Summary
Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.
Abstract
A compreensão das características dinâmicas da ultraestrutura da organela celular, que não é apenas rica em informações desconhecidas, mas também sofisticada de uma perspectiva tridimensional (3D), é fundamental para estudos mecanísticos. A microscopia eletrônica (ME) oferece boa profundidade de imagem e permite a reconstrução de pilhas de imagens de alta resolução para investigar a morfologia ultraestrutural de organelas celulares mesmo na escala nanométrica; portanto, a reconstrução 3D está ganhando importância devido às suas vantagens incomparáveis. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma tecnologia de aquisição de imagens de alto rendimento que permite reconstruir grandes estruturas em 3D a partir da mesma região de interesse em cortes consecutivos. Portanto, a aplicação da MEV na reconstrução 3D em larga escala para restaurar a verdadeira ultraestrutura 3D de organelas está se tornando cada vez mais comum. Neste protocolo, sugerimos uma combinação de técnicas seriadas de corte ultrafino e reconstrução 3D para estudar cristas mitocondriais em células de câncer de pâncreas. Os detalhes de como essas técnicas são realizadas são descritos neste protocolo de forma passo a passo, incluindo o método ósmio-tiocarboidrazida-ósmio (OTO), a imagem de corte ultrafino seriada e o visor de visualização.
Introduction
As mitocôndrias são uma das organelas mais importantes da célula. Eles servem como o centro central da bioenergética e metabolismo celular 1,2 e desempenham um papel crítico no câncer3. O câncer de pâncreas (CP) é um dos cânceres mais difíceis de tratar4 devido à sua rápida disseminação e alta taxa de mortalidade. A disfunção mitocondrial, causada principalmente por alterações namorfologia mitocondrial3,5,6,7, tem sido associada aos mecanismos patológicos subjacentes aos CP8. As mitocôndrias também são altamente dinâmicas, o que se reflete nas mudanças frequentes e dinâmicas na conectividade de sua rede e estrutura decristas9. A remodelagem da estrutura das cristas pode afetar diretamente a função mitocondrial e o estadocelular10,11, que são significativamente alterados durante o crescimento das células tumorais, metástases e alterações no microambiente tumoral12,13.
Nos últimos anos, cientistas têm estudado essa organela utilizando a observação de EM14,15,16,17; por exemplo, pesquisadores analisaram a dinâmica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrução 3D 6,7,18,19. O conceito geral e o método para a reconstrução 3D de imagens de microscopia eletrônica foram formalmente estabelecidos já em 196820 e envolveram a combinação de microscopia eletrônica, difração de elétrons e processamento de imagens por computador para reconstruir a cauda do fago T4. Até o momento, a tecnologia de imagem 3D por microscopia eletrônica tem feito avanços significativos em termos de resolução de imagem21, grau de automação22 e volume de processamento23 e tem sido usada em escala cada vez mais ampla em pesquisas biológicas, desde o nível tecidual até o nível de ultraestrutura da organela na escala nanométrica24. Nos últimos anos, a microscopia eletrônica 3D também se tornou uma tecnologia promissora para uma ampla gama de aplicações25,26,27.
A crescente atenção às cristas mitocondriais ilustra particularmente os requisitos essenciais para a imagem volumétrica ultraestrutural. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) tem sido utilizada para visualizar amostras coletadas em uma grade de cobre (400 mesh)28, com o feixe de elétrons passando pela seção. No entanto, devido ao alcance limitado da grade de cobre, é impossível obter imagens completas de cortes contínuos de uma mesma amostra29. Isso dificulta o estudo das estruturas-alvo durante a aquisição de imagens por TEM. Além disso, a ETM depende de tarefas manuais demoradas e propensas a erros, incluindo corte e coleta de múltiplos cortes e obtenção de imagens sequencialmente21, não sendo adaptada para reconstruções ultraestruturais de amostras de grande volume23. Atualmente, a reconstrução de alta resolução de imagens de amostras de grande volume é obtida por meio do uso de equipamentos especializados, como o TEMCA camera array (TEMCA)30 ou dois sistemas TEMCA de segunda geração (TEMCA2)31, que permitem imagens automatizadas de alto rendimento em um curto espaço de tempo. Entretanto, este tipo de imagem não tem a vantagem de ser de fácil obtenção e universal devido à necessidade de equipamentos personalizados.
