Summary
Burada, dikey olarak hizalanmış karbon nanofiberlerin (VACNF'ler) mikrofabrikasyon edilmesi, VACNF'lerin esnek substratlara aktarılması ve VACNF'lerin biyomolekül ve boya dağıtımı için bitkilere hem sert hem de esnek substratlar üzerinde uygulanması için yöntemleri açıklıyoruz.
Abstract
Biyomoleküllerin ve geçirimsiz boyaların bozulmamış bitkilere verilmesi büyük bir zorluktur. Nanomalzemeler, DNA'nın bitkilere verilmesi için gelecek vaat eden araçlardır. Bu yeni araçlar ne kadar heyecan verici olsa da, henüz yaygın olarak uygulanmadılar. Sert substrat (destek) üzerinde üretilen nanomalzemelerin kavisli bitki yapılarına başarılı bir şekilde uygulanması özellikle zordur. Bu çalışma, dikey olarak hizalanmış karbon nanofiber dizilerinin mikrofabrikasyonu ve bunların sert bir alt tabakadan esnek bir alt tabakaya aktarılması sürecini açıklamaktadır. Bu liflerin (sert veya esnek substratlar üzerinde) bitkilere geçici dönüşüm veya boya (örneğin floresein) iletimi için nasıl kullanılabileceğini detaylandırıyor ve gösteriyoruz. Esnek VACNF dizileri oluşturmak için VACNF'lerin sert silikon alt tabakadan esnek bir SU-8 epoksi alt tabakaya nasıl aktarılabileceğini gösteriyoruz. SU-8'in hidrofobik doğasının üstesinden gelmek için, esnek filmdeki lifler ince bir silikon oksit tabakası (2-3 nm) ile kaplandı. Bu lifleri kavisli bitki organlarına vermek için kullanmak için, VACNF filmlerinin lif tarafına 1 μL'lik bir damla boya veya DNA çözeltisi bırakıyoruz, 10 dakika bekliyoruz, filmleri bitki organına yerleştiriyoruz ve lifleri bitki hücrelerine sürmek için yuvarlanma hareketiyle bir çubuk kullanıyoruz. Bu yöntem ile kıvrımlı yüzeylere sahip bitki organlarında boya ve DNA iletimi elde ettik.
Introduction
Bitki dönüşümü (hem geçici hem de kararlı) henüz tüm bitki dokularında ve türlerinde yaygın olarak elde edilebilir hale gelmemiştir. Bitkilerin geçici dönüşümü, plazmitlerde kodlanan genlerin geçici olarak bitkilere sokulduğu, ancak genoma kararlı bir şekilde dahil edilmediği bir süreçtir. Protoplastların partikül bombardımanı, Agrobakteri, elektroporasyon veya polietilen glikol tedavisini kullanan geleneksel yöntemler yavaştır veya hantal olabilir. Ayrıca, her bitki türüiçin geçerli değildirler 1,2,3,4. DNA iletimi için nanomalzemelerin kullanımı, henüz emekleme aşamasında olan gelişen bir alandır5. Nanomalzemeler, özellikle karbon nanolifleri, yara tepkisine neden olmadan bitki yapraklarına proteinler, dekstranlar ve boyalar vermek için başarıyla kullanılmıştır6. Bu çalışmanın amacı, bitkilere biyomoleküller veya boyalar vermek için bir tür nanomalzeme olan karbon nanofiberlerin kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlamaktır. Burada, çeşitli bitki organlarındaki hücrelerin geçici dönüşümüne izin veren, tercih edilen biyomolekül olarak DNA'ya odaklanıyoruz.
Daha önce, Morgan ve ark.7 , marul, N. benthamiana ve kavak yapraklarını ve Arabidopsis'in hem yapraklarını hem de köklerini geçici olarak dönüştürmek için sert silikon substrata yapıştırılmış karbon nanofiberlerin kullanımını gösterdi. Dönüşümler çeşitli organlarda başarılı olmasına rağmen, liflerin kökler veya meyveler gibi kavisli yüzeylere sahip bitki dokularına uygulanması daha zordu. Nanolifler için esnek bir desteğin, organın şekline daha iyi uyarak dağıtım verimliliğini artırabileceğini düşündük.
Burada, dikey olarak hizalanmış karbon nanofiberlerin üretilmesi ve tasarlanması, VACNF'lerin esnek substratlara aktarılması ve biyomoleküller ve boyalar sağlamak için bitkilere hem sert hem de esnek substratlar üzerinde VACNF'lerin uygulanması için kullanılan yöntemleri detaylandırıyoruz. Karbon nanolifler, Ni katalizörü ile doğru akım katalitik plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme (dc C-PECVD) kullanılarak üretildi. Ni katalizör noktalarının konumu, çapı ve yüksekliği, Melechko ve ark.8,9 tarafından tarif edildiği gibi elektron ışını litografisi, metal buharlaştırma ve kaldırma işlemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak kontrol edildi. Çift katmanlı bir e-ışın direnci kullanılarak, daha uzun lifler10 vermek için alt tabaka üzerinde daha kalın bir Ni katalizörü biriktirilebilir. Sert bir alt tabakadan esnek bir alt tabakaya lif transferi, Fletcher ve ark.11'de açıklanan yöntemlerin bir modifikasyonuna dayanır ve mevcut yöntemler, amorf bir karbon tabakasının veya kurban edilen bir fotorezist tabakanın kullanılmasından önce gelir. Elyaf transferi ile SU-8 kaldırma, SU-812,13,14'ün az pişirilmesi ve az maruz bırakılmasından kaynaklanan içsel gerilme gerilimi kullanılarak elde edilir. Karmaşık bir polimer olan SU-8, doğal olarak hidrofobiktir, bu da DNA dağıtımını kolaylaştırmak için kullanımını zorlaştırır. SU-8'in hidrofobik doğasına karşı koymak için, lifler SU-8'e gömüldükten sonra atomik katman biriktirme15 yoluyla ince bir silikon oksit tabakası uyguluyoruz. Liflerin biyomolekül/boya dağıtımı için sert bir substrat üzerine uygulanması, Davern ve ark.6'da açıklanan cımbızla dokunmanın darbe kuvvetini ve Morgan ve ark.7'de açıklanan tesis içi ve çip üstü yöntemleri kullanır. Esnek VACNF filmleri, Morgan ve ark.7'ninçip üzerinde yönteminde olduğu gibi, önce film üzerindeki DNA veya boya damlacıklarının yarı kurutulması ve ardından küçük bir makyaj aplikatörü16,17 kullanılarak filmlerin kavisli bitki yüzeyleri üzerinde yuvarlanmasıyla kavisli bitki yüzeylerine uygulanır. Şekil 1, sert ve esnek substratlardaki liflerin bitkilere uygulanması için çeşitli yaklaşımları göstermektedir.
Protocol
1. VACNF üretimi (Şekil 2 ve Şekil 3)
- Polimetil metakrilat (PMMA) 495 A4 ile silikon bir gofreti spincoat yapın, 4000 rpm'de direnç gösterir ve 180 °C'de 5 dakika pişirin.
NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce gofreti 10 saniye soğumaya bırakın. - İkinci bir direnç katmanını (PMMA 950 A2) döndürün ve 180 °C'de 5 dakika pişirin.
