Summary
在这里,我们描述了微加工垂直取向碳纳米纤维 (VACNF)、将 VACNF 转移到柔性基材上以及将 VACNF 应用于植物的刚性和柔性基材以进行生物分子和染料递送的方法。
Abstract
将生物分子和不透水染料输送到完整的植物中是一项重大挑战。纳米材料是将DNA递送至植物的新兴工具。尽管这些新工具令人兴奋,但它们尚未得到广泛应用。在刚性基材(背衬)上制造的纳米材料特别难以成功应用于弯曲的植物结构。本研究描述了微加工垂直排列的碳纳米纤维阵列并将其从刚性基板转移到柔性基板的过程。我们详细介绍并演示了这些纤维(在刚性或柔性基材上)如何用于瞬时转化或染料(例如荧光素)递送至植物。我们展示了如何将 VACNF 从刚性硅衬底转移到柔性 SU-8 环氧树脂衬底以形成柔性 VACNF 阵列。为了克服SU-8的疏水性,柔性薄膜中的纤维涂有一层薄薄的氧化硅层(2-3nm)。为了将这些纤维输送到弯曲的植物器官,我们将 1 μL 染料或 DNA 溶液液滴沉积在 VACNF 薄膜的纤维侧,等待 10 分钟,将薄膜放在植物器官上,并使用滚动运动的拭子将纤维驱动到植物细胞中。通过这种方法,我们已经在具有曲面的植物器官中实现了染料和DNA的递送。
Introduction
植物转化(瞬时和稳定)尚未在所有植物组织和物种中广泛实现。植物的瞬时转化是质粒中编码的基因暂时导入植物但不能稳定地掺入基因组的过程。使用颗粒轰击、农杆菌、电穿孔或聚乙二醇处理原生质体的传统方法速度慢或可能很麻烦。此外,它们并不适用于所有植物物种1、2、3、4。使用纳米材料进行 DNA 递送是一个新兴领域,仍处于起步阶段5.纳米材料,特别是碳纳米纤维,也已成功用于将蛋白质、葡聚糖和染料输送到植物叶子,而不会引起伤口反应6。这项工作的目标是提供一种详细的协议,用于使用一种纳米材料,即碳纳米纤维,将生物分子或染料输送到植物。在这里,我们专注于DNA作为首选的生物分子,它允许各种植物器官中的细胞瞬时转化。
此前,Morgan等人7 展示了使用附着在刚性硅衬底上的碳纳米纤维来瞬时转化生菜, 本氏猪笼草 和杨树的叶子,以及拟南芥的叶子和根。尽管在各种器官上都取得了成功的转化,但纤维更难应用于具有弯曲表面的植物组织,例如根或果实。我们推断,纳米纤维的柔性背衬可能会通过更好地符合器官的形状来提高其输送效率。
在此,我们详细介绍了用于制造和设计垂直排列的碳纳米纤维、将 VACNF 转移到柔性基质以及将 VACNF 应用于植物的刚性和柔性基质以递送生物分子和染料的方法。采用直流催化等离子体增强化学气相沉积(dc C-PECVD)和Ni催化剂制备了碳纳米纤维。如Melechko等人所述,使用电子束光刻、金属蒸发和剥离过程的组合来控制Ni催化剂点的位置、直径和高度8,9。使用双层电子束光刻胶,可以在基底上沉积较厚的镍催化剂,以产生更长的纤维10。纤维从刚性基板到柔性基板的转移基于对Fletcher等人11中描述的方法的修改,目前的方法放弃了使用无定形碳层或牺牲光刻胶层。SU-8 通过纤维转移的升空是通过利用 SU-812,13,14 烘烤不足和曝光不足产生的固有拉伸应力来实现的。SU-8 是一种复杂的聚合物,具有天然疏水性,这使得其难以用于促进 DNA 递送。为了抵消SU-8的疏水性,我们在纤维嵌入SU-8后,通过原子层沉积15施加一层薄薄的氧化硅。在刚性基材上应用纤维进行生物分子/染料递送利用了 Davern 等人 6 中描述的镊子攻丝的冲击力以及 Morgan 等人 7 中描述的植物上和芯片上方法。柔性VACNF薄膜通过首先将薄膜上的DNA或染料液滴半干燥,如Morgan等人7的芯片方法,然后使用小型化妆涂抹器16,17在弯曲的植物表面上滚动薄膜,将柔性VACNF薄膜应用于弯曲的植物表面。图 1 描述了将刚性和柔性基材中的纤维应用于植物的各种方法。
Protocol
1. VACNFs生产(图2和图3)
- 用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)495 A4旋转涂覆硅晶圆,在4000rpm下抗蚀,并在180°C下烘烤5分钟。
注意: 让晶圆冷却 10 秒,然后再进行下一步。 - 旋转涂上第二层抗蚀剂(PMMA 950 A2)并在180°C下烘烤5分钟。
- 使用电子束光刻技术在3 mm x 3 mm阵列中以指定的横向间距(间距:10μm或35μm)定义直径为300nm的催化剂点。
- 在 30-40 mL 的 1:3 甲基异丁基酮:异丙醇 (IPA) 中显影光刻胶 1.5 分钟,然后用 IPA 冲洗并用 N2 干燥。
