שרף האפוקסי 100% Pon 812 כדי לספוג למשך הלילה.
    הערה: בעת ביצוע שלבי הצביעה והשמעת השרף, חשוב לפעול במכסה אדים מכיוון שמדובר בחומרים רעילים. בנוסף, יש ללבוש מעילי מעבדה וכפפות עמידות בפני ממסים במהלך הניסוי.
  12. הכניסו את הדגימות לתבנית הטבעה, ולאחר מכן הכניסו לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפילמור. השתמשו בהטבעה שטוחה29 כדי להפחית את מראה השרף סביב הדגימה. פעולה זו מפשטת את התקנת הדגימה ומפחיתה את ההשפעה של טעינת תוצרים על פילוח התמונה הבא.
    הערה: כדי ליצור לאחר מכן משטח חיתוך אופקי, ניתן להוסיף כמות קטנה של שרף לחור התבנית, תוך הקפדה לא למלא אותו יתר על המידה.
  13. הכינו פרוסות סיליקון על ידי שטיפתם תחילה ולאחר מכן הידרופיליזציה עם תמיסת H 2 SO4/H 2 O2מרוכזת למשך 30 דקות. אספו רצועות פרוסות סדרתיות בעובי של 70 ננומטר על פרוסות הסיליקון שעברו הידרופיליזציה באמצעות אולטרה-מיקרוטום, וייבשו אותן בתנור של 60°C למשך 10 דקות.
    הערה: לכוד באיטיות את הפרוסה כשהפרוסה צפה על פני השטח של פרוסות הפרוסות כדי למנוע אובדן או עיוות של הפרוסה.