Em comparação com o TEM, o método de geração automática de milhares de imagens volumétricas seriais para grandes áreas baseado no SEM 32,33 aumenta a eficiência e a confiabilidade das imagens seriais e oferece resoluções z mais altas34. Por exemplo, a microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM) e a microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) possibilitaram a reconstrução 3D de ultraestrutura com alta velocidade, eficiência e resolução35,36. Entretanto, é inevitável que a superfície do bloco seja raspada mecanicamente pelo bisturi de diamante do MEV-SBF ou pela fresagem com o feixe de íons focalizado do FIB-MEV33,37. Devido à destrutividade dos dois métodos para as amostras, não é possível reconstruir novamente a mesma estrutura alvo para análisesposteriores 38,39,40. Além disso, poucos estudos tentaram reconstruir a ultraestrutura da organela 3D de células cancerosas usando EM para observar alteraçõespatológicas12. Por estas razões, a fim de elucidar melhor os mecanismos patológicos de células cancerosas, como células cancerosas pancreáticas, propomos uma nova tecnologia para a reconstrução 3D de imagens de cortes seriados usando um ultramicrótomo e um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (MEV-FE) para analisar a ultraestrutura mitocondrial em nível de cristas; Com essa tecnologia, dados de alta resolução podem ser adquiridos por meio de um método eficiente e acessível. As seções ultrafinas seriais feitas usando um ultramicrótomo podem ser armazenadas semi-permanentemente em uma caixa de grade e recriadas várias vezes, mesmo após vários anos41. A MEF-FE é altamente valorizada como ferramenta em vários campos de pesquisa devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução, alta magnificação e versatilidade42. Na tentativa de exibir a estrutura fina das organelas em 3D, a técnica para produzir pilhas de imagens 2D seriadas com resolução útil usando elétrons retroespalhados produzidos por FE-SEM 43,44 também pode ser usada para obter imagens de alto rendimento e multiescala de regiões alvo ou suas estruturas associadas sem equipamentos especiais 45. A geração de artefatos de carga afeta diretamente a qualidade das imagens adquiridas, por isso é particularmente importante manter o tempo de permanência curto.
Assim, o presente estudo elabora os procedimentos experimentais empregados nesta técnica de MEV para reconstruir a estrutura 3D das cristas mitocondriais46. Especificamente, mostramos o processo desenvolvido para alcançar a segmentação semiautomática das regiões mitocondriais e digitalizar a reconstrução 3D usando o software Amira, que também envolve a confecção de amostras de corte usando o método convencional de preparação de espécimes OTO44,47, completar a coleta de cortes usando fatiamento de ultramicrótomos e adquirir dados sequenciais 2D por MEV-FE.
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Protocol
1. Preparação do material
- Cultivar 2 x 106 células Panc02 em 12 mL de meio DMEM (10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), e manter a 37 °C e 95% de umidade em atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 48 h.
- Recolher células de Panc02, centrifugar a 28 x g durante 2 minutos e, em seguida, eliminar o sobrenadante. Certifique-se de que a amostra tem um tamanho adequado (1 x 107 células), caso contrário, as seguintes etapas de fixação e desidratação não funcionarão bem.
- Adicionar 1 mL de glutaraldeído a 2,5% como fixador para fixar as células frescas de Panc02 nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL durante a noite a 4 °C.
NOTA: As amostras precisam ser centrifugadas a 1.006 x g por 5 min em cada uma das etapas a seguir (etapas 1.3-1.11). - Aspirar o fixador, enxaguar as amostras duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS) e, em seguida, enxaguar duas vezes com água bidestilada (ddH2O) à temperatura ambiente por 10 min cada.
- Adicionar 50 μL de uma solução contendo tetróxido de ósmio a 1% (OsO 4) e ferrocianeto de potássio a 1,5% na proporção de 1:1 a4 °C durante 1 h. Em seguida, enxágue duas vezes com PBS 0,1 M por 10 min de cada vez e enxágue com ddH2O por mais 10 min.