注意:使用明场显微镜(20倍物镜)检查点阵列。 - 在硅蚀刻机的氧等离子体(渣渣)中暴露 6 秒,清洁残留光刻胶的晶圆。
- 使用电子束蒸发首先沉积金属粘合层(Ti 或 Cr,10 nm),然后沉积第二层,即 Ni 催化剂(130 nm 或 150 nm)。在 Ti 或 Ni 金属沉积过程中,在 10 kV 时将电流保持在 0.2 A 以下,压力保持在 5 x 10-6 Torr 以下,并且沉积速率保持在 ~1 A/s 以进行视线沉积。
- 使用顺序浴超声处理去除沉积在底层光刻胶层上的金属 (Ni),使 Ni 直接沉积在硅片上。这个过程称为升空。
- 为此,准备3个装有丙酮的容器,并在丙酮中对晶圆进行超声处理1分钟;在室温(RT,20°C)下以35kHz的频率重复3次。用 IPA 冲洗并用 N2 晾干。
注意: 切勿让丙酮在晶圆上干燥。最后一次丙酮超声处理后,立即用IPA冲洗,然后用N2 气体干燥。如果在任何时候晶圆过早干燥(在IPA冲洗之前),则可能无法去除所有多余的金属和光刻胶,并且丙酮会留下残留物。
- 为此,准备3个装有丙酮的容器,并在丙酮中对晶圆进行超声处理1分钟;在室温(RT,20°C)下以35kHz的频率重复3次。用 IPA 冲洗并用 N2 晾干。
- 使用扫描电子显微镜(SEM)检查催化剂形状的几何形状。要捕获 VACNF 芯片的 SEM 图像,请将载物台倾斜 30° 角并使用 1-3 kV 的电压,光束电流为 ~100 pA,工作距离为 ~5 mm。
注:催化剂应看起来像一个曲棍球(一个紧凑的圆柱体)(图4)。紧凑型圆柱体的高度应反映沉积在硅片上的镍的厚度。如果Ni点的轮廓很高,顶部看起来是凹陷的,类似于火山(图4),那么催化剂更有可能脱湿成多个Ni液滴,导致碳纳米纤维9(图4和图5)。这些问题可能是由于金属蒸发过程中的光刻胶熔化造成的,因为沉积时间长或剥离程序存在问题(图 4 和图 5)。 - 将硅晶片切成四等份,并将其与乙炔/氨混合物一起放入直流等离子体增强化学气相沉积室(dc-PECVD)中。优化生长参数以控制纳米纤维的长度和锥度(尖端<200 nm)。
- 使用 1-1.5 A 的电流和 440-560 V 的电压范围。在生长纤维时,使用氨流的预处理阶段,同时机器和基材加热到620°C。 确保在开始等离子体之前打开碳源(乙炔)10 秒。
注意:在需要优化PECVD机器运行参数的情况下,使用四分之一晶圆。为了生产长度大于 40 μm 且尖端直径小于 200 nm 的纤维,建议采用以下参数:Ni 催化剂厚度为 130 nm,使用电流为 1.75 A,生长时间为 70 min,乙炔:氨比为 45 标准立方厘米/分钟 (sccm):100 sccm。Ni厚度为150nm,使用电流为1.5 A,生长时间为80 min,乙炔:氨比为48 sccm:100 sccm。无论催化剂厚度如何,都使用以下参数来生长 VACINF:生长温度为 620 °C,等离子体过程中的压力为 10 torr,喷头高度为 20 mm(图 6)。
- 使用 1-1.5 A 的电流和 440-560 V 的电压范围。在生长纤维时,使用氨流的预处理阶段,同时机器和基材加热到620°C。 确保在开始等离子体之前打开碳源(乙炔)10 秒。
- 使用SEM以30°倾斜评估所得纤维的几何形状,加速电位为1 kV。
注意:最佳纤维将是直的且不分支的。用电子束蒸发器无法控制Ni催化剂的晶体取向。结果,会有一些纤维由于催化剂脱湿而分支9.此外,晶体取向会导致VACNF生长到不同的高度,因此很难在所有VACNF上实现均匀的高度。 - 以 1000 rpm 的速度将一层光刻胶 (SPR955) 旋涂在纤维上 45 秒。然后使用切割锯将 1/4 晶圆切成 3 mm x 3 mm 阵列。此时将光纤存放以备后用。
注意:如果计划将纤维转移到柔性基板上,请不要执行步骤 1.11。
2. 将VACNF 转接到柔性基板上(图 7 和图 8)
- 合成纤维后,将SU-8 2015光刻胶以4000rpm的速度旋涂到晶圆或四分之一晶圆上45秒。
- 将晶圆在95°C下软烘烤3分钟。
- 使用接触对准器,用 3 mm 3 mm 阵列图案掩模曝光晶圆,该掩模与电子束光刻以 95 mJ/cm 2 的速度定义的图案对齐。
注意: 使用接近接触模式,曝光间隙比最高光纤大 20 μm。在此过程中的这一步中,纤维可能会被打翻。 - 在95°C下进行曝光后烘烤6分钟。
- 将晶圆在SU-8显影剂中显影15秒,用IPA冲洗,然后用N2干燥晶圆,从上到下移动。
注意: 显影晶圆时,请确保其完全浸没。 - 在3000rpm下旋转涂覆带有薄光刻胶保护层(SPR 955 CM 0.7)的旋涂图案晶圆45秒,并在90°C下软烘烤30秒。