- 300 mm x 10 mm'lik dizilerde belirli bir yanal aralıkta (aralık: 35 μm veya 3 μm) 3 nm çapa sahip katalizör noktalarını tanımlamak için elektron ışını litografisini kullanın.
- 30-40 mL 1: 3 metil-izobütil keton: izopropil alkol (IPA) içinde 1.5 dakika direnç geliştirin, ardından IPA ile durulayın veN2 ile kurutun.
NOT: Bir parlak alan mikroskobu (20x objektif) kullanarak nokta dizisini kontrol edin. - Kalan direncin gofretini bir silikon aşındırıcıda oksijen plazmasına (descum) 6 saniye maruz bırakarak temizleyin.
- Önce yapışkan bir metal tabakasını (Ti veya Cr, 10 nm) biriktirmek için elektron ışını buharlaşmasını kullanın ve ardından Ni katalizörü (130 nm veya 150 nm) olan ikinci bir tabakayı biriktirin. Ti veya Ni metal biriktirme sırasında, görüş hattı biriktirme için akımı 0.2 kV'da 10 A'nın altında, basıncı 5 x 10-6 Torr'un altında ve biriktirme hızını ~1 A/s'de tutun.
- Alttaki direnç tabakasında biriken metali (Ni) çıkarmak için sıralı banyo sonikasyonunu kullanın ve Ni'yi doğrudan silikon gofret üzerinde biriktirin. Bu işleme kalkış denir.
- Bunun için asetonlu 3 kap hazırlayın ve gofreti asetonda 1 dakika boyunca banyo sonikasyonu; oda sıcaklığında (RT, 20 °C) 35 kHz frekansında 3 kez tekrarlayın. IPA ile durulayın ve N2 ile kurulayın.
NOT: Asetonun gofret üzerinde kurumasına asla izin vermeyin. Son aseton sonikasyonundan sonra, hemen IPA ile durulayın ve ardındanN2 gazı ile kurulayın. Herhangi bir noktada gofret erken kurursa (IPA durulamasından önce), tüm fazla metal ve direncin çıkarılmaması ve asetonun bir kalıntı bırakması olasılığı vardır.
- Bunun için asetonlu 3 kap hazırlayın ve gofreti asetonda 1 dakika boyunca banyo sonikasyonu; oda sıcaklığında (RT, 20 °C) 35 kHz frekansında 3 kez tekrarlayın. IPA ile durulayın ve N2 ile kurulayın.
- Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak katalizör şeklinin geometrisini kontrol edin. VACNF yongalarının SEM görüntülerini yakalamak için, sahneyi 30°'lik bir açıyla eğin ve ~100 pA ışın akımı ve ~5 mm çalışma mesafesi ile 1-3 kV'luk bir voltaj kullanın.
NOT: Katalizör bir hokey diski (kompakt bir silindir) gibi görünmelidir (Şekil 4). Kompakt silindirin yüksekliği, silikon gofret üzerinde biriken Ni'nin kalınlığını yansıtmalıdır. Ni noktasının profili uzunsa ve üstte içbükey görünüyorsa, bir yanardağa benziyorsa (Şekil 4), katalizörün karbon nanofiberlerin9 dallanmasına neden olan çoklu Ni damlacıklarına ıslanma olasılığı daha yüksektir (Şekil 4 ve Şekil 5). Bu tür sorunlar, uzun biriktirme süreleri veya kaldırma prosedürüyle ilgili sorunlar nedeniyle metal buharlaşması sırasında dirençli erimeden kaynaklanabilir (Şekil 4 ve Şekil 5). - Silikon gofreti dörde bölün ve asetilen/amonyak karışımı ile doğru akım plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme odasına (dc-PECVD) yerleştirin. Nanoliflerin uzunluğunu ve konikliğini kontrol etmek için büyüme parametrelerini optimize edin (uçlar <200 nm).
- 1-1,5 A akım ve 440-560 V voltaj aralığı kullanın. Lifleri büyütürken, makine ve alt tabaka 620 °C'ye kadar ısınırken amonyak akışlı bir ön işlem aşaması kullanın. Plazmayı çalıştırmadan önce karbon kaynağını (asetilen) 10 saniye açtığınızdan emin olun.
NOT: PECVD makine çalışma parametrelerinin optimize edilmesi gerektiğinde çeyrek gofretler kullanılır. Uzunlukları 40 μm'den büyük ve uçları çapı 200 nm'den küçük olan lifler üretmek için aşağıdaki parametreler önerilmektedir: 130 nm'lik bir Ni katalizör kalınlığı ile 1.75 A'lık bir akım, 70 dakikalık büyüme süresi ve bir asetilen : dakikada 45 standart santimetreküp amonyak oranı (sccm): 100 sccm. 150 nm'lik bir Ni kalınlığında, 1.5 A'lık bir akım, 80 dakikalık bir büyüme süresi ve 48 sccm: 100 sccm'lik bir asetilen: amonyak oranı kullanın. Katalizör kalınlığından bağımsız olarak VACNF'leri büyütmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: 620 °C büyüme sıcaklığı, plazma sırasında 10 torr basınç ve 20 mm duş başlığı yüksekliği (Şekil 6).
- 1-1,5 A akım ve 440-560 V voltaj aralığı kullanın. Lifleri büyütürken, makine ve alt tabaka 620 °C'ye kadar ısınırken amonyak akışlı bir ön işlem aşaması kullanın. Plazmayı çalıştırmadan önce karbon kaynağını (asetilen) 10 saniye açtığınızdan emin olun.
- Elde edilen fiberlerin geometrisini, 1 kV'luk bir ivme potansiyeli ile 30°'lik bir eğimde SEM kullanarak değerlendirin.
NOT: Optimum lifler düz ve dallanmasız olacaktır. Ni katalizörünün kristal oryantasyonunu elektron ışını evaporatörü ile kontrol etmek imkansızdır. Sonuç olarak, katalizör ıslanması nedeniyle dallanan bazı lifler olacaktır9. Ayrıca, kristal oryantasyonu VACNF'lerin farklı yüksekliklere çıkmasına neden olur, bu nedenle tüm VACNF'lerde tek tip yükseklikler zordur. - 45 s boyunca 1000 rpm'de liflerin üzerine bir fotorezist tabakası (SPR955) eğrin. Ardından 1/4 gofreti bir küp kesme testeresi kullanarak 3 mm x 3 mm'lik diziler halinde doğrayın. Lifleri daha sonra kullanmak üzere bu noktada saklayın.
NOT: Lifleri esnek bir alt tabakaya aktarmayı planlıyorsanız adım 1.11'i gerçekleştirmeyin.
2.VACNF'lerin esnek bir alt tabakaya aktarılması (Şekil 7 ve Şekil 8)
- Lifler sentezlendikten sonra, spincoat SU-8 2015, 45 s boyunca 4000 rpm'de gofretler veya çeyrek gofretler üzerine fotorezist.
- Gofretleri 95 °C'de 3 dakika yumuşak pişirin.
- Bir kontak hizalayıcı kullanarak, gofreti, 95 mJ/cm2'de elektron ışını litografisinden tanımlanan desenle hizalanan 3 mm 3 mm dizi desenli bir maske ile ortaya çıkarın.