2. רכישת תמונה ושחזור תלת מימדי

  1. לפני הרכבת רקיק סיליקון על הבמה, לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים שלוש פעמים, ולייבש אותם באוויר. חתכו סרט פחמן מוליך בגודל של 1 ס"מ x 0.5 ס"מ, והדביקו אותו בין פרוסת הסיליקון לשלב הדגימה של SEM כדי להשלים את הגדרת הדגימה (איור 2E).
  2. הגדר את פרמטר המתח המאיץ FE-SEM ל- 2 kV עם מרחק עבודה של 4 מ"מ (איור 3B וטבלה 1).
    הערה: כדי לשפר את יחס האות לרעש ולהפחית את הרעש בתמונה, צפה בהגדלות נמוכות במידת האפשר. ככל שהריבוי גדל, טווח הסריקה של ה-SEM מצטמצם, מה שמוביל לעלייה בצבירת המטען על התמונות.
  3. לחץ על סמל H/L בשורת התפריטים העליונה. תחילה, בהגדלה נמוכה, כוונו את החלק הראשון של רצועות פרוסת היעד, ולאחר מכן לחצו שוב על האפשרות H/L (איור 3A) כדי לעבור למצב הגדלה גבוהה; אסוף תמונה מתאימה למבנה העניין על-ידי התאמת הבהירות, הניגודיות וההגדלה של התמונה.
  4. בחר Project View > Open Data וייבא את קבצי התמונה לניתוח לתוך התוכנה.
  5. יישרו את התמונות בלחיצה על ' יישור פרוסות' >'עריכה ' (איור 4B), והתאימו את הערך 'טווח עוצמה ' בשורת התפריטים השמאלית התחתונה באמצעות שינוי שקיפות התמונה. כאן, השתמש באסטרטגיית יישור חצי אוטומטית; באופן ספציפי, באמצעות יישור אוטומטי, הפוך את התמונות לחפיפה עם תמונה קודמת ולאחר מכן בצע כוונון עדין ידני.
    הערה: בעבודה זו, במהלך תהליך היישור, התמונה הקודמת שימשה כהפניה, ופעולות ההזזה והסיבוב נוצלו כדי לחפוף באופן מרבי את מבנה היעד של שתי התמונות. לחיצה על Align Current Slice Pair יכולה לעזור ליישר את התמונות באופן אוטומטי, אך עלולה להתרחש טעות במיקום.
  6. בחרו במודול 'חלץ אמצעי אחסון משנה' וגזור את ערכות הנתונים המיושרות כך שיתאימו לגודל החלק החופף של הערימה כולה.
  7. תחת תת-המקטע סגמנטציה (איור 4C), בחר דגימה מחדש > סגמנטציה > שמור. בחרו בסף מטה הקסם ובגודל הכלי מברשת לבחירת הטווח הנכון. גם כאן, אמצו שיטת סגמנטציה חצי אוטומטית על ידי שימוש תחילה בשרביט הקסמים כדי לבחור באופן אוטומטי שטח גדול מתאים, ולאחר מכן השתמשו במברשת כדי לתאר במדויק את הפרטים.
    הערה: ניתן להחיל את מטה הקסם על תמונות מקטעים בהתבסס על ההבדלים הברורים בעוצמת הפיקסלים הקיימת בין מבנה העניין לבין המבנים הסובבים אותו על-ידי שינוי ערך המסיכה ושימוש בקו מגבלת הציור. הוא אינו מסוגל להבחין בין תוצרי הטעינה שנוצרו במהלך רכישת התמונה. לכן, זה עלול לגרום לפילוח שגוי עבור אזורי היעד. ניתן להשתמש בכלי מברשת כדי לפלח ידנית כדי לשחזר במדויק את המבנים הביולוגיים.
  8. תחת פילוח > בחירה, לחץ על סמל + כדי להוסיף את האזור שנבחר (איור 4C).
  9. חזור על השלב לעיל (2.8) לבחירת אותו מבנה יעד בתמונות שונות עד להשלמת הבחירה לשחזור המיקרו-מבנים המעניינים.
    הערה: במהלך תהליכי העיצוב מחדש של המיטוכונדריה, הבחירה של אובייקט היעד חייבת להתבצע מתוך התמונה באמצע קבוצה של תמונות רציפות. אם האזור הדרוש נבחר מהתמונה הראשונה או האחרונה, תוצאת השחזור לא תוכל להציג הדמיה תלת-ממדית מלאה.
  10. לאחר השלמת הפילוח האזורי, צור את קובץ התמונה בהתאם לתוצאות הטובות ביותר עבור גודל האובייקט ורזולוציית התמונה. לחץ על עורך החיתוך ולאחר מכן הזן את הספרה 6 בתיבה המחוון הווירטואלי (איור 4C).
  11. בתפריט הנפתח משמאל, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור האפור תחת סעיף המשנה Project ובחר צור משטח > צור > החל. בקובץ שנוצר, השתמש במודול Surface View כדי ליצור את מבנה פני השטח ואת הייצוג התלת-ממדי.

3. כימות

  1. לחצו על ' הסר כתמים קטנים' > להחיל (איור 4D). תחת תת-המקטע Project , לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור האפור ובחר Label Analysis > Apply (איור 4D).
  2. התאם אישית את שם העמודה ובחר קבוצת מידה. בחר Volume3d ו- Length3d בתיבה מדידות מקוריות.
  3. לחץ על הלחצן החל בפינה השמאלית התחתונה של המסך. העתק את הנתונים, וגרף בתוכנה הסטטיסטית, כגון GraphPad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במהלך תרבית תאים (איור 1A), חילקנו תחילה את תאי סרטן הלבלב לקבוצת ביקורת בתרבית עם מדיום תרבית שלם, קבוצה (1S,3R)-RSL348 (RSL3, מפעיל פרופטוזיס, 100 ננומטר), וקבוצת RSL3 (100 ננומטר) בתוספת פרוסטטין-149 (Fer-1, מעכב פרופטוזיס, 100 ננומטר). באמצעות שלבי הניסוי לעיל, מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק רכש 38 (איור משלים 1), 43 (איור משלים 2) ו-44 (איור משלים 3) תמונות רציפות עבור קבוצת הביקורת, קבוצת RSL3 וקבוצת המעכבים (קבוצת RSL3 + Fer-1), בהתאמה. התמונות בגודל 1,280 x 960 פיקסלים צולמו בהגדלה של פי 8,000 (ברזולוציה של 12.40 ננומטר לפיקסל). גם קמטים וגם זיהום באזור התא לא נצפו מעל הסעיפים. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים יכלו להבחין בבירור בין אברונים, כמו למשל המיטוכונדריה והרשתית האנדופלסמית, בתאים (איור 1E).