- 通过将薄氧化硅层沉积在100°C下22个循环,将薄氧化硅层沉积到晶圆(2-3nm)上。
- 使用切割锯将晶圆切割成 3 毫米 x 3 毫米的正方形。将切割锯对准晶圆上预先存在的图案。
- 使用SEM以30°倾斜评估所得纤维的几何形状,加速电位为3 kV。
- 如果存放芯片以供长期使用(>1 周),请在此处停止。将薯片存放在黑暗中。
- 要将柔性基板与刚性基板分开,请将单个芯片置于丙酮中30分钟或直到SU-8开始卷曲。
- 用IPA洗涤SU-8薄膜(附着在刚性基材上或从刚性基材上分离)5分钟,然后用水洗涤5分钟。运输时将薯片放入带有粘垫的商业盒子中。
- 可选:将 SU-8 薄膜的无纤维面放在水溶性胶带上或薄硅橡胶上,上面有薄聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET)(12.5 μm 厚)背衬。
- 使用镊子转移SU-8薄膜。按压 SU-8 正方形的边缘,使其粘在胶带/硅橡胶-PET 上;这是为了避免断裂光纤。此时,VACNF薄膜已准备好立即使用。
- 要准备硅橡胶/PET 支架,请执行以下操作:使用两部分硅橡胶套件,将两部分(弹性体和交联剂)混合在一起。接下来,切出一个正方形的PET并将其粘在一个透明的塑料盘中。在PET顶部倒入一层非常薄的硅橡胶,并在80°C下固化1-2小时。
3.在工厂使用纤维在刚性基材中使用溶液的方法(将一滴溶液放置在植物表面)(图1A)
- 使用前用丙酮(100%,5分钟),IPA(100%,5分钟)和ddH2O(5分钟)的增量洗涤去除光刻胶。
- 将要刺穿的植物组织放在坚硬的表面上作为支撑。
- 将 1 μL 染料或 DNA 液滴 (200 ng) 放在植物组织表面。
- 将带有刚性基板的 VACNF 芯片放置在液滴顶部,纤维的方向使它们与液滴接触。
注意: 芯片的方向可以通过晶圆的“光泽度”来确定。芯片的闪亮面有纤维,不透明的一面没有。 - 使用镊子的扁平面,敲击芯片。使用软头记号笔标记芯片接触的植物区域。交货后取出 VACNF 芯片。
注意: 敲击时施加的力的大小会因所使用的植物组织类型而异。建议在进行纤维穿刺之前练习攻丝。避免损伤植物组织。当人们可以在植物组织中看到VACNF芯片的轮廓时,损伤是显而易见的。 - 对照重复步骤3.1-3.5(+染料/DNA,-纤维;-染料/DNA,+纤维;和-染料/DNA,-纤维)。-纤维是芯片的无纤维面。
- 如果需要,将完整的植物或切除的植物器官储存在潮湿的室内,在长时间的条件下(16小时光照,8小时黑暗)。对于切除的器官,使用塑料培养皿和湿纸巾。
4. 片上方法(将一滴溶液放在VACNF芯片上),刚性基板(图1B)
- 使用前用丙酮(100%,5分钟),IPA(100%,5分钟)和ddH2O(5分钟)的增量洗涤去除光刻胶。
- 将 1 μL 染料或质粒 DNA (200 ng) 滴入具有刚性基板的 VACNF 芯片的纤维侧。确保将液滴放在芯片的中心并覆盖几根纤维。让液滴干燥15分钟。
注意: 芯片的方向可以通过晶圆的“光泽度”来确定。芯片的闪亮面有纤维,不透明的一面没有。 - 处理叶子或其他切除器官时,将它们放在坚硬的表面上。使用完整的植物时,在应用VACNF的器官下方放置一个坚硬的表面。
- 在15分钟的干燥步骤之后,放置VACNF芯片,使纤维侧与植物组织接触。用镊子的后端敲击芯片。
注意: 敲击时施加的力的大小会因所使用的植物组织类型而异。建议练习敲击芯片。 - 重复工厂方法的步骤 3.6-3.7。
5. 使用片上方法将 SU-8 薄膜中的 VACNF 应用于植物组织(图 1C)
- 将 1 μL 染料或 DNA 液滴 (200 ng) 放在 SU-8 薄膜的纤维侧,并使其干燥 10 分钟。确保将液滴放在芯片的中心。
注意: 根据所使用的基材,干燥时间会有所不同。 - 使用一把锋利的镊子,将VACNF薄膜放在植物表面。
注意:SU-8 胶片在空气中放置的时间越长,胶片就越脆。为限制丢失 SU-8 胶片的风险,请确保所有工厂/样品和设备都靠近 SU-8 胶片。 - 轻轻地将一个小化妆器卷在 VACNF 薄膜上。用软头记号笔标记放置柔性基材的区域。使用胶带从植物表面去除柔性基质。
注意: 滚动化妆涂抹器时施加的力的大小会因使用的植物组织而异。在进行生物分子或染料递送之前练习应用 VACNF 薄膜。当人们可以看到植物组织中VACNF薄膜的轮廓时,对植物组织的可见损伤是显而易见的。 - 对照重复步骤5.1-5.3,并按照工厂方法的步骤3.7所述储存植物。
6. 所有输送方式的显微镜和图像分析