- Adicionar 1 mL de tiocarboidrazida (TCH) a 1%, incubar à temperatura ambiente por 30 min a 1 h e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes por 10 min de cada vez.
- Adicionar 50 μL de OsO4 a 1%, fixar à temperatura ambiente durante 1 h e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes durante 10 min de cada vez.
- Adicionar 1 ml de acetato de uranila a 2% a 4 °C durante a noite e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes durante 10 minutos de cada vez.
- Adicionar 1 ml de solução de Walton (0,066 g de nitrato de chumbo dissolvido em 10 ml de solução-mãe de ácido aspártico 0,03 mol/L) a 60 °C para mais 1 h de incubação.
- Enxágue com ddH2O quatro vezes por 10 min cada vez e, em seguida, desidrate em uma série de álcool graduado por 10 min cada vez: álcool 50%, álcool 70%, álcool 80% e álcool 90% 1x e álcool 100% 2x. Em seguida, desidratar em acetona 100% duas vezes por 10 min cada vez. Use 1 mL de cada solução para a desidratação.
- Misturar 200 μL de acetona com a resina epóxi Pon 812 na proporção de 3:1, 1:1 e 1:3. Mergulhe a amostra em resina à temperatura ambiente por 2 h, 4 h e 4 h, respectivamente, e depois tome a resina epóxi 100% Pon 812 para impregnar durante a noite.
OBS: Ao realizar as etapas de coloração e incorporação de resina, é importante operar em uma capela de fumaça, pois são substâncias tóxicas. Além disso, jalecos e luvas resistentes a solventes devem ser usados durante o experimento. - Coloque os espécimes em um molde de incorporação e, em seguida, coloque em um forno a 60 °C por 48 h para polimerizar. Use a incorporação plana29 para reduzir a aparência de resina ao redor da amostra. Isso simplifica a instalação da amostra e diminui o impacto dos artefatos de carregamento na segmentação subsequente da imagem.
OBS: Para posteriormente gerar uma superfície de corte horizontal, uma pequena quantidade de resina pode ser adicionada ao orifício do molde, tomando cuidado para não enchê-lo demais. - Prepare wafers de silício primeiro lavando-os e depois hidrofilizando com uma solução concentrada de H 2 SO4/H 2O2por 30 min. Recolher em série tiras cortadas com uma espessura de 70 nm sobre os wafers de silício hidrofilizados utilizando um ultramicrótomo e secá-las num forno a 60 °C durante 10 min.
NOTA: Capture lentamente a fatia à medida que a fatia flutua para a superfície dos wafers para evitar a perda ou deformação da fatia.
2. Aquisição de imagens e reconstrução tridimensional
- Antes de montar um wafer de silicone no palco, lave as seções com água destilada três vezes e seque-as ao ar. Corte uma fita de carbono condutora com o tamanho de 1 cm x 0,5 cm e cole-a entre o wafer de silício e o estágio da amostra de MEV para completar a configuração da amostra (Figura 2E).
- Ajuste o parâmetro de tensão de aceleração FE-MEV para 2 kV com uma distância de trabalho de 4 mm (Figura 3B e Tabela 1).
NOTA: Para melhorar a relação sinal-ruído e reduzir o ruído na imagem, observe em baixas ampliações sempre que possível. À medida que o múltiplo aumenta, o alcance de varredura do MEV diminui, levando a um aumento no acúmulo de carga nas imagens. - Clique no ícone H/L na barra de menu superior. Primeiro, em baixa ampliação, oriente a primeira seção das tiras de corte de destino e, em seguida, clique novamente na opção H/L (Figura 3A) para alternar para o modo de alta magnificação; Colete uma imagem apropriada para a estrutura de interesse ajustando o brilho, o contraste e a ampliação da imagem.
- Selecione Exibição de projeto > Dados abertos e importe os arquivos de imagem a serem analisados para o software.
- Alinhe as imagens clicando em Align Slices > Edit (Figura 4B) e ajuste o valor Intensity Range na barra de menus inferior esquerda modificando a transparência da imagem. Aqui, use uma estratégia de alinhamento semiautomático; Especificamente, por meio do alinhamento automático, faça com que as imagens se sobreponham a uma imagem anterior e, em seguida, execute o ajuste fino manual.