התצפית של התמונות הדו-ממדיות על-ידי FE-SEM הראתה שבקבוצת הביקורת של תאי סרטן (איור 5A), המיטוכונדריה היו מפוזרים ברחבי הציטופלסמה, ורובם היו כדוריים או סגלגלים ושמנמנים באופן שווה. בנוסף, ארכיטקטורת הקריסטות המוארכת והרגילה יחסית נראתה בבירור. לעומת זאת, בקבוצת RSL3 (איור 5D), רוב המיטוכונדריה הציגו מורפולוגיה מתכווצת, עלייה בצפיפות הממברנה ומבנה כריסטאי מעורפל יחסית. בחינה מדוקדקת יותר של תמונות SEM (איור 5E) גילתה שלא כל הקריסטות המיטוכונדריאליות התנוונו או נעלמו, שכן מספר קטן יחסית של כריסטות נותר שלם. בהשוואה לקבוצת RSL3, בקבוצת המעכבים, רוב המיטוכונדריה שמרו על המבנה האינטגרלי של הקריסטה המיטוכונדריאלית, ורק מיעוט ממבני הקריסטה המיטוכונדריאלית לא היו נראים לעין (איור 5G).

בעוד שמידע דו-ממדי מראה הבדלים במורפולוגיה של המיטוכונדריה, הוא יכול לפעמים לגרום להבנה מוטה של המבנה התלת-ממדי המפורט והאמיתי50,51. מבני הקריסטות של קבוצת הביקורת בתנאי התלת-ממד (איור 5C) היו עקביים עם התמונות הדו-ממדיות, אולם הם היו שונים עבור קבוצת RSL3. עבור הקבוצה הזו, ניתן היה לראות נוכחות של קריסטה מיטוכונדריאלית מלאה גם בתמונות הדו-ממדיות (איור 5E), אולם המיטוכונדריה מתחת לתלת-ממד (איור 5F) היו לא סדירים, ובדרך כלל התרוקנו באמצע. קבוצת המעכבים (איור 5I) הראתה צורות שונות של cristae, כאשר רק חלק מהקריסטות המיטוכונדריאליות הראו קריסה מקומית. לפיכך, מתוצאות קבוצת RSL3, ניתן לראות כי רק שימוש בניתוח דו-ממדי עשוי להוביל להבנה חד-צדדית של התוצאות. התוצאות של תמונות דו-ממדיות מוטות בהשוואה לתוצאות המוצגות בעת ערימת סט תמונות לתצוגה תלת-ממדית, ולכן לא ניתן להכליל את התוצאות המופקות רק באמצעות מידע דו-ממדי. כדי להדגים באופן אובייקטיבי יותר את ההשפעות של RSL3 על המיטוכונדריה, נעשה שימוש בנתוני שחזור תלת-ממדי כדי לכמת ולמדוד שינויים במיטוכונדריה52. בהשוואה לקבוצת הביקורת, האורך והנפח של המיטוכונדריה התלת-ממדית בקבוצת RSL3 ירדו באופן משמעותי, אולם תוצאות הכימות של קבוצת המעכבים נפלו בין התוצאות של שתי הקבוצות האחרות (איור 5J,K). נתונים כמותיים אלה מצביעים על כך ש-RSL3 מייצר מיטוכונדריה קטנים ומפורקים, והוספת מעכבים מפחיתה השפעה זו.