- 使用共聚焦显微镜对样品进行成像,使用适合输送的荧光探针/报告基因的发射和激发波长。
注意:瞬时转化所需的时间因植物种类和传递的标记物而异。例如,在拟南芥中48小时后检测到荧光标记物的表达,而在生菜叶中则在96小时后检测到荧光标记物的表达7。 - 成像时,尽量聚焦在纤维脱落的区域。纤维将具有不同的方向。输送的成功与否并不取决于断裂纤维的外观。
注意:由于 PECVD18 中纤维形成导致氮化硅层的形成,纤维将具有最常见的激发/发射设置。 - 每个样本至少捕获 5 张图像。产生的信号会有所不同。
- 使用 ImageJ19 测量 20 μm x 20 μm 共聚焦图像区域7 中的荧光值作为总荧光(积分密度)。
Representative Results
VACNF芯片在刚性或柔性基质上的明显优势是能够将生物分子或染料输送到植物上的特定位置(图1)。在这里,我们使用荧光读数来评估递送。使用不同的植物、底物和递送方法(芯片上或工厂上),染料荧光素出现的时间可能存在差异。为了确定VACNF芯片/薄膜是否可用于递送,一种快速方法是使用纤维进行染料递送(图9)。图 9 中用不同时间标记的图像是来自相同样本的不同视场。当使用植物上方法时,可以在递送后立即使用荧光显微镜观察荧光素染料。此外,如果在将荧光素染料输送到植物后随时间推移对相同的视场进行成像,则信号强度会随着时间的推移而变得不那么明亮(图10)。荧光素染料可能通过胞间连杆20,21 从视野移动到叶子的其他区域。与植物上方法相比,在刚性基材上具有纤维的芯片上方法中,染料在整个穿刺区域的移动速度较慢(图9)。这可能是由于染料从纤维中分离/在细胞中再水化,因此需要更多时间来移动。
柔性基材中的纤维适用于将染料输送到曲面上,如草莓和苹果(图11和图12)。使用草莓的柔性基质,立即观察到强烈的荧光素信号(图11),而在苹果中需要2小时才能看到强烈的荧光素信号(图12B,D)。编码荧光标记物的质粒的成功递送可以使用荧光显微镜来确定所得信号(图12F,图13和图14)。对于确定所选植物是否没有类似于我们想要通过纤维传递的荧光标记物的自发荧光,有必要进行对照。单独使用纤维有助于确定用镊子施加的冲击力是否对植物组织造成损害,或者样品中观察到的荧光是否是由VACNF引起的,VACNFs由于其氮化硅层18而具有固有的荧光(图13C-D)。刺穿植物组织中的纤维不会引起伤口反应,如 H 2 O2 产生6 所评估的那样。最后,使用+DNA的控制,-Fibers是必要的,以确认DNA不是仅通过敲击进入植物,并确认纤维是传递到植物细胞中所必需的(图13E-F)。在刚性基板上使用VACNF的厂上或片上递送方法时,应该没有明显的差异,荧光值没有显着差异(图13I)。使用具有片上 DNA 递送的柔性 VACNF 薄膜,可成功瞬时转化商店购买的苹果和洋葱中的表皮细胞(图 12F 和图 14)。
失败的实验可能会在不同的视野中纤维断裂,但尝试递送质粒DNA或染料不会产生荧光信号。如果对植物施加过大的压力,则会出现明显的组织损伤(图15)。这种机械损伤可能看起来像植物中的小孔或透明区域,就像在显微镜下观察植物时去除了一层细胞一样。有时可以看到芯片的印记。在DNA递送后未检测到荧光蛋白表达的实验也可能是由于使用了低质量的DNA,因此制备新鲜DNA可能是有用的。
图 1:使用刚性和柔性基质上的 纤维将染料/DNA 递送至植物组织的示意图。 (A) 植物上纤维介导的染料/DNA 递送。将 1 μL 染料/DNA 溶液液滴放置在叶片表面,并将 VACNF 芯片放置在液滴顶部。使用一把镊子,将芯片轻轻敲入组织。刚性基质被去除,在组织内留下纳米纤维。(B) 片上纤维介导的 DNA 递送。将 1 μL 染料或 DNA 溶液液滴滴浇铸在 VACNF 芯片上并干燥 15 分钟。将带有半干燥DNA的芯片放置在叶子表面的顶部,并像图 A所示敲击到组织中。(C) 片上 SU-8 薄膜 DNA 递送。纤维从刚性硅衬底转移到柔性 SU-8 背衬上。将1μL染料/ DNA溶液滴滴浇铸在VACNF薄膜上并干燥10分钟。然后使用化妆器将带有半干染料/DNA 的 VACNF 薄膜卷到弯曲的植物表面上。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:制作垂直排列的碳纳米纤维阵列的工作流程。 为了生产 VACNF,将双层聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA 495 A4 后跟 PMMA 950 A2)旋涂到硅晶圆上。电子束光刻用于定义直径为 300 nm 的点阵列。然后在甲基异丁基酮/异丙醇 (MIBK/IPA) 中以 1:3 的比例显影光刻胶 1.5 分钟。