NOTA: Neste trabalho, durante o processo de alinhamento, a imagem anterior foi utilizada como referência, e as operações mover e girar foram utilizadas para sobrepor ao máximo a estrutura alvo das duas imagens. Clicar em Alinhar par de fatias atual pode ajudar a alinhar as imagens automaticamente, mas pode ocorrer um extravio. - Selecione o módulo Extrair Subvolume e recorte os conjuntos de dados alinhados para ajustar o tamanho da parte sobreposta de toda a pilha.
- Na subseção Segmentação (Figura 4C), selecione Resample > Segmentation > Save. Escolha o limite da Varinha Mágica e o tamanho da ferramenta Pincel para selecionar o intervalo correto. Aqui, novamente, adote um método de segmentação semiautomático usando primeiro a Varinha Mágica para selecionar automaticamente uma grande área adequada e, em seguida, use o Pincel para descrever com precisão os detalhes.
NOTA: A Varinha Mágica pode ser aplicada a imagens de segmento com base nas diferenças óbvias na intensidade de pixel existentes entre a estrutura de interesse e as estruturas circundantes, alterando o valor de mascaramento e usando a Linha de Limite de Desenho. É incapaz de distinguir os artefatos de carregamento gerados durante a aquisição da imagem. Portanto, pode resultar em segmentação incorreta para as regiões-alvo. A ferramenta Pincel pode ser usada para segmentar manualmente para reconstruir com precisão as estruturas biológicas. - Em Segmentação > Seleção, clique no ícone + para adicionar a área selecionada (Figura 4C).
- Repita o passo acima (2.8) para selecionar a mesma estrutura alvo em imagens diferentes até que a seleção esteja completa para reconstruir as microestruturas de interesse.
NOTA: Durante os processos de remodelação mitocondrial, a seleção do objeto alvo deve ser realizada a partir da figura no meio de um grupo de imagens sequenciais. Se a área necessária for selecionada a partir da primeira ou da última imagem, o resultado da reconstrução não será capaz de apresentar uma visualização 3D completa. - Após concluir a segmentação regional, gere o arquivo de imagem de acordo com os melhores resultados para o tamanho do objeto e a resolução da imagem. Clique em Crop Editor e digite o número 6 na caixa Virtual Slider (Figura 4C).
- No menu suspenso à esquerda, clique com o botão direito do mouse na área cinza sob a subseção Projeto e selecione Gerar superfície > Criar > aplicar. No arquivo gerado, use o módulo Surface View para criar a estrutura da superfície e a representação 3D.
3. Quantificação
- Clique em Remover pequenos pontos > aplicar (Figura 4D). Na subseção Project , clique com o botão direito do mouse na área cinza e selecione Label Analysis > Apply (Figura 4D).
- Personalize o nome da coluna e escolha um grupo de medidas. Selecione Volume3d e Length3d na caixa Medidas nativas.
- Clique no botão Aplicar no canto inferior esquerdo da tela. Copie os dados e o gráfico no software estatístico, como o GraphPad.
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Representative Results
Durante a cultura celular (Figura 1A), primeiramente dividimos as células de câncer de pâncreas em um grupo controle cultivado com meio de cultura completo, um grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, um ativador de ferroptose, 100 nM) e um grupo RSL3 (100 nM) mais ferrostatina-149 (Fer-1, um inibidor de ferroptose, 100 nM). Através das etapas experimentais acima, o microscópio eletrônico de varredura adquiriu 38 (Figura Suplementar 1), 43 (Figura Suplementar 2) e 44 (Figura Suplementar 3) imagens sequenciais para o grupo controle, grupo RSL3 e grupo inibidor (grupo RSL3 + Fer-1), respectivamente. As imagens de 1.280 x 960 pixels foram capturadas com aumento de 8.000 vezes (com resolução de 12,40 nm/pixel). Tanto rugas quanto poluição na área celular não foram observadas acima dos cortes. As imagens de microscopia eletrônica puderam distinguir claramente as organelas, como a mitocôndria e o retículo endoplasmático, nas células (Figura 1E).