NOT: En uzun fiberden 20 μm daha büyük bir pozlama aralığına sahip bir yakınlık temas modu kullanın. İşlemin bu aşamasında liflerin devrilme olasılığı vardır. - Maruz kaldıktan sonra 95 °C'de 6 dakika pişirin.
- Gofret'i SU-8 geliştiricisinde 15 saniye boyunca geliştirin, IPA ile durulayın ve gofreti yukarıdan aşağıya doğru hareket ettirerekN2 ile kurutun.
NOT: Gofret geliştirirken, tamamen suya batırıldığından emin olun. - 45 s'de 3000 rpm'de ve 90 °C'de 30 s'de yumuşak fırında pişirmede koruyucu ince fotorezist tabakaya (SPR 955 CM 0.7) sahip spincoat desenli gofretler.
- İnce bir silikon oksit tabakasını, 100 ° C'de 22 döngü boyunca bir atomik katman birikimine yerleştirerek gofrete (2-3 nm) bırakın.
- Gofret'i 3 mm x 3 mm kareler halinde kesmek için bir küp kesme testeresi kullanın. Küp kesme testeresini gofret üzerinde önceden var olan desene hizalayın.
- 3 kV ivme potansiyeli ile 30° eğimde SEM kullanarak elde edilen liflerin geometrisini değerlendirin.
- Cipsleri uzun süreli kullanım için saklıyorsanız burada durun (>1 hafta). Cipsleri karanlıkta saklayın.
- Esnek alt tabakaları sert alt tabakalardan ayırmak için, tek tek talaşları 30 dakika boyunca veya SU-8 kıvrılmaya başlayana kadar asetona yerleştirin.
- SU-8 filmlerini (sert alt tabakalara yapıştırılmış veya çıkarılmış) IPA ile 5 dakika ve ardından 5 dakika su ile yıkayın. Cipsleri taşırken yapışkan pedli ticari bir kutuya koyun.
- İSTEĞE BAĞLI: SU-8 filminin elyafsız tarafını suda çözünür bant üzerine veya ince polietilen tereftalat (PET) (12.5 μm kalınlığında) arkalıklı ince silikon kauçuğun üzerine yerleştirin.
- SU-8 filmini aktarmak için bir cımbız kullanın. Banda/silikon kauçuk-PET'e yapışmasına yardımcı olmak için SU-8 karesinin kenarlarına bastırın; Bu, liflerin kopmasını önlemek içindir. Bu noktada, VACNF filmleri hemen kullanıma hazırdır.
- Bir silikon kauçuk/PET tutucu hazırlamak için aşağıdakileri yapın: silikon kauçuk için 2 parçalı bir kit kullanarak iki parçayı (elastomer ve çapraz bağlayıcı) karıştırın. Ardından, bir kare PET kesin ve şeffaf plastik bir tabağa bantlayın. PET'in üzerine çok ince bir silikon kauçuk tabakası dökün ve 80 °C'de 1-2 saat kürleyin.
3. Sert bir substratta lifler kullanılarak bitki üzerinde yöntem (verilecek bir damla çözeltinin bir bitki yüzeyine yerleştirildiği) (Şekil 1A)
- Kullanmadan önce aseton (%100, 5 dk), IPA (%100, 5 dk) ve ddH2O(5 dk) artımlı yıkamalarla fotorezisti çıkarın.
- Destek için saplanacak bitki dokusunu sert bir yüzeye yerleştirin.
- Bitki dokusunun yüzeyine 1 μL'lik bir damla boya veya DNA (200 ng) yerleştirin.
- Damlacığın üstüne, lifler damlacık ile temas edecek şekilde yönlendirilmiş olacak şekilde sert bir alt tabakaya sahip bir VACNF çipi yerleştirin.
NOT: Talaşların yönü, gofretin "parlaklığı" ile belirlenebilir. Çipin parlak tarafında lifler vardır ve opak tarafında yoktur. - Bir cımbızın düz tarafını kullanarak çipe dokunun. Çipin temas ettiği bitki alanını yumuşak uçlu bir işaretleyici kullanarak işaretleyin. Teslimattan sonra VACNF çiplerini çıkarın.
NOT: Dokunulduğunda uygulanan kuvvet miktarı, kullanılan bitki dokusunun türüne bağlı olarak değişecektir. Liflerin kazığa oturtulmasından önce talaşlara dokunma alıştırması yapılması tavsiye edilir. Bitki dokularına zarar vermekten kaçının. Bitki dokusundaki VACNF çipinin ana hatları görüldüğünde hasar belirgindir. - Kontroller için 3.1-3.5 arasındaki adımları tekrarlayın (+Boya/DNA, -Lifler; -Boya/DNA, +Lifler; ve -Boya/DNA, -Lifler). -Lifler, bir çipin lifsiz tarafıdır.
- Gerekirse bozulmamış bitkileri veya eksize edilmiş bitki organlarını uzun gün koşullarında (16 saat aydınlık, 8 saat karanlık) nemli odalarda saklayın. Eksize edilen organlar için, ıslak kağıt havlulu plastik bir Petri kabı kullanın.
4. Çip üzerinde yöntem (burada verilecek bir çözelti damlası bir VACNF çipine yerleştirilir), sert alt tabaka (Şekil 1B)
- Kullanmadan önce aseton (%100, 5 dk), IPA (%100, 5 dk) ve ddH2O(5 dk) artımlı yıkamalarla fotorezisti çıkarın.
- Sert substratlı VACNF çipinin fiber tarafına 1 μL boya damlası veya plazmit DNA (200 ng) damlatın. Damlacığı çipin ortasına yerleştirdiğinizden ve birkaç lifi kapladığınızdan emin olun. Damlacığı 15 dakika kurumaya bırakın.
NOT: Talaşların yönü, gofretin "parlaklığı" ile belirlenebilir. Çipin parlak tarafında lifler vardır ve opak tarafında yoktur. - Yapraklar veya diğer eksize edilmiş organlarla çalışırken, bunları sert bir yüzeyin üzerine yerleştirin. Bozulmamış bitkilerle çalışırken, VACNF'lerin uygulandığı organın altına sert bir yüzey yerleştirin.
- 15 dakikalık kurutma adımından sonra, VACNF çipini lif tarafı bitki dokusu ile temas edecek şekilde konumlandırın. Bir cımbızın arka ucuyla çipe dokunun.
NOT: Dokunulduğunda uygulanan kuvvet miktarı, kullanılan bitki dokusunun türüne bağlı olarak değişecektir. Çiplere dokunma alıştırması yapmanız önerilir. - Tesis üzerinde yöntemin 3.6-3.7 adımlarını tekrarlayın.
5. SU-8 filmlerindeki VACNF'lerin çip üzerinde yöntemle bitki dokusuna uygulanması (Şekil 1C)
- SU-8 filmin elyaf tarafına 1 μL damla boya veya DNA (200 ng) yerleştirin ve 10 dakika kurumasını bekleyin. Damlacığı çipin ortasına yerleştirdiğinizden emin olun.
NOT: Kullanılan alt tabakaya bağlı olarak farklı kuruma süreleri vardır. - Bir çift keskin cımbız kullanarak VACNF filmini bitki yüzeyine yerleştirin.