使用金属蒸发器,在晶圆上涂上一层Ti(10 nm),然后涂上一层Ni(130 nm或150 nm)。然后通过提升(丙酮中的浴超声处理)去除剩余的抗蚀剂。通过SEM检查催化剂点的几何形状。如果催化剂类似于曲棍球并且是扁平的,则将它们放置在等离子体增强化学气相沉积(PECVD)机器中并生长纤维。然后使用SEM检查纤维。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:理想垂直排列的碳纳米纤维的 SEM 图像。 (A) 间距为 ~35 μm、高度为 10-15 μm 的 VACNF 的电子显微照片,以 30° 角成像。该图像在图7C中重复。(B) 间距为 ~20 μm、高度为 20-30 μm 的 VANCF 的电子显微照片,并以 30° 角成像。(C) 间距为 ~35 μm、高度为 50-60 μm 并以 30° 角成像的 VANCF 的电子显微照片。(D) 直径<200 nm 的 VACNF 尖端的电子显微照片。光纤尖端直径(150-300 nm)存在差异。由于纤维是以 30° 角成像的,因此高度似乎小于实际高度,系数为 sin(30°)=1/2。图A和图B经Morgan等人许可转载7。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:VACNF 生长前催化剂几何形状的 SEM 图像。 (A) 催化剂升空后的 SEM 图像。请注意,光刻胶存在于催化剂的边缘周围,从而形成火山形状。(乙,丙)SEM图像显示了使用单层PMMA光刻胶后催化剂的火山形状。(D)由双层PMMA制成的所需曲棍球催化剂形状。由于在图A、B和D中以30°角对纤维进行成像,因此高度似乎小于实际高度,系数为sin(30°)= 1/2。比例尺表示 100 nm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:催化剂网点尺寸对纤维生长的影响:为了确定催化剂材料的最佳直径,从 200-600 nm 的网点尺寸生长纤维。400-600 nm 的点数导致催化剂脱湿和多根纤维的生长。最佳的纤维几何形状是由直径为300 nm的。较小的点导致纤维高度不足。由于纤维是以 30° 角成像的,因此高度似乎比实际高度小 sin(30°) = 1/2 倍。使用扫描电子显微照片拍摄图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:橡树岭国家实验室 (ORNL) 使用的直流-等离子体增强化学气相沉积 (dc-PECVD) 系统的示意图。 ORNL的定制系统有一个大型喷淋头,用作原料气的反应器和等离子体的输出。喷淋头相对于基板的加热阶段保持在300 V的直流电位。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7:将纤维从刚性基板转移到柔性基板的工作流程。 经过纳米纤维合成和检查后,每个晶圆以 4000 rpm 的速度用 SU-8 2015 旋涂 45 秒。然后将晶圆在95°C下软烘烤3分钟。 然后将晶圆暴露在紫外光下,并在掩模对准器中以 95 mJ/cm2 的速度进行图案化。在95°C下后烘烤6分钟后,将晶圆在SU-8显影剂中显影15秒,用IPA冲洗,并用N2 气体干燥。将SPR 955 CM 0.7的保护性抗蚀剂层以3000 rpm的速度旋涂在晶圆上,并在90°C下软烘烤30秒。然后通过原子层沉积(ALD)(在100°C下循环22次)将氧化硅层(2-3nm)添加到晶圆中,使柔性衬底具有亲水性15。然后用切割锯将晶圆切成 3 mm x 3 mm 的正方形。在使用时,将单个芯片置于丙酮中,直到SU-8开始卷曲并变得凹陷(>30分钟)。此时,大多数芯片上的SU-8层可以用锋利的镊子在边缘抓住,并从下面的硅衬底上剥离出来,形成一个完整的3毫米见方薄膜。然后将薄膜在IPA和水中连续洗涤5分钟并立即使用。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8:纤维从刚性基板转移到柔性基板的 SEM 图像。显示的图像具有代表性,但来自不同的样本。(A)PECVD生长后的长纤维(图像与图2C相同)。(乙,丙)应用SU-8后的纤维。环氧树脂在纤维基部周围涌出。暴露的纤维长度范围为5 μm至30 μm。 (D)升空后嵌入Su-8的纤维保持其几何形状。由于纤维以 30° 角成像,因此高度似乎小于实际高度 sin(30°)=1/2 倍。图A经Morgan等人许可转载7。请点击这里查看此图的较大版本.
图9:使用片上和植物上的方法将染料输送到拟南芥叶片,并在刚性基质上使用纤维。 (A-P)使用共聚焦显微镜采集图像。片上法(A-H):将1μL的10μM荧光素染料在VACNF芯片上干燥15分钟,然后用镊子将芯片敲入拟南芥叶的背面。(A-D)叶子在分娩后 5-15 分钟内成像。(E-H)分娩后 1 小时成像的叶子。(A,E)+染料,+纤维。对照:(B,F)-染料,-纤维;(C,G)-染料,+纤维;(D,H)+染料,-纤维。(I-P)植物上方法:将1μL的10μM荧光素染料置于植物表面,将芯片定位,使其与液滴接触,并使用镊子将芯片敲击到拟南芥叶的背面。(I-L) 在分娩后 5-15 分钟内成像,(M-P) 在分娩后 1 小时内成像。(I,M) +染料,+纤维。对照:(J,N)-染料,-纤维;(K,O)-染料,+纤维;(L,P)+染料,-纤维。面板 A-P 是来自 z 堆栈的单个平面图像。比例尺为 20 μm。纤维的间距为 35 μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图10:通过植物上方法在拟南芥中通过刚性基质递送染料的时间过程。 使用共聚焦显微镜采集图像。使用植物上方法,将1μL荧光素染料溶液(10μM)液滴置于叶片表面,并将VACNF芯片置于液滴顶部。使用一把镊子,将芯片轻轻地敲入组织。每 5 分钟采集一次同一区域的 +染料、+纤维图像。比例尺为 20 μm。纤维的间距为 35 μm。面板是来自 z 堆栈的单个平面图像。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 11:使用 VACNF 薄膜将染料输送到草莓果实中。 (A-H) 使用共聚焦显微镜获取图像。使用芯片上方法,将染料液滴在VACNF薄膜上干燥,然后使用化妆涂抹器将其滚动到水果表面。将荧光素染料(10μM)递送至草莓细胞,并在(A)10分钟和(B)1小时后成像。 (C,D)无处理对照(-染料,-纤维)。(E,F)-染料,+纤维分别在10分钟和1小时后对照。(G,H)+染料,-纤维分别在10分钟和1小时后对照。比例尺为 40 μm。 面板 A-H 是 188 μm z 堆栈的最大投影。纤维的间距为 35 μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12:通过 VACNF 薄膜对苹果进行染料输送和瞬时转化。 (A-F) 使用共聚焦显微镜生成图像。使用片上方法,将 1 μL 荧光素染料液滴(10 μM,B 和 D)或 1 μL 编码 pUBQ 10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) 的质粒在 VACNF 薄膜上干燥,然后使用化妆涂抹器将其卷到水果表面。将荧光素染料递送至苹果表皮,并在(B)10分钟和(D)2小时后成像。 (D)染料在递送后需要一些时间才能扩散到细胞中。(F) 48 小时后通过 VACNF 薄膜递送和表达 (A,C,E) 无处理对照(-染料/DNA-YFP、-纤维)。比例尺为 40 μm。 面板 A-D 是来自 z 堆栈的单个平面图像。图 E 和 F 是 53 μm z 堆栈的最大投影。光纤间距为 35 μm。箭头表示荧光素或YFP信号。* 表示纤维。请点击这里查看此图的较大版本.
图13:使用植物上或片上VACNFs方法对拟南芥叶片进行瞬时转化。(答-H) DNA 递送后 48 小时使用共聚焦显微镜采集图像。(A,C,E,G)植物上方法:将1μL编码pUBQ10:YFP(DNA−YFP)(200ng)的质粒置于拟南芥叶的背面。芯片的位置使它们与液滴接触,镊子用于将芯片敲击到叶组织中。(B,D,F,H)片上方法:将1μL DNA - YFP(200 ng)在VACNF芯片上干燥15分钟,然后用镊子将芯片器皿敲入拟南芥叶的背面。+DNA-YFP,+用于(A)厂上和(B)片上的光纤。对照:(C,D)-DNA-YFP,+纤维;(E,F)+DNA-YFP,-纤维;和(G,H)-DNA,-纤维。(I) 使用YFP通道荧光从2-3个实验组合的5个生物重复的图像中,25 20 × 20 μm区域的相对平均荧光信号强度图。由于自发荧光,含有气孔(*)的区域被排除在外。从每个平均值中减去 -DNA-YFP、-Fibers 条件的平均荧光强度。采用二因素方差分析(和Tukey检验)进行显著性检验,误差线表示均值的标准误差。不同字母表示处理间差异显著(P < 0.0001)。显示的所有图像均为 40 μm z−stacks 的最大投影。比例尺为 20 μm。白色箭头表示图像中的纤维。光纤间距为 35 μm。该图经Morgan等人许可转载7。请点击这里查看此图的较大版本.