כפי שניתן לראות באיור 6B ובאיור 6C, נקבע כי גורם הפרופטוזיס RSL3 גרם לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה והשפיע על חילוף החומרים התאי על-ידי שינוי המורפולוגיה המיטוכונדריאלית 53,54 ויצירת פרופטוזיס, אשר עשויה לייצג צורה נפוצה של מוות תאי דינמי בטיפול בסרטן המושרה על-ידיRSL3 55.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה כללית לשחזור תלת-ממדי של מיטוכונדריה של תאי סרטן הלבלב. מודגמת זרימת עבודה כללית עבור ניסויי השחזור התלת-ממדיים המתוארים בפרוטוקול זה. (A) תרבית של תאי סרטן הלבלב. (ב) הכנת גוש השרף. (C) איסוף מקטעים טוריים באמצעות אולטרה-מיקרוטום. (D) רכישת תמונות דו-ממדיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה. (E) מיקום המיטוכונדריה הממוקדת בתמונות SEM רציפות. (F) ניתוח המיטוכונדריה בתלת-ממד. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התקן להרכבת רצועות פרוסות רציפות על פרוסת סיליקון שעבר הידרופיליזציה. (A) מניפולטור זווית מתכוונן עם מלקחיים להחזקת רקיק. (B) מסגרת של מחזיק הפרוסות המונחת ליד האולטרה-מיקרוטום. (C) מיקום פרוסת הסיליקון בחריץ הכחול המכיל את סכין היהלום. (D) תקריב המראה את יחסי המיקום בין פרוסת הסיליקון לבין להב סכין היהלום. (E) רקיק סיליקון עם רצועות פרוסה המחוברות לשלב הדגימה של SEM עם דבק פחמן מוליך. (F) תקריב המציג את הסקירה הכללית של רצועות הפרוסה הטוריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תהליך הגדרת הפרמטרים ורכישת התמונות. (A) שורת התפריטים של FE-SEM (החץ מצביע על האפשרות H/L). (B) טבלת פרמטרים ותנאי הדמיה. (C) סקירה כללית של תמונות דו-ממדיות עוקבות בשלוש קבוצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מדריך שלב אחר שלב להדמיה של מיטוכונדריה בתלת-ממד באמצעות Amira. (A) ייבוא תמונות מתיקייה מסוימת. (B) יישור אוספי תמונות בהתאם למבנה היעד. (ג) פילוח והוספת אזור העניין. (ד) שחזור המבנה התלת-ממדי והוספת נתוני הכימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: המורפולוגיה הדו-ממדית והתלת-ממדית של מיטוכונדריה בכל קבוצה. המורפולוגיה הדו-ממדית של התא הסרטני של קבוצת הביקורת בהגדלה של פי 8,000 ו-(B) פי 15,000. (C) ייצוג תלת-ממדי של המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של קבוצת הביקורת. המורפולוגיה הדו-ממדית של התא הסרטני של קבוצת RSL3 בהגדלה של (D) פי 8,000 ו-(E) בהגדלה של פי 15,000. (F) ייצוג תלת-ממדי של המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של קבוצת RSL3. המורפולוגיה הדו-ממדית של התא הסרטני של קבוצת RSL3 + Fer-1 (מעכב) בהגדלה של פי 8,000 (G) ופי 15,000 (H). (I) ייצוג תלת-ממדי של המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של קבוצת RSL3 + Fer-1 (מעכב). הנתונים הכמותיים עבור אורך (J) ונפח ממוצע (K) של המיטוכונדריה בכל קבוצה. הבדלים משמעותיים מסומנים בכוכביות וחושבו באמצעות מבחן t של התלמיד (לעומת קבוצת ביקורת, *p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001.) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הבדלים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית של תאים סרטניים ברמות דו-ממדיות ותלת-ממדיות. (A) המורפולוגיה הדו-ממדית של תאי סרטן בקבוצת RSL3 בהגדלה של פי 8,000. (B) המורפולוגיה המיטוכונדריאלית הדו-ממדית בהגדלה גבוהה יותר. (C) ייצוג תלת-ממדי של מיטוכונדריה ספציפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטרים של הדמיה תנאים
גודל נתונים 1280 × 960
גודל פיקסל 12.40234
האצהמתח 2000 וולט
עבודהמרחק עבודה 3700μm
זרם פליטה 13700 nA
זרם קרן 10μA
צמצם מגביל זרם סורג מס '2 של FE-SEM
זמן להתעכב 32 μs/px
מספר התאים 107
כרכים מצולמים 10×8×2.66μm, 212.8μm³
10×8×3.01μm, 240.8μm³
10×8×3.08μm, 246.4μm³