NOT: SU-8 filmleri havada ne kadar uzun süre kalırsa, filmler o kadar kırılgan hale gelir. SU-8 filmlerinin kaybolma riskini sınırlamak için, tüm tesislerin/numunelerin ve ekipmanların SU-8 filmlerinin yakınında bulunduğundan emin olun. - Küçük bir makyaj aplikatörünü VACNF filminin üzerine nazikçe yuvarlayın. Esnek alt tabakaların yerleştirildiği alanları yumuşak uçlu bir işaretleyici ile işaretleyin. Esnek alt tabakaları bant kullanarak bitki yüzeyinden çıkarın.
NOT: Makyaj aplikatörünü yuvarlarken uygulanan kuvvet miktarı, kullanılan bitki dokuları arasında değişecektir. Biyomolekül veya boya dağıtımını gerçekleştirmeden önce VACNF filmlerini uygulama alıştırması yapın. Bitki dokularında gözle görülür hasar, bitki dokusundaki VACNF filminin ana hatları görüldüğünde belirgindir. - Kontroller için 5.1-5.3 adımlarını tekrarlayın ve bitkileri tesis üzerinde yöntemin 3.7 adımında belirtildiği gibi saklayın.
6. Tüm dağıtım yöntemleri için mikroskopi ve görüntü analizi
- Teslim edilen floresan probu/raportör için uygun emisyon ve uyarma dalga boylarını kullanarak bir konfokal mikroskop kullanarak numuneleri görüntüleyin.
NOT: Geçici dönüşüm için gereken süre, bitki türüne ve verilen işaretleyiciye göre değişir. Örneğin, floresan belirteçlerin ekspresyonu Arabidopsis'te 48 saat sonra, marul yapraklarında96 saat sonra tespit edildi 7. - Görüntüleme yaparken, lifleri kopmuş bir bölgeye odaklanmaya çalışın. Liflerin farklı yönleri olacaktır. Teslimatın başarısı, kopmuş liflerin görünümüne bağlı değildir.
NOT: Lifler, PECVD18'deki lif oluşumundan kaynaklanan silisyum nitrür tabakasının oluşumu nedeniyle en yaygın uyarma/emisyon ayarlarıyla floresan olacaktır. - Her örnek için en az 5 görüntü yakalayın. Ortaya çıkan sinyal değişecektir.
- ImageJ19 kullanarak floresan değerlerini 20 μm x 20 μm konfokal görüntü alanlarında7 toplam floresan (entegre yoğunluk) olarak ölçün.
Representative Results
VACNF çiplerinin sert veya esnek substratlar üzerindeki belirgin avantajı, biyomolekülleri veya boyaları bir bitki üzerindeki belirli yerlere iletme yeteneğidir (Şekil 1). Burada, teslimatı değerlendirmek için floresan okumaları kullandık. Farklı bitkiler, substratlar ve dağıtım yöntemleri (çip üzerinde veya bitki üzerinde) kullanılarak, boya floreseinin ortaya çıkma zamanlamasında farklılıklar olabilir. VACNF çiplerinin/filmlerinin teslimat için işe yarayıp yaramadığını belirlemek için hızlı bir yaklaşım, boya dağıtımı için elyaf kullanmaktır (Şekil 9). Şekil 9'da farklı zamanlarla etiketlenmiş görüntüler, aynı örneklerden farklı görüş alanlarıdır. Bitki üzerinde yöntem kullanıldığında, floresan mikroskobu kullanılarak doğumdan hemen sonra floresein boyası gözlemlenebilir. Ek olarak, bir bitkiye floresein boyası verildikten sonra aynı görüş alanı zaman içinde görüntülenirse, sinyal yoğunluğu zamanla daha az parlak hale gelir (Şekil 10). Floresein boyası potansiyel olarak görüş alanından yaprağın diğer alanlarına plazmodesmata20,21 yoluyla hareket ediyor olabilir. Bitki üzerindeki yöntemle karşılaştırıldığında, sert alt tabaka üzerinde lifler bulunan yonga üstü yöntemde, boya kazıklı alan boyunca daha yavaş hareket eder (Şekil 9). Bu, boyanın liflerden ayrılmasının/hücrelerde yeniden sulandırılmasının ve dolayısıyla hareket etmesinin daha fazla zaman almasının bir sonucu olabilir.
Esnek substrattaki lifler, çilek ve elma gibi kavisli yüzeylere boya verilmesi için uygundur (Şekil 11 ve Şekil 12). Çilekli esnek bir substrat kullanılarak, hemen güçlü bir floresein sinyali gözlendi (Şekil 11), oysa elmalarda güçlü bir floresein sinyali görmek 2 saat sürdü (Şekil 12B, D). Floresan belirteçleri kodlayan plazmitlerin başarılı bir şekilde verilmesi, ortaya çıkan sinyali bulmak için floresan mikroskobu kullanılarak belirlenebilir (Şekil 12F, Şekil 13 ve Şekil 14). Seçilen bitkinin, liflerle vermek istediğimiz floresan işaretleyiciye benzer bir otofloresan olup olmadığını belirlemek için kontroller gereklidir. Cımbızla uygulanan darbe kuvvetinin bitki dokusuna zarar verip vermediğini veya numune içinde gözlenen floresansın silikon nitrür tabakası18 nedeniyle doğal olarak floresan olan VACNF'lerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için tek başına liflerin kullanılması yararlıdır (Şekil 13C-D). Bitki dokusuna saplanan lifler,H2O2üretimi 6 ile değerlendirildiği gibi yara tepkisini indüklemez. Son olarak, +DNA, -Liflerin kontrolünü kullanarak, DNA'nın bitkiye tek başına dokunma yoluyla girmediğini doğrulamak için gereklidir ve liflerin bitki hücrelerine verilmesi için gerekli olduğunu doğrular (Şekil 13E-F). Floresan değerlerinde önemli bir farkın olmaması ile gösterildiği gibi, sert bir alt tabaka üzerinde VACNF'ler kullanılarak tesis üzerinde veya çip üzerinde dağıtım yöntemleri kullanılırken belirgin bir fark olmamalıdır (Şekil 13I). Çip üzerinde DNA iletimi ile esnek VACNF filmlerinin kullanılması, mağazadan satın alınan elma ve soğanlarda epidermal hücrelerin başarılı bir geçici dönüşümü ile sonuçlandı (Şekil 12F ve Şekil 14).
Başarısız deneyler, farklı görüş alanlarında kırılan liflere sahip olabilir, ancak plazmit DNA veya boya verme girişiminden kaynaklanan bir floresan sinyali olmayacaktır. Bitkiye çok fazla basınç uygulanırsa, belirgin doku hasarı olacaktır (Şekil 15). Bu mekanik hasar, bitkiye mikroskop altında bakıldığında bir hücre tabakası kaldırılmış gibi bitkide küçük delikler veya şeffaf alanlar gibi görünebilir. Bazen çipin izleri görülebilir. DNA iletiminden sonra floresan protein ekspresyonunun tespit edilmediği bir deney de düşük kaliteli DNA kullanımından kaynaklanıyor olabilir, bu nedenle taze DNA hazırlamak faydalı olabilir.
