Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man rekonstruerer mitokondriell cristae for å oppnå 3D-avbildning med høy nøyaktighet, høy oppløsning og høy gjennomstrømning.
Abstract
Å forstå de dynamiske egenskapene til celleorganellens ultrastruktur, som ikke bare er rik på ukjent informasjon, men også sofistikert fra et tredimensjonalt (3D) perspektiv, er avgjørende for mekanistiske studier. Elektronmikroskopi (EM) gir god bildedybde og muliggjør rekonstruksjon av høyoppløselige bildestabler for å undersøke den ultrastrukturelle morfologien til cellulære organeller selv på nanometerskalaen; Derfor får 3D-rekonstruksjon betydning på grunn av sine uforlignelige fordeler. Skanning elektronmikroskopi (SEM) gir en høy gjennomstrømnings bildeinnsamlingsteknologi som gjør det mulig å rekonstruere store strukturer i 3D fra samme område av interesse i påfølgende skiver. Derfor blir anvendelsen av SEM i storskala 3D-rekonstruksjon for å gjenopprette den sanne 3D-ultrastrukturen til organeller stadig mer vanlig. I denne protokollen foreslår vi en kombinasjon av seriell ultratynnsnitt og 3D-rekonstruksjonsteknikker for å studere mitokondriell cristae i kreftceller i bukspyttkjertelen. Detaljer om hvordan disse teknikkene utføres er beskrevet i denne protokollen på en trinnvis måte, inkludert osmium-tiokarbohydrazid-osmium (OTO) -metoden, seriell ultratynnseksjonsavbildning og visualiseringsvisningen.
Introduction
Mitokondrier er en av de viktigste organellene i cellen. De tjener som det sentrale knutepunktet for cellulær bioenergetikk og metabolisme 1,2 og spiller en kritisk rolle i kreft3. Kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en av de vanskeligste kreftformene4 å behandle på grunn av rask spredning og høy dødelighet. Mitokondriell dysfunksjon, som hovedsakelig skyldes endringer i mitokondriell morfologi 3,5,6,7, har vært knyttet til sykdomsmekanismene bak PC 8. Mitokondrier er også svært dynamiske, noe som gjenspeiles av de hyppige og dynamiske endringene i nettverkstilkoblingen og cristae-strukturen9. Omformingen av cristae-strukturen kan direkte påvirke mitokondriefunksjonen og cellulær tilstand10,11, som er betydelig endret under tumorcellevekst, metastase og tumormikromiljøendringer12,13.
De siste årene har forskere studert denne organellen ved hjelp av EM-observasjon14,15,16,17; for eksempel har forskere analysert mitokondriedynamikken ved hjelp av 3D-rekonstruksjonsteknikker 6,7,18,19. Det generelle konseptet og metoden for 3D-rekonstruksjon av elektronmikroskopibilder ble formelt etablert allerede i 1968-20 og involverte å kombinere elektronmikroskopi, elektrondiffraksjon og databildebehandling for å rekonstruere T4-faghalen. Hittil har elektronmikroskopi 3D-bildebehandlingsteknologi gjort betydelige fremskritt når det gjelder bildeoppløsning21, grad av automatisering 22 og prosesseringsvolum 23 og har blitt brukt i stadig bredere skala i biologisk forskning, fra vevsnivå til organell ultrastrukturnivå på nanometerskala24. I de senere år har elektronmikroskopi 3D-avbildning også blitt en lovende teknologi for et bredt spekter av applikasjoner25,26,27.