טבלה 1: סיכום תנאי ההקלטה והפרמטרים של מערך הנתונים לרכישת התמונה.

איור משלים 1: סקירה כללית של תמונות של 38 מיקרומקטעים של תאים סרטניים מקבוצת הביקורת. מספר התמונה של כל מיקרו-חתך מסודר מלמעלה למטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: סקירה כללית של תמונות של 43 מיקרומקטעים של תאים סרטניים מקבוצת RSL3. מספר התמונה של כל מיקרו-חתך מסודר מלמעלה למטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: Oתצוגה של תמונות של 44 מיקרו-מקטעים של תאים סרטניים מקבוצת RSL3 + Fer-1 (מעכב). מספר התמונה של כל מיקרו-חתך מסודר מלמעלה למטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המוצגת כאן היא מדריך שימושי שלב אחר שלב ליישום טכניקת השחזור התלת-ממדי, הכוללת יישום מיקרוסקופ אלקטרונים וטכנולוגיית עיבוד תמונה לערימה וסגמנטציה של תמונות טומוגרפיות דו-ממדיות הנוצרות מקטעים אולטרה-דקים סדרתיים. פרוטוקול זה מדגיש מגבלה של תמונות דו-ממדיות שניתן לטפל בהן על ידי הדמיה תלת-ממדית של אולטרה-מבנה אברון, שיש לו את היתרונות של יכולת שחזור חזקה של המבנים ברמת רזולוציה גבוהה ודיוק גבוה יותר. חשוב מכך, הדמיה תלת ממדית זו יכולה להיות מיושמת על תאי הגידול כדי להפוך את המחקר של מנגנונים פתולוגיים פשוט יותר ואמין. טכניקה זו נבחנה בעבודה זו להדמיית המבנים הסטריאוסקופיים של הקריסטה המיטוכונדריאלית על ידי השוואת שלוש קבוצות של מקטעים טוריים בתנאים שונים, ובכך לאמת את פירוק קרום הקריסטה המיטוכונדריאלי המושרה על ידי RSL3 המתרחשת בתאי סרטן56. תוצאות אלה מספקות תובנות לגבי מנגנון הפעולה של RSL3 כתרופה נגד סרטן הלבלב.

רכישת תמונות דו-ממדיות ברזולוציה גבוהה ממלאת תפקיד חשוב בתהליך השחזור התלת-ממדי57 של הקריסטה המיטוכונדריאלית, ואיכות התמונה משפיעה ישירות על תוצאות השחזור 22,58. לכן, לשיטה זו יש גם כמה מגבלות, כגון תוצרי הטעינה שנוצרו בתמונות SEM59, אשר, בתורם, יכולים להוביל לפילוח שגוי של מבני המטרה. ניתן לפתור בעיה זו על ידי קיצור זמן סריקת הפרוסה, הצטיידות SEM במפצה מטען מוקד34,60, ושימוש בשיטת OTO, שעבורה השימוש ב- TCH יכול להפוך את הדגימה למוליכה יותר לאלקטרונים על ידי צביעה במתכות נוספות 61. הסתמכות על פילוח תמונה אוטומטי נוטה להיות לא מדויקת מבחינת קביעת היקף המבנה, בעוד פילוח ידני גוזל זמן58. לכן, על בסיס יתרון הסריקה המהירה של SEM למימוש אוסף תמונות62, ניתן להשתמש בסגמנטציה החצי אוטומטית בתוכנת אמירה כדי לאפשר הדמיה ושחזור יעילים; שימוש בתוכנת Amira יכול גם להפוך את התוצאה למדויקת ומדויקת יותר מאשר שימוש ב-FIJI וב-MIB63. שלב המפתח בהדמיה תלת-ממדית הוא רכישת מקטעים אולטרה-דקים. בעיות כגון השמטה, שבר ועיוות, המשפיעות על המשכיות התמונה, מתרחשות לעתים קרובות במהלך אוסף המקטעים. על מנת לפתור בעיות כגון אובדן ושבירה של פרוסות, השתמשנו בפרוסות סיליקון הידרופיליות כתמיכה לאיסוף רצועות הפרוסה.