Şekil 1: Sert ve esnek substratlar üzerinde lifler kullanılarak bitki dokusuna boya/DNA iletiminin şeması . (A) Bitki üzerinde, lif aracılı boya/DNA iletimi. Bir yaprağın yüzeyine 1 μL'lik bir damla boya/DNA çözeltisi yerleştirilir ve VACNF çipi damlacığın üzerine yerleştirilir. Bir cımbız kullanarak, çip dokuya hafifçe vurulur. Sert substrat, doku içinde nanolifler bırakarak çıkarılır. (B) Çip üzerinde fiber aracılı DNA iletimi. 1 μL'lik bir boya damlası veya DNA çözeltisi VACNF çipine damlatılır ve 15 dakika kurutulur. Yarı kurutulmuş DNA'ya sahip çip, yaprak yüzeyinin üstüne yerleştirilir ve panel A'da olduğu gibi dokuya dokunulur. (C) Çip üzerinde SU-8 film DNA dağıtımı. Lifler, sert silikon alt tabakadan esnek SU-8 desteğine aktarılır. 1 μL'lik bir boya / DNA çözeltisi damlatılısı, VACNF filmine damlatılır ve 10 dakika boyunca kurutulur. Yarı kurutulmuş boya/DNA içeren VACNF filmi daha sonra bir makyaj aplikatörü kullanılarak kavisli bir bitki yüzeyine yuvarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dikey olarak hizalanmış karbon nanofiber diziler yapmak için iş akışı. VACNF'leri üretmek için, bir çift katmanlı polimetil metakrilat (PMMA 495 A4 ve ardından PMMA 950 A2) bir silikon gofret üzerine döndürülerek kaplanır. Elektron ışını litografisi, çapı 300 nm olan bir nokta dizisini tanımlamak için kullanılır. Direnç daha sonra metil izobütil keton / izopropanol (MIBK / IPA), 1.5 dakika boyunca 1: 3 içinde geliştirilir. Metal bir buharlaştırıcı kullanılarak, gofrete yapışkan bir Ti (10 nm) tabakası ve ardından bir Ni tabakası (130 nm veya 150 nm) uygulanır. Kalan direnç daha sonra kaldırma yoluyla çıkarılır (asetonda banyo sonikasyonu). Katalizör noktalarının geometrisi SEM aracılığıyla incelenir. Katalizörler hokey disklerine benziyorsa ve düzse, plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme (PECVD) makinesine yerleştirilir ve lifler büyütülür. Lifler daha sonra SEM kullanılarak incelendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İdeal dikey olarak hizalanmış karbon nanoliflerin SEM görüntüleri . (A) 30° açıyla görüntülenen, ~35 μm aralıklı ve 10-15 μm yüksekliğe sahip VACNF'lerin elektron mikrografı. Bu görüntü Şekil 7C'de çoğaltılmıştır. (B) ~20 μm aralıklı ve 20-30 μm yüksekliğe sahip ve 30° açıyla görüntülenen VANCF'lerin elektron mikrografı. (C) ~35 μm aralıklı, 50-60 μm yüksekliğinde ve 30° açıyla görüntülenen VANCF'lerin elektron mikrografı. (D) <200 nm çapında VACNF ucunun elektron mikrografı. Elyaf uç çaplarında (150-300 nm) farklılıklar vardır. Lifler 30° açıyla görüntülendiğinden, yükseklikler gerçek yükseklikten sin(30°)=1/2 faktörü ile daha küçük görünmektedir. Paneller A ve B, Morgan ve ark.7'nin izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Büyüyen VACNF'lerden önce katalizör geometrisinin SEM görüntüleri. (A) Kalkıştan sonra katalizörün SEM görüntüsü. Fotorezistin katalizörün kenarında bulunduğunu ve bunun sonucunda bir volkan şekli oluştuğunu unutmayın. (B,C) SEM görüntüleri, tek katmanlı bir PMMA direnci kullandıktan sonra katalizörün volkan şekillerini gösterir. (D) Çift katmanlı PMMA'dan yapılmış istenen hokey diski katalizör şekli. Lifler A, B ve D panellerinde 30° açıyla görüntülendiğinden, yükseklikler gerçek yükseklikten sin(30°) = 1/2 faktörü ile daha küçük görünmektedir. Ölçek çubukları 100 nm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Katalizör nokta boyutunun lif büyümesi üzerindeki etkisi: Katalizör malzemesinin optimum çapını oluşturmak için, lifler 200-600 nm arasında değişen nokta boyutlarından büyütüldü. 400-600 nm arasında değişen nokta boyutları, katalizörün ıslanmasına ve çoklu liflerin büyümesine neden oldu. En iyi lif geometrisi 300 nm çap ile üretilmiştir. Daha küçük noktalar yetersiz lif yüksekliğine yol açtı. Liflerin 30° açıyla görüntülenmesi nedeniyle, yükseklikler gerçek yükseklikten sin(30°) = 1/2 faktörü ile daha küçük görünmektedir. Görüntüler taramalı elektron mikrografı kullanılarak çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'nda (ORNL) kullanılan doğru akım - plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme (dc-PECVD) sisteminin şematik gösterimi. ORNL'deki özel sistem, besleme gazları için reaktör ve plazma çıkışı görevi gören büyük bir duş başlığına sahiptir. Duş başlığı, alt tabaka için ısıtılmış aşamaya göre 300 V'luk bir DC potansiyelinde tutuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Liflerin sert bir alt tabakadan esnek bir alt tabakaya aktarılması için iş akışı. Nanolif sentezi ve incelemesinden sonra, her bir gofret 45 s boyunca 4000 rpm'de SU-8 2015 ile döndürülür. Gofret daha sonra 95 °C'de 3 dakika yumuşak pişirilir. Daha sonra gofret UV ışığına maruz bırakılır ve 95 mJ/cm2'de bir maske hizalayıcıda desenlenir. 95 °C'de 6 dakika sonradan pişirildikten sonra, gofret SU-8 geliştiricisinde 15 saniye boyunca geliştirilir, IPA ile durulanır veN2 gazı ile kurutulur. SPR 955 CM 0.7'lik koruyucu bir direnç tabakası, gofret üzerinde 3000 rpm'de döndürülür ve 90 °C'de 30 saniye boyunca yumuşak fırınlanır. Daha sonra esnek substratı hidrofilik15 yapmak için atomik katman biriktirme (ALD) (100 °C'de 22 döngü) yoluyla gofrete bir silikon oksit tabakası (2-3 nm) eklenir. Gofret daha sonra bir küp kesme testeresi ile 3 mm x 3 mm kareler halinde doğranır. Kullanım sırasında, SU-8 kıvrılmaya başlayana ve içbükey hale gelene kadar (>30 dakika) tek tek yongalar asetona yerleştirilir. Şu anda, çoğu yonga üzerindeki SU-8 tabakası keskin cımbızla kenardan tutulabilir ve alttaki silikon alt tabakadan sağlam bir 3 mm kare film olarak soyulabilir. Film daha sonra IPA ve suda her biri 5 dakika boyunca art arda yıkanır ve hemen kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Sert bir alt tabakadan esnek bir alt tabakaya lif transferinin SEM görüntüleri. Gösterilen resimler temsilidir ancak farklı örneklerden alınmıştır. (A) PECVD büyümesinden sonra uzun lifler (Şekil 2C'deki ile aynı görüntü). (B,C) SU-8 uygulamasından sonra lifler. Epoksi, liflerin tabanının etrafında fışkırır. Açıkta kalan lif uzunluğu 5 μm ila 30 μm arasında değişiyordu. (D) Kalkıştan sonra Su-8'e gömülü lifler geometrilerini korudu. Liflerin 30° açıyla görüntülenmesi nedeniyle, yükseklikler gerçek yükseklikten sin(30°)=1/2 faktörü ile daha küçük görünmektedir. Panel A, Morgan ve ark.7'nin izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Arabidopsis yapraklarına sert yüzeyler üzerinde liflerle çip üzerinde ve bitki üzerinde yöntemler kullanılarak boya dağıtımı. (A-P) Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak elde edildi. Çip üzerinde yöntem (AH): 1 μL 10 μM floresein boya, VACNF yongaları üzerinde 15 dakika boyunca kurutuldu ve daha sonra yongalar Arabidopsis yapraklarının abaksiyal tarafına cımbızla vuruldu. (A-D) Teslimattan sonra 5-15 dakika içinde görüntülenen yapraklar. (E-H) Doğumdan 1 saat sonra görüntülenir. (A,E) +Boya, +Lifler. Kontroller: (B,F) -Boya, -Lifler; (C,G) -Boya, +Lifler; (D,H) +Boya, -Lifler. (I-P) Bitki üzerinde yöntem: Bitki yüzeyine 1 μL 10 μM floresein boya yerleştirildi, talaşlar damlacık ile temas edecek şekilde konumlandırıldı ve çipi Arabidopsis yapraklarının abaksiyal tarafına vurmak için cımbız kullanıldı. (I-L) teslimattan sonraki 5-15 dakika içinde ve (M-P) teslimattan 1 saat sonra görüntülenir. (I,M) +Boya, +Lifler. Kontroller: (J,N) -Boya, -Lifler; (K,O) -Boya, +Lifler; (L,P) +Boya, -Lifler. A-P panelleri, z-yığınlarından gelen tek düzlemsel görüntülerdir. Ölçek çubukları 20 μm'dir. Lifler 35 μm adıma sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Arabidopsis'te sert substratlı bitki üzerinde yöntemle boya dağıtımının zaman seyri. Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak elde edildi. Bitki üzerinde yöntem kullanılarak, bir yaprağın yüzeyine 1 μL damlacık floresein boya çözeltisi (10 μM) yerleştirildi ve VACNF çipi damlacığın üzerine yerleştirildi. Bir cımbız kullanılarak, çip dokuya hafifçe vuruldu. Her 5 dakikada bir aynı bölgenin +Boya, +Lif görüntüleri alındı. Ölçek çubukları 20 μm'dir. Lifler 35 μm adıma sahiptir. Paneller, z-stack'lerden alınan tek düzlemsel görüntülerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: VACNF filmleri kullanılarak çilek meyvesine boya dağıtımı. (A-H) Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak elde edildi. Çip üzerinde yöntem kullanılarak, boya damlacıkları VACNF filmler üzerinde kurutuldu ve daha sonra bir makyaj aplikatörü kullanılarak meyve yüzeylerine yuvarlandı. Floresein boyası (10 μM) çilek hücrelerine verildi ve (A) 10 dakika ve (B) 1 saat sonra görüntülendi. (E,F) -Boya, +Lifler sırasıyla 10 dakika ve 1 saat sonra kontrol edilir. (G,H) +Boya, -Lifler sırasıyla 10 dakika ve 1 saat sonra kontrol edilir. Ölçek çubukları 40 μm'dir. AH panelleri, 188 μm z-yığınlarının maksimum çıkıntılarıdır. Lifler 35 μm adıma sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12: VACNF filmleri ile elmaların boya iletimi ve geçici dönüşümü. (A-F) Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak oluşturuldu. Çip üzerinde yöntem kullanılarak, 1 μL floresein boya damlacıkları (10 μM, B ve D) veya pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) kodlayan 1 μL plazmid damlacıkları VACNF filmler üzerinde kurutuldu ve bunlar daha sonra bir makyaj aplikatörü kullanılarak meyve yüzeylerine yuvarlandı. Floresein boyası elma epidermisine verildi ve (B) 10 dakika ve (D) 2 saat sonra görüntülendi. (F) 48 saat sonra (A, C, E) tedavi kontrolleri yapılmadan (-Boya / DNA-YFP, -Lifler) VACNF filmleri yoluyla DNA-YFP iletimi ve ekspresyonu. Ölçek çubukları 40 μm'dir. A-D panelleri, z-yığınlarından alınan tek düzlemsel görüntülerdir. E ve F panelleri, 53 μm z-yığınlarının maksimum projeksiyonudur. Fiber aralığı 35 μm'dir. Oklar floresein veya YFP sinyallerini gösterir. * lifleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 13: Arabidopsis yapraklarının bitki üstü veya çip üstü VACNF'ler yöntemleri kullanılarak geçici dönüşümü. (Bir-H) Görüntüler, DNA verilmesinden 48 saat sonra konfokal mikroskopi kullanılarak elde edildi. (A, C, E, G) Bitki üzerinde yöntem: Arabidopsis yapraklarının abaksiyal tarafına pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) kodlayan 1 μL plazmit yerleştirildi. Çipler, damlacıkla temas edecek şekilde konumlandırıldı ve çipi yaprak dokusuna vurmak için kullanılan cımbız gereçleri kullanıldı. (B,D,F,H) Çip üzerinde yöntem: 1 μL DNA−YFP (200 ng) VACNF çipleri üzerinde 15 dakika kurutuldu ve daha sonra cips kabı Arabidopsis yapraklarının abaksiyal tarafına cımbızla vuruldu. +DNA-YFP, +(A) bitki üzerinde ve (B) çip üzerinde lifler. Kontroller: (C,D) -DNA-YFP, + Lifler; (E,F) +DNA-YFP, -Lifler; ve (G,H) -DNA, −Lifler. (I) YFP kanalından floresan kullanılarak yapılan 2-3 deneyden birleştirilmiş 5 biyolojik kopyanın görüntülerinden 25 20 × 20 μm alanların nispi ortalama floresan sinyal yoğunluğunun grafiği. Stoma (*) içeren bölgeler otofloresan nedeniyle hariç tutuldu. -DNA-YFP, -Lif durumundan ortalama floresan yoğunluğu her ortalamadan çıkarıldı. Anlamlılık testi için 2 ANOVA (ve Tukey testi) kullanıldı ve hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil ediyor. Farklı harfler tedaviler arasında önemli farklılıklar gösterir (P < 0.0001). Gösterilen tüm görüntüler, maksimum 40 μm z−yığın projeksiyonlarıdır. Ölçek çubukları 20 μm'dir. Beyaz oklar görüntülerdeki lifleri gösterir. Fiber aralığı 35 μm'dir. Bu rakam Morgan ve ark.7'nin izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 14: VACNF filmleri kullanılarak soğanların geçici dönüşümü. Görüntüler, DNA verilmesinden 48 saat sonra konfokal mikroskopi kullanılarak elde edildi. Çip üzerinde yöntem kullanılarak, pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) kodlayan 1 μL plazmit DNA damlacıkları VACNF filmleri üzerinde10 dakika kurutuldu ve daha sonra bitki organ yüzeylerine yuvarlandı. (A) DNA-YFP'ye verildi ve YFP soğan epidermisinde eksprese edildi. (B) Tedavi kontrolü yok; (C) kontrol (+DNA-YFP, -Lifler) ve (D) kontrol (-DNA-YFP, +Lifler). Ölçek çubukları 40 μm'dir. Lifler 35 μm adıma sahiptir. Görüntüler, 115 μm z-yığınlarının maksimum projeksiyonlarıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 15: VACNF film uygulamasından marulda doku hasarı . (A-D) Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak oluşturuldu. (A) DNA'yı VACNF filmleri aracılığıyla marul yapraklarına iletmek için çip üzerinde yöntem kullanıldı. pUBQ 10: YFP DNA (200 ng) damlacıkları VACNF filmleri üzerinde10 dakika kurutuldu, daha sonra ayrılan marul yapraklarının abaksiyal tarafına yuvarlandı ve 4 gün boyunca bir nem odasında saklandı. (B) kontrol (-DNA-YFP, +Lifler). (C) kontrol (+DNA-YFP, -Lifler) ve (D) tedavi yok (-DNA-YFP, -Lifler). Ölçek çubukları 40 μm'dir. VACNF'ler 35 μm'lik bir eğime sahiptir. Oklar, esnek alt tabakanın çok fazla kuvvetle yuvarlanmasından kaynaklanan bitki hasarına işaret eder. Marulda başarılı VACNF aracılı DNA iletiminin diğer deneylerdeelde edildiğini unutmayın 7. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 16: Tesislerde VACNF aracılı dağıtımın iş akışı. Aşama I'de, SEM kullanarak liflerin geometrisini kontrol edin. Doğru teslimat için, liflerin <200 nm çapında bir uca ihtiyacı vardır. Esnek substrat üzerinde lifler kullanılıyorsa, bir sonraki adım, liflerin SU-8'e aktarıldığını doğrulamak ve maruz kalan liflerin yüksekliğini SEM aracılığıyla kontrol etmek olacaktır. Aşama II'de, sert veya esnek bir substrat kullanarak boyayı tercih edilen bitkiye/organa vermeye çalışarak liflerin kullanışlılığını test ettik. 1 μL damlacık kullanın, bitki yüzeyine yerleştirin veya çip/film üzerinde kısa bir süre kurutun. Bu adımda ve diğer tüm adımlarda, sinyalin iyi niyetli boya dağıtımından geldiğinden emin olmak için uygun kontrollerin (-Boya,-Lifler; -Boya, +Lifler ve +Boya,-Lifler) kullanılması zorunludur. Aşama III'te, ilgilenilen genin plazmidde mevcut olduğunu doğrulayın, verilecek DNA konsantrasyonunu belirleyin ve ekspresyonunu kontrol etmek için doğumdan sonra en uygun süreyi test edin. Evre IV'te sonuç, verilen markörün ekspresyonunu kontrol etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. Bu rakam Morgan ve ark.7'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu yazıda, dikey olarak hizalanmış karbon nanolif dizileri oluşturma, lifleri esnek bir alt tabakaya aktarma ve bitkilere biyomoleküllerin veya boyaların verilmesinde kullanılmak üzere bitkilere sert veya esnek bir alt tabakadaki lifleri uygulama yöntemlerini sunduk. Eklenen malzemelerin biriktirilmesi için çip üstü ve tesis üstü yöntemler olmak üzere iki genel yaklaşım tanımladık ve sert bir substrat üzerindeki liflerde ve VACNF filmleri kullanan çip üzerinde yöntemde başarılı sonuçlar gösterdik. Bu liflerin uygulanması, pratikte ve teoride geleneksel bitki dönüşüm yöntemlerinden (parçacık bombardımanı, PEG veya elektroporasyon yoluyla protoplast dönüşümü) daha basittir ve Agrobacterium aracılı dönüşüme karşı inatçı bitkiler için kullanılabilir. Bununla birlikte, yalnızca birkaç hücre dönüştürülür.
Dikey olarak hizalanmış karbon nanofiberler, kullanıcı programları aracılığıyla Oak Ridge Ulusal Nanofaz Malzeme Bilimleri Laboratuvarı Merkezi'nde üretildi. Kullanıcılar, VACNF'lerin üretimi için bu tesisi kullanmak için başvurabilirler. Alternatif olarak, VACNF yongaları, karbon kaynağı22,23 olan doğru akım plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme makinelerine sahip temiz odalarda üretilebilir. Açıklanan yöntemlerle, liflerin üretimi, lif transferi ve VACNF çiplerinin/filmlerinin uygulanması için kritik olan birkaç adım vardır. Lif uygulamasının işe yaraması için, liflerin düz olması ve bitki hücrelerinde başarılı olması için uçta <200 nm'lik bir sivriltme çapına sahip olması gerekir 6,7 (Şekil 3). Belirli boyut ve aralıkta karbon nanofiberler oluşturmak için, nokta boyutu, yanal adım ve biriken katalizör miktarı dahil olmak üzere değiştirilebilen çeşitli parametreler vardır. Karbon nanolif üretimi için kullanılacak en uygun nokta boyutunu seçmek için, lifler çeşitli nokta boyutlarından büyütüldü (Şekil 5'te gösterildiği gibi). 300 nm çapların en iyi lifleri ürettiğini bulduk, bu nedenle bu nokta boyutu seçildi (Şekil 5). Doğru parametreleri bulduktan sonra, ideal geometriye (düz ve uç çapı <200 nm) sahip liflerin %>50'sine sahip çipler kullanmaya çalıştık. Liflerin geometrisini kontrol etmek için, bir VACNF çipi/filmi örneği üzerinde rastgele görüş alanlarını görüntülemek için taramalı elektron mikroskobu kullandık.
Ek olarak, bitki hücreleri içinde teslimatı sağlamak için liflerin belirli bir minimum uzunluğa sahip olması gerekir. Farklı uzunluklarda lifler üretmenin önemi, daha derin doku katmanlarına nüfuz etmek için daha uzun liflerin kullanılabilmesidir. Daha uzun lifler (>40 μm uzunluğunda) esnek filmler için gereklidir, çünkü lif transferi, lifleri tabanlarından kopararak çalışır ve liflerin üzerine SU-8 katmanlamasını gerektirir. Bu protokol için kullanılan SU-8 tabakasının çalışma kalınlığı 20-35 μm'dir. Çeşitli bitkilerin (kavisli veya düz) epidermisi içinde doğumu gerçekleştirmek için gereken minimum yükseklik 10-15 μm 6,7'dir. Sonuç olarak, VACNF filmler için >40 μm uzunluğunda lifler gereklidir. Karbon nanolifleri üretirken göz önünde bulundurulması gereken birkaç farklı parametre vardır: katalizör malzemesi, katalizör geometrisi, katalizör malzemesinin kalınlığı ve ayrıca PECVD odasındaki koşullar (gaz oranı, basınç, sıcaklık, akım, duş başlığı yüksekliği ve büyüme süresi)8,9,24,25. Morgan ve ark.7 ve Davern ve ark.6 tarafından kullanılan 25 μm'den daha uzun karbon nanolifleri üretmek için Ni katalizörü miktarını artırdık, asetilen: amonyak oranını değiştirdik ve akım ve büyüme süresini artırdık. Ek olarak, katalizör malzemesinin geometrisine daha fazla dikkat ettik. Uzun düz lifler üretmek için, biriken katalizörün bir yanardağa benzeyen bir şekilden ziyade bir hokey diski şekline sahip olması gerekiyordu (Şekil 4). Volkan yapıları, kalkıştan sonra fotorezist kalıntılarından ortaya çıkar. Volkanların oluşumunu önlemek için, elektron ışını litografisi26 sırasında bir alt kesim oluşturmak için çift katmanlı bir PMMA kullanıldı. Alttan kesme, biriken metal katalizörün kaldırılmasına yardımcı olur (Şekil 2). Katalizörün kalın tabakası, uzun VACNF'lerin büyümesi için önemlidir. VACNF'lerin morfolojisi Merkulova ve ark.24 tarafından incelenmiştir. VACNF'lerin dikey hizalanması, hem Ni katalizör ucu tipi büyümeden hem de DC potansiyelinin substrata dik hizalanmasından kaynaklanmaktadır (Şekil 6). Duş başlığı, PECVD reaktörünün geometrisini tanımlar (Şekil 6) ve elektrik alanı27 potansiyeli için kaynak görevi görür.