Den økende oppmerksomheten på mitokondriell cristae illustrerer spesielt de essensielle kravene til ultrastrukturell volumavbildning. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) har blitt brukt til å visualisere prøver samlet på et kobbergitter (400 mesh)28, med elektronstrålen som passerer gjennom seksjonen. På grunn av kobbergitterets begrensede rekkevidde er det imidlertid umulig å avbilde kontinuerlige skiver av samme prøve29. Dette kompliserer studiet av målstrukturer under TEM-avbildning. I tillegg er TEM avhengig av tidkrevende og feilutsatte manuelle oppgaver, inkludert kutting og innsamling av flere stykker og avbildning av dem sekvensielt21, så det er ikke tilpasset ultrastrukturelle rekonstruksjoner av store volumprøver23. For tiden oppnås høyoppløselig rekonstruksjon av storvolumprøveavbildning ved bruk av spesialutstyr, for eksempel TEM camera array (TEMCA) 30 eller to andre generasjons TEMCA-systemer (TEMCA2) 31, som muliggjør automatisert høy gjennomstrømningsavbildning på kort tid. Denne typen bildebehandling har imidlertid ikke fordelen av å være lett å få tak i og universell på grunn av kravet til tilpasset utstyr.
Sammenlignet med TEM forbedrer metoden for automatisk generering av tusenvis av serielle volumetriske bilder for store områder basert på SEM 32,33 effektiviteten og påliteligheten til seriell bildebehandling og gir høyere z-oppløsninger34. For eksempel har seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) og fokusert ionstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) begge gjort det mulig å oppnå 3D-rekonstruksjon av ultrastruktur med høy hastighet, effektivitet og oppløsning35,36. Det er imidlertid uunngåelig at blokkoverflaten blir mekanisk barbert av diamantkniven til SBF-SEM eller ved fresing med den fokuserte ionstrålen til FIB-SEM33,37. På grunn av destruktiviteten til de to metodene for prøvene, er det ikke mulig å rekonstruere den samme målstrukturen igjen for videre analyse38,39,40. I tillegg har få studier forsøkt å rekonstruere 3D-organell ultrastruktur av kreftceller ved hjelp av EM for å observere patologiske endringer12. Av disse grunner, for ytterligere å belyse de patologiske mekanismene til kreftceller, som kreftceller i bukspyttkjertelen, foreslår vi en ny teknologi for 3D-rekonstruksjon av serielle seksjonsbilder ved hjelp av et ultramikrotome og et feltutslippsskanningelektronmikroskop (FE-SEM) for å analysere mitokondriell ultrastruktur på cristae-nivået; Med denne teknologien kan høyoppløselige data samles inn ved hjelp av en effektiv og tilgjengelig metode. De serielle ultratynne seksjonene laget ved hjelp av en ultramikrotome kan lagres semi-permanent i et rutenett og reimaged flere ganger, selv etter flere år41. FE-SEM er høyt verdsatt som et verktøy i ulike forskningsfelt på grunn av sin evne til å gi høyoppløselig bildebehandling, høy forstørrelse og allsidighet42. I et forsøk på å vise den fine strukturen til organeller i 3D, kan teknikken for å produsere serielle 2D-bildestabler med nyttig oppløsning ved bruk av tilbakespredte elektroner produsert av FE-SEM 43,44 også brukes til å oppnå høy gjennomstrømning og multiskala avbildning av målregioner eller deres tilhørende strukturer uten spesialutstyr 45. Genereringen av ladningsartefakter påvirker direkte kvaliteten på de oppkjøpte bildene, så det er spesielt viktig å holde oppholdstiden kort.
Dermed utdyper denne studien de eksperimentelle prosedyrene som brukes i denne SEM-teknikken for å rekonstruere 3D-strukturen til mitokondriell cristae46. Spesielt viser vi prosessen utviklet for å oppnå halvautomatisk segmentering av mitokondrieregioner og digitalisere 3D-rekonstruksjonen ved hjelp av Amira-programvare, som også innebærer å lage skiveprøver ved hjelp av den konvensjonelle OTO-prøveprepareringsmetoden44,47, fullføre seksjonssamlingen ved hjelp av ultramikrotomskiver og skaffe sekvensielle 2D-data ved FE-SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materiell forberedelse
- Dyrkning 2 x 106 Panc02-celler i 12 ml DMEM-medium (10 % føtalt bovint serum og 100 U/ml penicillin-streptomycin), og opprettholdes ved 37 °C og 95 % luftfuktighet i en atmosfære med 5 % karbondioksid og 95 % luft i 48 timer.