למרות SBF-SEM ו- FIB-SEM יכול להפחית את העיוות או פגמים בסעיפים, טכניקות אלה יש מהירות הדמיה איטית, דורשים מכשירים יקרים, והם אינם מסוגלים לדמיין מחדש את המבנה של עניין64,65,66. FIB-SEM חסר יציבות מערכת במהלך ההדמיה, בעוד SBF-SEM מעוכב על ידי שלבי הכנת דגימה מסובכים וזרימת עבודה מייגעת34. לאחרונה, הדמיה מיקרוסקופית של דלדול פליטה מגורה (STED) יושמה בהדרגה לחקר המבנה המיטוכונדריאלי. שיטה זו מנטרת תמונות תלת-ממדיות בזמן אמת של קריסטות מיטוכונדריאליות בתאים חיים באמצעות בניית בדיקות לתיוג מיטוכונדריאלי67. תיוג צבע פלואורסצנטי יכול לחשוף את תהליכי השינוי באיחוי וביקוע מיטוכונדריאלי68. עם זאת, תאים חיים יש סובלנות מוגבלת לאור אינטנסיבי, ולכן קשה להשתמש בטכניקה זו לטווח ארוך STED הדמיה68. בנוסף, STED מוגבל על ידי הרזולוציה, עומק ההדמיה ומספר הפיקסל69.

בהשוואה לטכניקות אחרות, השימוש במקטעים אולטרה-דקים רציפים בשילוב עם טכנולוגיית שחזור תלת-ממדית כדי לצפות באולטרה-מבנה אברונים משדה ראייה רחב לא רק מאפשר הדמיה בתפוקה גבוהה בפרק זמן קצר, אלא גם מאפשר בחינה של תמונות ברזולוציה גבוהה של מבני מטרה בזמנים בדידים21ובכך לשפר את קצב ההדמיה ואת גמישות השיקום., יתר על כן, ניתן להמשיך ולבחון שינויים מורפולוגיים של אברונים וקשרים מרחביים עם אברונים אחרים. ניתן לכמת היבטים אלה, ולחשוף את מנגנוני השינוי בצורה מדויקת יותר על ידי שחזור אברונים סמוכים כדי להציג את יחסי המיקום שלהם70,71. טכנולוגיה זו של שחזור תלת-ממדי והדמיית חתך סדרתי באמצעות אמירה58 חושפת את הקשר בין מחלות לבין שינויים אולטרה-מבניים באברונים בקנה מידה ננומטרי72, נמצאת בשימוש נרחב ברפואה, ביולוגיה ותחומים אחרים, וסוללת את הדרך לפיתוח טיפולים חדשים ויעילים73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (Z23H290001, LY19H280001); מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82274364, 81673607 ו-81774011); וכן פרויקט מחקר רווחת הציבור של מענק המדע והטכנולוגיה של הוז'ו (2021GY49, 2018GZ24). אנו מעריכים את העזרה הרבה, התמיכה הטכנית והתמיכה הניסיונית מהפלטפורמה הציבורית של מרכז המחקר הרפואי, האקדמיה למדעי הרפואה הסינית, האוניברסיטה לרפואה סינית ג'ג'יאנג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).

Tags

חקר הסרטן גיליון 196 תא סרטן הלבלב מיטוכונדריה מבנה על שחזור תלת מימד מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הכנת דגימות OTO
טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong,… More

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter