Automatically Generated

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man rekonstruerer mitokondriell cristae for å oppnå 3D-avbildning med høy nøyaktighet, høy oppløsning og høy gjennomstrømning.

Abstract

Å forstå de dynamiske egenskapene til celleorganellens ultrastruktur, som ikke bare er rik på ukjent informasjon, men også sofistikert fra et tredimensjonalt (3D) perspektiv, er avgjørende for mekanistiske studier. Elektronmikroskopi (EM) gir god bildedybde og muliggjør rekonstruksjon av høyoppløselige bildestabler for å undersøke den ultrastrukturelle morfologien til cellulære organeller selv på nanometerskalaen; Derfor får 3D-rekonstruksjon betydning på grunn av sine uforlignelige fordeler. Skanning elektronmikroskopi (SEM) gir en høy gjennomstrømnings bildeinnsamlingsteknologi som gjør det mulig å rekonstruere store strukturer i 3D fra samme område av interesse i påfølgende skiver. Derfor blir anvendelsen av SEM i storskala 3D-rekonstruksjon for å gjenopprette den sanne 3D-ultrastrukturen til organeller stadig mer vanlig. I denne protokollen foreslår vi en kombinasjon av seriell ultratynnsnitt og 3D-rekonstruksjonsteknikker for å studere mitokondriell cristae i kreftceller i bukspyttkjertelen. Detaljer om hvordan disse teknikkene utføres er beskrevet i denne protokollen på en trinnvis måte, inkludert osmium-tiokarbohydrazid-osmium (OTO) -metoden, seriell ultratynnseksjonsavbildning og visualiseringsvisningen.

Introduction

Mitokondrier er en av de viktigste organellene i cellen. De tjener som det sentrale knutepunktet for cellulær bioenergetikk og metabolisme ^1,2 og spiller en kritisk rolle i kreft³. Kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en av de vanskeligste kreftformene⁴ å behandle på grunn av rask spredning og høy dødelighet. Mitokondriell dysfunksjon, som hovedsakelig skyldes endringer i mitokondriell morfologi ^3,5,6,7, har vært knyttet til sykdomsmekanismene bak PC 8. Mitokondrier er også svært dynamiske, noe som gjenspeiles av de hyppige og dynamiske endringene i nettverkstilkoblingen og cristae-strukturen⁹. Omformingen av cristae-strukturen kan direkte påvirke mitokondriefunksjonen og cellulær tilstand^10,11, som er betydelig endret under tumorcellevekst, metastase og tumormikromiljøendringer^12,13.

De siste årene har forskere studert denne organellen ved hjelp av EM-observasjon^14,15,16,17; for eksempel har forskere analysert mitokondriedynamikken ved hjelp av 3D-rekonstruksjonsteknikker 6,7,18,19. Det generelle konseptet og metoden for 3D-rekonstruksjon av elektronmikroskopibilder ble formelt etablert allerede i 1968-20 og involverte å kombinere elektronmikroskopi, elektrondiffraksjon og databildebehandling for å rekonstruere T4-faghalen. Hittil har elektronmikroskopi 3D-bildebehandlingsteknologi gjort betydelige fremskritt når det gjelder bildeoppløsning²¹, grad av automatisering 22 og prosesseringsvolum 23 og har blitt brukt i stadig bredere skala i biologisk forskning, fra vevsnivå til organell ultrastrukturnivå på nanometerskala²⁴. I de senere år har elektronmikroskopi 3D-avbildning også blitt en lovende teknologi for et bredt spekter av applikasjoner^25,26,27.

Den økende oppmerksomheten på mitokondriell cristae illustrerer spesielt de essensielle kravene til ultrastrukturell volumavbildning. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) har blitt brukt til å visualisere prøver samlet på et kobbergitter (400 mesh)²⁸, med elektronstrålen som passerer gjennom seksjonen. På grunn av kobbergitterets begrensede rekkevidde er det imidlertid umulig å avbilde kontinuerlige skiver av samme prøve²⁹. Dette kompliserer studiet av målstrukturer under TEM-avbildning. I tillegg er TEM avhengig av tidkrevende og feilutsatte manuelle oppgaver, inkludert kutting og innsamling av flere stykker og avbildning av dem sekvensielt²¹, så det er ikke tilpasset ultrastrukturelle rekonstruksjoner av store volumprøver²³. For tiden oppnås høyoppløselig rekonstruksjon av storvolumprøveavbildning ved bruk av spesialutstyr, for eksempel TEM camera array (TEMCA) ³⁰ eller to andre generasjons TEMCA-systemer (TEMCA2) ³¹, som muliggjør automatisert høy gjennomstrømningsavbildning på kort tid. Denne typen bildebehandling har imidlertid ikke fordelen av å være lett å få tak i og universell på grunn av kravet til tilpasset utstyr.