图 14:使用 VACNF 薄膜对洋葱进行瞬时转化。 在 DNA 递送后 48 小时使用共聚焦显微镜获取图像。使用片上方法,将编码 pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) 的 1 μL 质粒 DNA 在 VACNF 薄膜上干燥10 分钟,然后将其滚动到植物器官表面。(A)将DNA-YFP递送至洋葱表皮,YFP在洋葱表皮中表达。(B) 无治疗对照;(C)对照(+DNA-YFP,-纤维)和(D)对照(-DNA-YFP,+纤维)。比例尺为40μm。纤维的间距为 35 μm。图像是 115 μm z 堆栈的最大投影。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 15:VACNF 薄膜应用对生菜的组织损伤 。 (A-D) 使用共聚焦显微镜生成图像。(A)采用片上方法通过VACNF薄膜将DNA递送至莴苣叶片。将pUBQ 10:YFP DNA(200ng)液滴在VACNF薄膜上干燥10分钟,然后将其卷到分离的生菜叶的背面,并在湿度室中储存4天。(B)对照(-DNA-YFP,+纤维)。(C)对照(+DNA-YFP,-纤维),(D)不处理(-DNA-YFP,-纤维)。比例尺为 40 μm,VACNF 的间距为 35 μm。箭头表示由于用力过大而碾压柔性基材而造成的植物损伤。请注意,在其他实验中实现了 VACNF 介导的生菜中成功的 DNA 递送7。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 16:VACNF 介导的植物递送工作流程。 在第一阶段,使用SEM检查纤维的几何形状。为了正确输送,光纤需要直径为 <200 nm 的尖端。如果在柔性基板上使用纤维,下一步是确认光纤正在转移到 SU-8 上,并通过 SEM 检查暴露纤维的高度。在第二阶段,我们尝试使用刚性或柔性基质将染料输送到所选的植物/器官中,从而测试了纤维的有用性。使用 1 μL 液滴,将其放置在植物表面或在芯片/薄膜上短暂干燥。在此步骤和所有其他步骤中,必须使用适当的对照(-染料、-纤维、-染料、+纤维和+染料、-纤维),以确保信号来自 真正的 染料输送。在III阶段,确认目的基因存在于质粒中,确定要递送的DNA浓度,并测试递送后的最佳时间以检查表达。在IV期,使用共聚焦显微镜评估结果,以检查递送标记物的表达。该图经 Morgan 等人许可修改 7. 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在本文中,我们提出了构建垂直排列的碳纳米纤维阵列的方法,将纤维转移到柔性基质上,并将纤维在刚性或柔性基质中应用于植物,用于将生物分子或染料递送给植物。我们描述了两种通用方法,即片上方法和工厂上方法,用于沉积引入的材料,并展示了在刚性基板上的纤维以及使用VACNF薄膜的片上方法的成功结果。这些纤维的应用在实践和理论上比传统的植物转化方法(粒子轰击、通过PEG或电穿孔的原生质体转化)更简单,可用于对农杆菌介导的转化不敏感的植物。然而,只有少数细胞被转化。
垂直排列的碳纳米纤维是在橡树岭国家实验室纳米相材料科学中心通过其用户程序生产的。用户可以申请使用该设施生产VACNF。或者,VACNF芯片可以在洁净室中使用带有碳源的直流等离子体增强化学气相沉积机生产22,23。使用所描述的方法,有几个步骤对于纤维的生产、纤维转移和 VACNF 芯片/薄膜的应用至关重要。要使纤维应用起作用,纤维必须是直的,并且在尖端具有 <200 nm 的锥形直径才能成功输送到植物细胞中 6,7(图 3)。为了制造特定尺寸和间距的碳纳米纤维,可以改变多种参数,包括网点大小、横向间距和沉积的催化剂量。为了选择用于碳纳米纤维生产的最佳网点尺寸,从各种网点尺寸生长纤维(如图5所示)。我们发现直径为 300 nm 的光纤效果最好,因此选择了这种网点尺寸(图 5)。在找到正确的参数后,我们希望使用具有 >50% 光纤且具有理想几何形状(直且尖端直径 <200 nm)的芯片。为了检查纤维的几何形状,我们使用扫描电子显微镜对VACNF芯片/薄膜样品的随机视场进行成像。
此外,纤维必须具有一定的最小长度才能在植物细胞内实现输送。生产不同长度纤维的重要性在于,可以使用更长的纤维来穿透更深的组织层。较长的纤维(长度>40 μm)对于柔性薄膜至关重要,因为纤维转印的工作原理是将纤维从其基部折断,并且需要在纤维顶部分层SU-8。用于该协议的SU-8层的工作厚度为20-35μm。在各种植物(弯曲或扁平)的表皮内完成输送所需的最小高度为 10-15 μm 6,7。因此,长度为 >40 μm 的纤维是 VACNF 薄膜所必需的。在生产碳纳米纤维时,需要考虑几个不同的参数:催化剂材料、催化剂几何形状、催化剂材料的厚度以及PECVD腔内的条件(气体比、压力、温度、电流、喷淋头高度和生长时间)8,9,24,25。为了生产Morgan等7和Davern等6使用的长度超过25 μm的碳纳米纤维,我们增加了Ni催化剂的用量,改变了乙炔氨的比例,并增加了电流和生长时间。此外,我们更加关注催化剂材料的几何形状。为了产生高大的直纤维,沉积的催化剂需要具有曲棍球形状,而不是类似于火山的形状(图4)。火山结构是由升空后光刻胶的残余物产生的。为了防止火山的形成,在电子束光刻过程中使用双层PMMA来形成底切26。底切有助于沉积金属催化剂的剥离(图2)。催化剂的厚层对于高VACNFs的生长很重要。Merkulova等人24研究了VACNFs的形态。VACNF的垂直排列是由于Ni催化剂尖端型生长和垂直于衬底的直流电位排列(图6)。喷淋头描述了PECVD反应器的几何形状(图6),并作为电场电位的来源27。