A observação das imagens 2D por MEF-MEV mostrou que, no grupo controle de células cancerosas (Figura 5A), as mitocôndrias estavam distribuídas por todo o citoplasma, sendo a maioria esférica ou oval e uniformemente rechonchuda. Além disso, a arquitetura relativamente regular e alongada das cristas era claramente visível. Por outro lado, no grupo RSL3 (Figura 5D), a maioria das mitocôndrias exibiu uma morfologia encolhida, um aumento na densidade da membrana e uma estrutura de cristas comparativamente vaga. Uma inspeção mais detalhada das imagens de MEV (Figura 5E) revelou que nem todas as cristas mitocondriais degeneraram ou desapareceram, pois um número relativamente pequeno de cristas permaneceu intacto. Em comparação com o grupo RSL3, no grupo inibidor, a maioria das mitocôndrias manteve a estrutura integral das cristas mitocondriais, e apenas uma minoria das estruturas das cristas mitocondriais não era aparente (Figura 5G).
Embora as informações 2D mostrem diferenças na morfologia mitocondrial, às vezes podem resultar em uma compreensão enviesada da estrutura 3D detalhada e real50,51. As estruturas das cristas do grupo controle na condição 3D (Figura 5C) foram consistentes com as imagens 2D, mas foram diferentes para o grupo RSL3. Para este grupo, a presença de cristas mitocondriais completas também pôde ser observada nas imagens 2D (Figura 5E), mas as mitocôndrias sob 3D (Figura 5F) estavam irregulares e geralmente vacuolizadas no meio. O grupo inibidor (Figura 5I) apresentou diversas formas de cristas, com apenas algumas cristas mitocondriais exibindo colapso localizado. Assim, a partir dos resultados do grupo RSL3, pode-se observar que apenas o uso da análise 2D pode levar a uma compreensão unilateral dos resultados. Os resultados das imagens 2D são tendenciosos em relação aos resultados apresentados ao empilhar um conjunto de imagens para exibição 3D, não sendo possível generalizar os resultados produzidos apenas através de informações 2D. Para demonstrar de forma mais objetiva os efeitos da LSR3 nas mitocôndrias, dados de reconstrução 3D foram utilizados para quantificar e medir as alterações mitocondriais52. Em comparação com o grupo controle, o comprimento e o volume das mitocôndrias 3D no grupo RSL3 foram significativamente reduzidos, mas os resultados de quantificação do grupo inibidor caíram entre os resultados dos outros dois grupos (Figura 5J,K). Esses dados quantitativos sugerem que o RSL3 produz mitocôndrias menores e degradadas, e a adição de inibidores reduz esse efeito.
Como mostrado na Figura 6B e Figura 6C, determinou-se que o indutor de ferroptose RSL3 causou disfunção mitocondrial e afetou o metabolismo celular, alterando a morfologia mitocondrial 53,54 e provocando ferroptose, o que pode representar uma forma ubíqua de morte celular dinâmica na terapia do câncer induzida porRSL3 55.