Sammenlignet med TEM forbedrer metoden for automatisk generering av tusenvis av serielle volumetriske bilder for store områder basert på SEM ^32,33 effektiviteten og påliteligheten til seriell bildebehandling og gir høyere z-oppløsninger³⁴. For eksempel har seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) og fokusert ionstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) begge gjort det mulig å oppnå 3D-rekonstruksjon av ultrastruktur med høy hastighet, effektivitet og oppløsning^35,36. Det er imidlertid uunngåelig at blokkoverflaten blir mekanisk barbert av diamantkniven til SBF-SEM eller ved fresing med den fokuserte ionstrålen til FIB-SEM^33,37. På grunn av destruktiviteten til de to metodene for prøvene, er det ikke mulig å rekonstruere den samme målstrukturen igjen for videre analyse^38,39,40. I tillegg har få studier forsøkt å rekonstruere 3D-organell ultrastruktur av kreftceller ved hjelp av EM for å observere patologiske endringer¹². Av disse grunner, for ytterligere å belyse de patologiske mekanismene til kreftceller, som kreftceller i bukspyttkjertelen, foreslår vi en ny teknologi for 3D-rekonstruksjon av serielle seksjonsbilder ved hjelp av et ultramikrotome og et feltutslippsskanningelektronmikroskop (FE-SEM) for å analysere mitokondriell ultrastruktur på cristae-nivået; Med denne teknologien kan høyoppløselige data samles inn ved hjelp av en effektiv og tilgjengelig metode. De serielle ultratynne seksjonene laget ved hjelp av en ultramikrotome kan lagres semi-permanent i et rutenett og reimaged flere ganger, selv etter flere år⁴¹. FE-SEM er høyt verdsatt som et verktøy i ulike forskningsfelt på grunn av sin evne til å gi høyoppløselig bildebehandling, høy forstørrelse og allsidighet⁴². I et forsøk på å vise den fine strukturen til organeller i 3D, kan teknikken for å produsere serielle 2D-bildestabler med nyttig oppløsning ved bruk av tilbakespredte elektroner produsert av FE-SEM ^43,44 også brukes til å oppnå høy gjennomstrømning og multiskala avbildning av målregioner eller deres tilhørende strukturer uten spesialutstyr ⁴⁵. Genereringen av ladningsartefakter påvirker direkte kvaliteten på de oppkjøpte bildene, så det er spesielt viktig å holde oppholdstiden kort.

Dermed utdyper denne studien de eksperimentelle prosedyrene som brukes i denne SEM-teknikken for å rekonstruere 3D-strukturen til mitokondriell cristae⁴⁶. Spesielt viser vi prosessen utviklet for å oppnå halvautomatisk segmentering av mitokondrieregioner og digitalisere 3D-rekonstruksjonen ved hjelp av Amira-programvare, som også innebærer å lage skiveprøver ved hjelp av den konvensjonelle OTO-prøveprepareringsmetoden^44,47, fullføre seksjonssamlingen ved hjelp av ultramikrotomskiver og skaffe sekvensielle 2D-data ved FE-SEM.

Protocol

1. Materiell forberedelse Dyrkning 2 x 106 Panc02-celler i 12 ml DMEM-medium (10 % føtalt bovint serum og 100 U/ml penicillin-streptomycin), og opprettholdes ved 37 °C og 95 % luftfuktighet i en atmosfære med 5 % karbondioksid og 95 % luft i 48 timer. Samle Panc02-celler, sentrifuge ved 28 x g i 2 minutter, og kast deretter supernatanten. Forsikre deg om at prøven er av passende størrelse (1 x 107 celler), ellers vil følgende fikserings- og dehydre…

Representative Results

Under cellekultur (figur 1A) delte vi først kreftcellene i bukspyttkjertelen inn i en kontrollgruppe dyrket med komplett dyrkningsmedium, en (1S,3R)-RSL348 (RSL3, en ferroptoseaktivator, 100 nM) gruppe, og en RSL3 (100 nM) pluss ferrostatin-149 (Fer-1, en ferroptosehemmer, 100 nM) gruppe. Gjennom de ovennevnte eksperimentelle trinnene oppnådde skanningselektronmikroskopet 38 (tilleggsfigur 1), 43 (tilleggsfigur 2) og 44 (tilleggsfigur…

Discussion

Metoden som presenteres her er en nyttig trinnvis veiledning for bruk av 3D-rekonstruksjonsteknikken, som innebærer bruk av elektronmikroskopi og bildebehandlingsteknologi til stabling og segmentering av 2D tomografiske bilder generert fra serielle ultratynne seksjoner. Denne protokollen fremhever en begrensning av 2D-bilder som kan adresseres ved 3D-visualisering av organellens ultrastruktur, som har fordelene med sterk reproduserbarhet av strukturene på et høyoppløselig nivå og høyere nøyaktighet. Enda viktigere…

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2