- Samle Panc02-celler, sentrifuge ved 28 x g i 2 minutter, og kast deretter supernatanten. Forsikre deg om at prøven er av passende størrelse (1 x 107 celler), ellers vil følgende fikserings- og dehydreringstrinn ikke fungere bra.
- Tilsett 1 ml 2,5 % glutaraldehyd som fikseringsmiddel for å feste de friske Panc02-cellene i 1,5 ml mikrosentrifugerørene over natten ved 4 °C.
MERK: Prøvene må sentrifugeres ved 1006 x g i 5 minutter i hvert av de følgende trinnene (trinn 1,3-1,11). - Aspirer fiksativet, og skyll prøvene to ganger med 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS), og skyll deretter to ganger med dobbeltdestillert vann (ddH2O) ved romtemperatur i 10 min hver.
- Tilsett 50 mikrol av en oppløsning inneholdende 1 % osmiumtetroxid (OsO 4) og 1,5 % kaliumferrocyanid i forholdet 1:1 ved4 °C i 1 time. Skyll deretter to ganger med 0,1 M PBS i 10 min hver gang, og skyll med ddH2O i ytterligere 10 min.
- Tilsett 1 ml 1% tiokarbohydrazid (TCH), inkuber ved romtemperatur i 30 minutter til 1 time, og skyll deretter med ddH2O fire ganger i 10 minutter hver gang.
- Tilsett 50 μL 1% OsO4, fiks ved romtemperatur i 1 time, og skyll deretter med ddH2O fire ganger i 10 min hver gang.
- Tilsett 1 ml 2% uranylacetat ved 4 °C over natten, og skyll deretter med ddH2O fire ganger i 10 min hver gang.
- Tilsett 1 ml Walton-oppløsning (0,066 g blynitrat oppløst i 10 ml 0,03 mol/l asparaginsyreoppløsning) ved 60 °C i ytterligere 1 time inkubasjon.
- Skyll med ddH2O fire ganger i 10 min hver gang, og dehydrer deretter i en gradert alkoholserie i 10 min hver gang: 50% alkohol, 70% alkohol, 80% alkohol og 90% alkohol 1x og 100% alkohol 2x. Dehydrer deretter i 100% aceton to ganger i 10 minutter hver gang. Bruk 1 ml av hver løsning for dehydrering.
- Bland 200 μL aceton med Pon 812 epoksyharpiks i forholdet 3: 1, 1: 1 og 1: 3. Bløtlegg prøven i harpiks ved romtemperatur i henholdsvis 2 timer, 4 timer og 4 timer, og ta deretter 100 % Pon 812 epoksyharpiks for å impregnere over natten.
MERK: Når du utfører trinnene for fargelegging og harpiksinnebygging, er det viktig å operere i en avtrekkshette, da dette er giftige stoffer. I tillegg må laboratoriefrakker og løsemiddelbestandige hansker brukes under forsøket. - Sett prøvene i en innebyggingsform, og sett dem deretter i en ovn ved 60 °C i 48 timer for å polymerisere. Bruk flat innebygging29 for å redusere forekomsten av harpiks rundt prøven. Dette forenkler prøveinstallasjonen og reduserer virkningen av ladeartefakter på den påfølgende bildesegmenteringen.
NOTAT: For senere å generere en horisontal skjæreflate, kan en liten mengde harpiks tilsettes i formhullet, og pass på at du ikke overfyller det. - Forbered silisiumskiver ved først å vaske dem og deretter hydrofilisere med en konsentrertH2SO4/H2O2-løsningi 30 minutter. Samle serielt skiver strimler med en tykkelse på 70 nm på hydrofilisert silisium wafers ved hjelp av en ultramicrotome, og tørk dem i en 60 ° C ovn i 10 minutter.
MERK: Fang skiven sakte mens skiven flyter til overflaten av skivene for å forhindre tap av skiver eller deformasjon.
2. Bildeoppkjøp og tredimensjonal rekonstruksjon
- Før du monterer en silisiumskive på scenen, vask seksjonene med destillert vann tre ganger og lufttørk dem. Klipp et ledende karbonbånd med størrelsen 1 cm x 0,5 cm, og hold dette mellom silisiumskiven og SEM-prøvetrinnet for å fullføre prøveoppsettet (figur 2E).
- Sett FE-SEM-akselerasjonsspenningsparameteren til 2 kV med en arbeidsavstand på 4 mm (figur 3B og tabell 1).
MERK: For å forbedre signal-støy-forholdet og redusere støyen i bildet, observer ved lave forstørrelser når det er mulig. Etter hvert som flere øker, reduseres skanneområdet til SEM, noe som fører til en økning i ladningsakkumulering på bildene. - Klikk på H / L-ikonet i den øverste menylinjen. Først orienterer du den første delen av målstykkestrimlene ved lav forstørrelse, og deretter klikker du igjen på H/L-alternativet (figur 3A) for å bytte til modus med høy forstørrelse. Samle et passende bilde for strukturen av interesse ved å justere bildets lysstyrke, kontrast og forstørrelse.
- Velg Project View > Open Data, og importer bildefilene som skal analyseres inn i programvaren.
- Juster bildene ved å klikke på Juster stykker > Rediger (figur 4B), og juster verdien for intensitetsområdet i menylinjen nederst til venstre ved å endre bildegjennomsiktigheten. Her bruker du en halvautomatisk justeringsstrategi; Spesielt, gjennom automatisk justering, få bildene til å overlappe med et tidligere bilde, og utfør deretter manuell finjustering.
MERK: I dette arbeidet, under justeringsprosessen, ble det forrige bildet brukt som referanse, og flytte- og roteringsoperasjonene ble brukt til å maksimalt overlappe målstrukturen til de to bildene. Å klikke på Align Current Slice Pair kan bidra til å justere bildene automatisk, men feilplassering kan forekomme. - Velg modulen Extract Subvolume, og klipp de justerte datasettene slik at de passer til størrelsen på den overlappende delen av hele stakken.
- Under underdelen Segmentering (figur 4C) velger du Oppdater > Segmentering > Lagre. Velg terskelen til tryllestaven og størrelsen på penselverktøyet for å velge riktig område. Her igjen, ta i bruk en halvautomatisk segmenteringsmetode ved først å bruke tryllestaven til automatisk å velge et passende stort område, og bruk deretter børsten til å beskrive detaljene nøyaktig.
MERK: Tryllestaven kan brukes på segmentbilder basert på de åpenbare forskjellene i pikselintensiteten som eksisterer mellom strukturen av interesse og de omkringliggende strukturene ved å endre maskeringsverdien og bruke tegnegrenselinjen. Det er ikke i stand til å skille ladeartefaktene som genereres under bildeopptak. Det kan derfor føre til feil segmentering for målregionene. Penselverktøyet kan brukes til å segmentere manuelt for å rekonstruere de biologiske strukturene nøyaktig. - Under Segmentering > utvalg klikker du på + -ikonet for å legge til det valgte området (figur 4C).
- Gjenta trinnet ovenfor (2.8) for å velge samme målstruktur i forskjellige bilder til utvalget er fullført for å rekonstruere mikrostrukturene av interesse.
MERK: Under mitokondrielle remodeling-prosesser må valget av målobjektet utføres fra bildet midt i en gruppe sekvensielle bilder. Hvis det nødvendige området er valgt fra det første eller siste bildet, vil rekonstruksjonsresultatet ikke kunne presentere en fullstendig 3D-visualisering. - Etter å ha fullført den regionale segmenteringen, genererer du bildefilen i henhold til de beste resultatene for størrelsen på objektet og bildeoppløsningen. Klikk på Crop Editor, og skriv deretter inn nummer 6 i Virtual Slider-boksen (figur 4C).
- I rullegardinmenyen til venstre høyreklikker du på det grå området under underdelen Prosjekt , og velger Generer overflate > Opprett > bruk. I den genererte filen bruker du Surface View-modulen til å opprette overflatestrukturen og 3D-representasjonen.
3. Kvantifisering
- Klikk på Fjern små flekker > bruke (figur 4D). Under underdelen Prosjekt høyreklikker du på det grå området, og velger Etikettanalyse > Bruk (figur 4D).
- Tilpass navnet på kolonnen, og velg en målegruppe. Velg Volum3d og Lengde3d fra boksen Opprinnelige mål.
- Klikk på Bruk-knappen nederst til venstre på skjermen. Kopier dataene, og graf i statistisk programvare, for eksempel GraphPad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under cellekultur (figur 1A) delte vi først kreftcellene i bukspyttkjertelen inn i en kontrollgruppe dyrket med komplett dyrkningsmedium, en (1S,3R)-RSL348 (RSL3, en ferroptoseaktivator, 100 nM) gruppe, og en RSL3 (100 nM) pluss ferrostatin-149 (Fer-1, en ferroptosehemmer, 100 nM) gruppe. Gjennom de ovennevnte eksperimentelle trinnene oppnådde skanningselektronmikroskopet 38 (tilleggsfigur 1), 43 (tilleggsfigur 2) og 44 (tilleggsfigur 3) sekvensielle bilder for henholdsvis kontrollgruppen, RSL3-gruppen og inhibitorgruppen (RSL3 + Fer-1-gruppen). Bildene på 1,280 x 960 piksler ble tatt med 8,000 ganger forstørrelse (med en oppløsning på 12,40 nm / piksel). Både rynker og forurensning i celleområdet ble ikke observert over snittene. Elektronmikroskopbildene kunne tydelig skille organellene, som mitokondriene og endoplasmatisk retikulum, i cellene (figur 1E).
Observasjonen av 2D-bildene fra FE-SEM viste at i kontrollgruppen av kreftceller (figur 5A) var mitokondriene fordelt gjennom cytoplasma, og de fleste var sfæriske eller ovale og jevnt klumpete. I tillegg var den relativt regelmessige, langstrakte cristae-arkitekturen tydelig synlig. Omvendt, i RSL3-gruppen (figur 5D), viste flertallet av mitokondriene en krympende morfologi, en økning i membrantettheten og en relativt vag cristae-struktur. Ved nærmere inspeksjon av SEM-bildene (figur 5E) fant man at ikke alle mitokondrie-cristae degenererte eller forsvant, da et relativt lite antall cristae forble intakte. Sammenliknet med RSL3-gruppen, i inhibitorgruppen, opprettholdt de fleste mitokondriene integralstrukturen til mitokondriell cristae, og bare et mindretall av mitokondrielle cristae-strukturer var ikke synlige (figur 5G).
Mens 2D-informasjon viser forskjeller i mitokondriell morfologi, kan det noen ganger resultere i en partisk forståelse av den detaljerte og virkelige 3D-strukturen50,51. Cristae-strukturene til kontrollgruppen under 3D-betingelsen (figur 5C) var konsistente med 2D-bildene, men de var forskjellige for RSL3-gruppen. For denne gruppen kunne tilstedeværelsen av komplett mitokondriell cristae også observeres i 2D-bildene (figur 5E), men mitokondriene under 3D (figur 5F) var uregelmessige og generelt vakuoliserte i midten. Inhibitorgruppen (figur 5I) viste ulike cristae-former, med bare noen mitokondrielle cristae som viste lokalisert kollaps. Fra resultatene fra RSL3-gruppen kan det således ses at bare bruk av 2D-analyse kan føre til en ensidig forståelse av resultatene. Resultatene av 2D-bilder er partiske sammenlignet med resultatene som presenteres når du stabler et sett med bilder for 3D-visning, så det er ikke mulig å generalisere resultater produsert bare gjennom 2D-informasjon. For mer objektivt å demonstrere effekten av RSL3 på mitokondrier, ble 3D-rekonstruksjonsdata brukt til å kvantifisere og måle mitokondrielle endringer52. Sammenlignet med kontrollgruppen ble lengden og volumet av 3D-mitokondriene i RSL3-gruppen signifikant redusert, men kvantifiseringsresultatene fra inhibitorgruppen falt mellom resultatene fra de to andre gruppene (figur 5J,K). Disse kvantitative dataene tyder på at RSL3 produserer mindre og nedbrutte mitokondrier, og tillegg av inhibitorer reduserer denne effekten.
Som vist i figur 6B og figur 6C ble det fastslått at ferroptoseinduseren RSL3 forårsaket mitokondriell dysfunksjon og påvirket cellulær metabolisme ved å endre mitokondriell morfologi 53,54 og fremkalle ferroptose, noe som kan representere en allestedsnærværende form for dynamisk celledød i kreftbehandling indusert avRSL3 55.
Figur 1: Generell arbeidsflyt for 3D-rekonstruksjon av bukspyttkjertelkreftcellemitokondrier. En generell arbeidsflyt for 3D-rekonstruksjonseksperimentene beskrevet i denne protokollen er demonstrert. (A) Kultur av kreftceller i bukspyttkjertelen. (B) Fremstilling av harpiksblokken. (C) Samling av serielle seksjoner ved hjelp av en ultramikrotom. (D) Innsamling av 2D-bilder ved hjelp av et feltutslippsskanningelektronmikroskop. (E) Plassering av målrettede mitokondrier i sekvensielle SEM-bilder. (F) Analyse av mitokondriene i 3D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: En enhet for montering av skivestrimler på kontinuerlige skiver på en hydrofilisert silisiumskive. (A) En justerbar vinkelmanipulator med tang for å holde skiven. (B) Rammen til skiveholderen plassert ved siden av ultramikrotomen. (C) Plassering av silisiumskiven i det blå sporet som inneholder diamantkniven. (D) Et nærbilde som viser posisjonsforholdet mellom silisiumskiven og diamantknivbladet. (E) En silisiumskive med skivestrimler festet til prøvetrinnet av SEM med ledende karbonlim. (F) Et nærbilde som viser den generelle oversikten over seriestykkestrimlene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prosessen med å stille inn parametrene og anskaffe bildene. (A) Menylinjen i FE-SEM (pilen peker på H/L-alternativet). (B) Tabell over avbildningsparametere og forhold. (C) Oversikt over påfølgende 2D-bilder i tre grupper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: En trinnvis veiledning for å visualisere mitokondrier i 3D ved hjelp av Amira. (A) Importere bilder fra en bestemt mappe. (B) Justere bildestakker i henhold til målstrukturen. (C) Segmentering og tilføyelse av interesseområdet. (D) Rekonstruere 3D-strukturen og legge til kvantifiseringsdataene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: 2D- og 3D-morfologien til mitokondrier i hver gruppe. 2D-kreftcellemorfologien til kontrollgruppen ved (A) 8000 ganger forstørrelse og (B) 15 000 ganger forstørrelse. (C) En 3D-representasjon av kontrollgruppens mitokondrielle morfologi. 2D-kreftcellemorfologien til RSL3-gruppen ved (D) 8000 ganger forstørrelse og (E) 15 000 ganger forstørrelse. (F) En 3D-representasjon av mitokondriell morfologi av RSL3-gruppen. 2D-kreftcellemorfologien til RSL3 + Fer-1 (inhibitor) gruppen ved (G) 8,000 ganger forstørrelse og (H) 15,000 ganger forstørrelse. (I) En 3D-representasjon av mitokondriell morfologi av RSL3 + Fer-1 (inhibitor) gruppen. De kvantitative dataene for (J) lengde og (K) gjennomsnittlig volum av mitokondriene i hver gruppe. Signifikante forskjeller er angitt med stjerner og ble beregnet med Student t-test (vs. kontrollgruppe, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001.) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Forskjeller i mitokondriell morfologi av kreftceller på 2D- og 3D-nivå. (A) 2D-kreftcellemorfologien til RSL3-gruppen ved 8000 ganger forstørrelse. (B) 2D-mitokondriell morfologi ved høyere forstørrelse. (C) En 3D-representasjon av spesifikke mitokondrier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Imaging parametere | Betingelser |
| DataSize | 1280 × 960 |
| PixelSize | 12.40234 |
| AcceleratingVoltage | 2000 volt |
| Arbeidsavstand | 3700 μm |
| EmissionCurrent | 13700 nA |
| Strålestrøm | 10μA |
| Gjeldende begrensende blenderåpning | Nr. 2 gitter av FE-SEM |
| Oppholdstid | 32 μs/px |
| Antall celler | 107 |
| Avbildede volumer | 10×8×2.66μm, 212.8μm³ |
| 10×8×3.01μm, 240.8μm³ | |
| 10×8×3,08μm, 246,4μm³ |
Tabell 1: Sammendrag av opptaksbetingelsene og datasettparametrene for bildeopptaket.
Tilleggsfigur 1: Oversikt over bilder av 38 kreftcellemikrosnitt fra kontrollgruppen. Bildenummeret til hver mikroseksjon er ordnet fra topp til bunn. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Oversikt over bilder av 43 kreftcellemikrosnitt fra RSL3-gruppen. Bildenummeret til hver mikroseksjon er ordnet fra topp til bunn. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Overview av bilder av 44 kreftcellemikroseksjoner fra RSL3 + Fer-1 (inhibitor) gruppen. Bildenummeret til hver mikroseksjon er ordnet fra topp til bunn. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her er en nyttig trinnvis veiledning for bruk av 3D-rekonstruksjonsteknikken, som innebærer bruk av elektronmikroskopi og bildebehandlingsteknologi til stabling og segmentering av 2D tomografiske bilder generert fra serielle ultratynne seksjoner. Denne protokollen fremhever en begrensning av 2D-bilder som kan adresseres ved 3D-visualisering av organellens ultrastruktur, som har fordelene med sterk reproduserbarhet av strukturene på et høyoppløselig nivå og høyere nøyaktighet. Enda viktigere, denne 3D-visualiseringen kan brukes på tumorceller for å gjøre studiet av patologiske mekanismer enklere og pålitelig. Denne teknikken ble undersøkt i dette arbeidet for å visualisere stereoskopiske strukturer av mitokondriell cristae ved å sammenligne tre sett med serielle seksjoner under forskjellige forhold, og derved validere RSL3-indusert mitokondriell cristae membrannedbrytning som oppstår i kreftceller56. Disse resultatene gir innsikt i virkningsmekanismen til RSL3 som et anti-bukspyttkjertelkreft stoff.