Figura 1: Fluxo de trabalho geral para a reconstrução 3D de mitocôndrias de células de câncer de pâncreas. Um fluxo de trabalho geral para os experimentos de reconstrução 3D descritos neste protocolo é demonstrado. (A) Cultura de células de câncer de pâncreas. (B) Preparo do bloco de resina. (C) Coleta de cortes seriados com ultramicrótomo. (D) Aquisição de imagens 2D utilizando microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo. (E) Posicionamento da mitocôndria alvo nas imagens sequenciais de MEV. (F) Análise das mitocôndrias em 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dispositivo para montagem de tiras de corte de fatias contínuas em wafer de silicone hidrofilizado. (A) Um manipulador de ângulo ajustável com pinça para segurar a bolacha. (B) Quadro do suporte de wafer colocado ao lado do ultramicrótomo. (C) Posicionamento do wafer de silicone na ranhura azul que contém a faca diamantada. (D) Um close-up mostrando a relação posicional entre o wafer de silicone e a lâmina da faca de diamante. (E) Um wafer de silício com tiras de corte presas ao estágio de amostragem da MEV com cola de carbono condutora. (F) Um close-up mostrando a visão geral das tiras de fatiamento serial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Processo de definição dos parâmetros e aquisição das imagens. (A) A barra de menus do FE-SEM (a seta aponta para a opção H/L). (B) Tabela de parâmetros e condições de imagem. (C) Visão geral de imagens 2D consecutivas em três grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Um guia passo-a-passo para visualizar mitocôndrias em 3D usando Amira. (A) Importar imagens de uma pasta específica. (B) Alinhamento das pilhas de imagens de acordo com a estrutura alvo. (C) Segmentação e adição da região de interesse. (D) Reconstruir a estrutura 3D e adicionar os dados de quantificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Morfologia 2D e 3D das mitocôndrias em cada grupo. A morfologia das células cancerosas 2D do grupo controle em (A) aumento de 8.000 vezes e (B) aumento de 15.000 vezes. (C) Representação 3D da morfologia mitocondrial do grupo controle. A morfologia das células cancerosas 2D do grupo RSL3 em (D) aumento de 8.000 vezes e (E) aumento de 15.000 vezes. (F) Representação 3D da morfologia mitocondrial do grupo RSL3. A morfologia das células cancerosas 2D do grupo RSL3 + Fer-1 (inibidor) em (G) aumento de 8.000 vezes e (H) aumento de 15.000 vezes. (I) Representação 3D da morfologia mitocondrial do grupo RSL3 + Fer-1 (inibidor). Os dados quantitativos para o (J) comprimento e (K) volume médio das mitocôndrias em cada grupo. Diferenças significativas são indicadas com asteriscos e foram calculadas usando o teste t de Student (vs. grupo controle, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diferenças na morfologia mitocondrial das células cancerosas em níveis 2D e 3D. (A) A morfologia das células cancerosas 2D do grupo RSL3 com aumento de 8.000 vezes. (B) A morfologia mitocondrial 2D em maior aumento. (C) Uma representação 3D de mitocôndrias específicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros de imagem | Condições |
| DataSize | 1280 × 960 |
| Tamanho do pixel | 12.40234 |
| Acelerando a tensão | 2000 Volts |
| Distância de trabalho | 3700μm |
| EmissãoCorrente | 13700 nA |
| Corrente do feixe | 10μA |
| Abertura limitante de corrente | Grade nº 2 de FE-SEM |
| Tempo de permanência | 32 μs/px |
| Número de células | 107 |
| Volumes com imagens | 10×8×2,66μm, 212,8μm³ |
| 10×8×3,01μm, 240,8μm³ | |
| 10×8×3,08μm, 246,4μm³ |
Tabela 1: Resumo das condições de registro e dos parâmetros do conjunto de dados para a aquisição das imagens.
Figura suplementar 1: Visão geral das imagens de 38 microseções de células cancerosas do grupo controle. O número da imagem de cada microseção é organizado de cima para baixo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Visão geral das imagens de 43 microseções de células cancerosas do grupo RSL3. O número da imagem de cada microseção é organizado de cima para baixo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 3:Verview das imagens de 44 microsecções de células cancerosas do grupo RSL3 + Fer-1 (inibidor). O número da imagem de cada microseção é organizado de cima para baixo. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O método aqui apresentado é um guia passo-a-passo útil para a aplicação da técnica de reconstrução 3D, que envolve a aplicação de microscopia eletrônica e tecnologia de processamento de imagens para o empilhamento e segmentação de imagens tomográficas 2D geradas a partir de cortes ultrafinos seriados. Este protocolo destaca uma limitação das imagens 2D que pode ser abordada pela visualização 3D da ultraestrutura da organela, que tem como vantagens a forte reprodutibilidade das estruturas em nível de alta resolução e maior precisão. Mais importante, esta visualização 3D pode ser aplicada a células tumorais para tornar o estudo de mecanismos patológicos mais simples e confiável. Esta técnica foi examinada neste trabalho para visualizar as estruturas estereoscópicas das cristas mitocondriais, comparando três conjuntos de cortes seriados sob diferentes condições, validando assim a degradação da membrana das cristas mitocondriais induzida por RSL3 que ocorre em célulascancerosas56. Estes resultados fornecem informações sobre o mecanismo de ação do RSL3 como uma droga anti-câncer pancreático.