为了用电子束光刻技术定义催化剂点阵列,我们应用了电子束光刻胶(聚甲基丙烯酸甲酯),然后使用电子束在光刻胶上以特定形状和特定位置在光刻胶上打小孔。将所需直径的孔放置在具有定义间距(间距)的规则网格上,并在将基板加载到机器之前将指定所需图案的文件加载到电子束光刻工具中。除了纤维高度外,纤维转移成功的另一个关键参数是在丙酮浴中花费的时间。VACNF薄膜需要在丙酮浴中放置足够长的时间,以使其边缘开始卷曲;如果它们在丙酮浴中放置的时间太短,它们就更难从芯片上取下,并且可能会破裂。芯片越老,它们在丙酮浴中停留的时间就越长。在丙酮浴之后,将薄膜/芯片置于异丙醇和水中以除去接触丙酮并去除纤维上的保护性光刻胶。
为了进行旋涂,将晶圆或晶圆片放置在旋涂机的真空吸盘上,并使用旋涂机的测试功能验证晶圆的中心位置。将光刻胶的小水坑(直径~2.5 cm)施加到晶圆的中心并纺丝(3000 rpm,持续45秒) 图8中包括纺涂前后的纤维图像,显示了纤维几何形状(高度、方向和间距)的保存情况。纤维的存在会导致光刻胶在纤维底部涌出,并导致层比预期的更厚。VACNF生长后的旋涂已被其他组探索11,18。
该工艺中另一个至关重要的步骤是确保对VACNF芯片/薄膜施加适量的力。输送机制依赖于纤维通过镊子在刚性基质 6,7 上敲击的冲击力或在柔性基质上使用迷你化妆涂抹器滚动在细胞壁上进行小穿刺。纤维可能会也可能不会断裂并保持嵌入植物细胞6,7 而不会影响结果,但结合检查染料吸收和组织损伤的练习对于获得正确的压力是必要的。此外,在使用 VACNF 芯片/薄膜递送 DNA 后选择适当的成像时间点也很重要,因为可检测表达的时间因植物物种和递送载体类型而异7(图 16)。
尽管这种方法广泛适用于植物,但它有一些局限性。例如,在VACNF薄膜中添加一层薄薄的氧化硅并不总是导致薄膜完全亲水,因为在SU-8的顶部添加了光刻胶保护层。如果这个问题成为现实,则可以将更厚的氧化硅层应用于VACNF。为了测试薄膜是疏水的还是亲水的,可以将它们放入水中。如果薄膜下沉,它们是亲水的,如果它们漂浮,它们是疏水的。此外,生产的纤维批次之间可能存在差异。在直流-PECVD机器中生长光纤时,有几个参数可以改变;该协议中描述的是两种不同量的Ni催化剂的一组参数。此外,Ni催化剂的晶体取向无法控制28 ,一些支化将不可避免地导致纤维的产生。
虽然我们在本文中展示了使用刚性和柔性底物将荧光素染料和 DNA 递送至植物细胞,但该方法应广泛适用于其他生物分子和基因修饰方法,例如,用于苹果或其他水果等植物系统的 RNAi 沉默,在这些系统中,产生稳定的转基因系需要数年时间。此外,这些纤维还可用于递送遗传编辑材料或用于植物的稳定转化。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
纳米纤维阵列是在纳米相材料科学中心制造的,该中心是能源部科学用户设施办公室(提案ID:CNMS2019-103和CNMS2022-A-1182)。CNMS的支持是通过同行评审的提案系统授予的,并免费提供给打算发表其结果的成功申请人(http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml)。我们感谢Kevin Lester和CNMS在纳米纤维阵列生产方面的帮助。我们感谢 John Caughmen 博士、Timothy McKnight 博士、Amber Webb 博士、Daryl Briggs 和 Travis Bee 对实验设计的重要讨论。我们感谢Adam Rondinone博士提供PECVD机器的原理图。我们感谢莱斯利·卡罗尔(Leslie Carol)的科学插图。这项工作由美国能源部生物成像科学计划、科学、生物与环境研究办公室、DE-SC0019104和美国农业部资助,电话:2021-67013-34835。JMM得到了美国农业部:国家粮食和农业研究所:农业和食品研究计划博士前奖学金2021-67034-35167的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
Apples | Grocery store | No product number | |
Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
Onions | Grocery store | No product number | |
Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
Strawberries | Grocery store | No product number | |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
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