Oppkjøpet av høyoppløselige 2D-bilder spiller en viktig rolle i prosessen med 3D-rekonstruksjon57 av mitokondriell cristae, og bildekvaliteten påvirker direkte rekonstruksjonsresultatene 22,58. Derfor har denne metoden også noen begrensninger, for eksempel ladeartefaktene som genereres i SEM-bilder59, som igjen kan føre til feil segmentering av målstrukturene. Dette problemet kan løses ved å forkorte skiveskanningstiden, utstyre SEM med en fokalladningskompensator34,60 og bruke OTO-metoden, for hvilken bruk av TCH kan gjøre prøven mer ledende for elektroner ved farging med ekstra metaller 61. Å stole på automatisk bildesegmentering har en tendens til å være unøyaktig når det gjelder å bestemme omfanget av strukturen, mens manuell segmentering er tidkrevende58. Derfor, på grunnlag av den raske skannefordelen til SEM for å realisere bildesamling62, kan den halvautomatiske segmenteringen i Amira-programvaren brukes til å muliggjøre effektiv avbildning og rekonstruksjon; Bruk av Amira-programvare kan også gjøre resultatet mer nøyaktig og presist enn å bruke FIJI og MIB63. Det viktigste trinnet i 3D-bildebehandling er å anskaffe ultratynne seksjoner. Problemer som utelatelse, brudd og forvrengning, som påvirker bildekontinuiteten, oppstår ofte under seksjonsinnsamling. For å løse problemer som tap og brudd på skiver, brukte vi hydrofiliserte silisiumskiver som støtte for samlingen av skivestrimlene.
Selv om SBF-SEM og FIB-SEM kan redusere deformasjonen av eller defekter i seksjonene, har disse teknikkene en langsom avbildningshastighet, krever dyre instrumenter og er ikke i stand til å avbilde strukturen av interesse64,65,66. FIB-SEM mangler systemstabilitet under avbildning, mens SBF-SEM hindres av kompliserte prøveprepareringstrinn og en kjedelig arbeidsflyt34. Nylig har stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopisk avbildning gradvis blitt brukt til studiet av mitokondriell struktur. Denne metoden overvåker 3D-sanntidsbilder av mitokondriell cristae i levende celler gjennom konstruksjon av prober for mitokondriell merking67. Fluorescerende fargestoffmerking kan avsløre endringsprosessene i cristaeduring mitokondriell fusjon og fisjon68. Imidlertid har levende celler begrenset toleranse for intenst lys, så det er vanskelig å bruke denne teknikken i langsiktig STED-avbildning68. I tillegg er STED begrenset av oppløsning, bildedybde og pikselnummer69.
Sammenlignet med andre teknikker, tillater bruk av kontinuerlige ultratynne seksjoner kombinert med 3D-rekonstruksjonsteknologi for å observere organell ultrastruktur fra et bredt synsfelt ikke bare for høy gjennomstrømningsavbildning på kort tid, men muliggjør også undersøkelse av høyoppløselige bilder av målstrukturer på diskrete tider21, og dermed forbedre bildefrekvensen og rekonstruksjonsfleksibiliteten. Videre kan organelle morfologiske endringer og romlige forbindelser med andre organeller undersøkes nærmere. Disse aspektene kan kvantifiseres, og endringsmekanismene kan avsløres mer nøyaktig ved å rekonstruere tilstøtende organeller for å vise deres posisjonsforhold70,71. Denne teknologien for 3D-rekonstruksjon og seriell seksjonsavbildning ved hjelp av Amira58 avslører sammenhengen mellom sykdommer og organelle ultrastrukturelle endringer på nanoskala72, har blitt mye brukt i medisin, biologi og andre felt, og baner vei for utvikling av effektive nye terapier73,74.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Natural Science Foundation of Zhejiang Province tilskudd (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China tilskudd (82274364, 81673607 og 81774011); samt Public Welfare Research Project of Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Vi setter pris på stor hjelp, teknisk støtte og eksperimentell støtte fra Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetone | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
| Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
| Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
| Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
| Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
| Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
| Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 |
References
- Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
- Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
- Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
- Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
- Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
- Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
- Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
- Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
- Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
- Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
- Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
- Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L.
- Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
- Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
- Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
- Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
- Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Kittelmann, M.
- Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
- Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
- Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
- Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
- Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
- Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
- Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
- Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
- Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
- Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
- Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
- Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
- Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
- Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
- Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
- Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
- Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
- Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
- Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
- Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
- Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
- Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
- Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
- Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
- Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
- Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
- Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
- Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
- Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A.
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
- Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
- Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
- Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
- Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).