A aquisição de imagens 2D de alta resolução desempenha um papel importante no processo de reconstrução 3D57 de cristas mitocondriais, e a qualidade da imagem afeta diretamente os resultados da reconstrução 22,58. Portanto, esse método também apresenta algumas limitações, como os artefatos de carregamento gerados nas imagens de MEV59, que, por sua vez, podem levar à segmentação incorreta das estruturas alvo. Este problema pode ser resolvido encurtando o tempo de varredura de corte, equipando a MEV com um compensador de carga focal34,60 e usando o método OTO, para o qual o uso de TCH pode tornar a amostra mais condutora de elétrons pela coloração com metais adicionais 61. Confiar na segmentação automática de imagens tende a ser impreciso em termos de determinar o escopo da estrutura, enquanto a segmentação manual é demorada58. Portanto, com base na vantagem de varredura rápida do MEV para realizar a coleta de imagens62, a segmentação semi-automatizada no software Amira pode ser usada para permitir imagens e reconstrução eficientes; usando o software Amira também pode tornar o resultado mais preciso e preciso do que usando FIJI e MIB63. O passo chave na imagem 3D é a aquisição de seções ultrafinas. Problemas como omissão, fratura e distorção, que afetam a continuidade da imagem, geralmente ocorrem durante a coleta de seções. Para solucionar problemas como a perda e quebra de fatias, utilizamos wafers de silicone hidrofilizados como suporte para a coleta das tiras de corte.
Embora a MEV-SBF e a MEV-FIB possam reduzir a deformação ou defeitos nos cortes, essas técnicas têm baixa velocidade de imagem, requerem instrumentais caros e são incapazes de recriar imagens da estrutura de interesse64,65,66. A FIB-MEV não tem estabilidade do sistema durante a aquisição de imagens, enquanto a MEV-SBF é prejudicada por etapas complicadas de preparação de amostras e um fluxo de trabalho tedioso34. Recentemente, imagens microscópicas de depleção de emissão estimulada (STED) têm sido gradualmente aplicadas ao estudo da estrutura mitocondrial. Este método monitora imagens 3D em tempo real de cristas mitocondriais em células vivas através da construção de sondas para marcação mitocondrial67. A marcação de corantes fluorescentes pode revelar os processos de mudança nas cristas durante a fusão e fissão mitocondrial68. No entanto, as células vivas têm tolerância limitada à luz intensa, por isso é difícil usar essa técnica em imagens de STED a longo prazo68. Além disso, o STED é restrito por sua resolução, profundidade de imagem e númerode pixel 69.
Em comparação com outras técnicas, o uso de cortes ultrafinos contínuos combinados com a tecnologia de reconstrução 3D para observar a ultraestrutura da organela a partir de um amplo campo de visão não só permite imagens de alto rendimento em um curto período de tempo, mas também permite o exame de imagens de alta resolução de estruturas-alvo em tempos discretos21, melhorando assim a velocidade de imagem e a flexibilidade da reconstrução. Além disso, mudanças morfológicas da organela e conexões espaciais com outras organelas podem ser examinadas. Esses aspectos podem ser quantificados, e os mecanismos de mudança podem ser revelados com maior precisão reconstruindo organelas adjacentes para mostrar suas relações posicionais70,71. Essa tecnologia de reconstrução 3D e imagens seriadas utilizando Amira58 revela a correlação entre doenças e alterações ultraestruturais da organela na nanoescala 72, tem sido amplamente utilizada na medicina, biologia e outros campos, e abre caminho para o desenvolvimento de novas terapêuticas eficazes73,74.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); Subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274364, 81673607 e 81774011); bem como o Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público da Bolsa de Ciência e Tecnologia de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Agradecemos a grande ajuda, suporte técnico e suporte experimental da Plataforma Pública do Centro de Pesquisa Médica, Academia de Ciências Médicas Chinesas, Universidade Médica Chinesa de Zhejiang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetone | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
| Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
| Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
| Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
| Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
| Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
| Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 |
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