Elektron ışını litografisi ile katalizör noktaları dizisini tanımlamak için, bir elektron ışını direnci (polimetil metakrilat) uyguladık, ardından dirençte belirli bir şekle sahip ve gofret üzerinde belirli konumlarda küçük delikler açmak için e-ışını kullandık. İstenilen çaptaki delikler, tanımlanan aralık (adım) ile düzenli bir ızgaraya yerleştirildi ve alt tabaka makineye yüklenmeden önce elektron ışını litografi aracına istenen deseni belirten bir dosya yüklendi. Lif yüksekliğine ek olarak, başarılı lif transferi için bir diğer kritik parametre de aseton banyosunda geçirilen süredir. VACNF filmlerinin, kenarları kıvrılmaya başlayacak kadar uzun süre aseton banyosunda bırakılması gerekir; Aseton banyosunda çok az süre bırakılırlarsa, talaşları kaldırmak daha zordur ve kırılabilirler. Cipsler ne kadar eskiyse, aseton banyosunda o kadar uzun süre kalmaları gerekecektir. Aseton banyosunu takiben, filmler/yongalar, erişim asetonunu çıkarmak ve lifler üzerindeki koruyucu fotorezisti çıkarmak için izopropanol ve suya yerleştirildi.
Sıkma kaplaması yapmak için, gofretler veya yonga plakası parçaları, sıkma kaplayıcıdaki bir vakumlu aynaya yerleştirilir ve gofretin merkezi konumu, sıkma kaplayıcının test fonksiyonu kullanılarak doğrulanır. Gofretin merkezine küçük bir su birikintisi (~2,5 cm çapında) direnç uygulanır ve eğrilir (45 s için 3000 rpm) Spin kaplamadan önce ve sonra liflerin görüntüleri, lif geometrisinin (yükseklik, yönlendirme ve eğim) korunmasını gösteren Şekil 8'de yer almaktadır. Liflerin varlığı, liflerin tabanında yükselmeye neden olur ve beklenenden daha kalın tabakalara neden olur. VACNF büyümesinden sonra spin-kaplama diğer gruplar tarafından araştırılmıştır11,18.
Süreç içinde hayati öneme sahip bir diğer adım, VACNF çiplerine/filmlerine doğru miktarda kuvvet uygulanmasını sağlamaktır. Dağıtım mekanizması, cımbızın itme kuvveti yoluyla hücre duvarlarında küçük delikler açanliflere, sert alt tabakalara 6,7 dokunmasına veya esnek alt tabakalar üzerinde mini makyaj aplikatörü ile yuvarlanmasına bağlıdır. Lifler kopabilir veya kırılmayabilir ve sonuç üzerinde herhangi bir etkisi olmadan bitki hücrelerine6,7 gömülü kalabilir, ancak basıncı doğru elde etmek için boya alımı ve doku hasarı muayenesi ile birlikte pratik yapmak gerekir. Ek olarak, saptanabilir ekspresyon süresi bitki türleri ve verilen vektör türleri arasında değiştiğinden, VACNF çipleri/filmleri ile DNA dağıtımından sonra uygun görüntüleme zaman noktalarının seçilmesi önemlidir7 (Şekil 16).
Bu yöntem bitkilere geniş çapta uygulanabilir olduğu kadar, birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, VACNF filmlerine ince bir silikon oksit tabakası eklemek, SU-8'in üzerine eklenen koruyucu fotorezist tabakası nedeniyle filmlerin her zaman tamamen hidrofilik olmasına neden olmaz. Bu sorun ortaya çıkarsa, VACNF'lere daha kalın silikon oksit katmanları uygulanabilir. Filmlerin hidrofobik mi yoksa hidrofilik mi olduğunu test etmek için suya yerleştirilebilirler. Filmler batarsa hidrofiliktir, yüzerse hidrofobiktir. Ek olarak, üretilen elyaf partileri arasında farklılıklar olabilir. dc -PECVD makinesinde lifleri büyütürken değiştirilebilecek birkaç parametre vardır; Bu protokolde açıklanan, iki farklı miktarda Ni katalizörü için bir dizi parametredir. Ek olarak, Ni katalizörünün kristal oryantasyonu28 kontrol edilemez ve bazı dallanmalar kaçınılmaz olarak liflerle sonuçlanacaktır.
Bu makale için hem sert hem de esnek substratlar kullanarak bitki hücrelerine floresein boyası ve DNA'nın verilmesini göstermiş olsak da, yöntem diğer biyomoleküller ve genetik modifikasyon yaklaşımları için geniş ölçüde uygulanabilir olmalıdır, örneğin, elma gibi bitki sistemleri için RNAi susturma veya kararlı transgenik hatların üretilmesinin yıllar alacağı diğer meyveler. Ayrıca, bu lifler genetik düzenleme materyalleri sağlamak veya bitkilerde kararlı dönüşümler için de kullanılabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Nanolif dizileri, Enerji Bakanlığı Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi olan Nanofaz Malzeme Bilimleri Merkezi'nde üretilmiştir (Teklif No: CNMS2019-103 ve CNMS2022-A-1182). CNMS'den destek, hakemli bir teklif sistemi aracılığıyla verilir ve sonuçlarını yayınlamak isteyen başarılı başvuru sahiplerine ücretsiz olarak sağlanır (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Nanofiber dizilerin üretimindeki yardımları için Kevin Lester ve CNMS'ye teşekkür ederiz. Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs ve Travis Bee'ye deneysel tasarım üzerine eleştirel tartışmalar için teşekkür ederiz. PECVD makinesinin şeması için Dr. Adam Rondinone'ye teşekkür ederiz. Bilimsel çizimler için Leslie Carol'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Biyogörüntüleme Bilimi Programı, ABD Enerji Bakanlığı, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, DE-SC0019104 ve Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı, 2021-67013-34835 tarafından finanse edilmiştir. JMM, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı: Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü: Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Doktora Öncesi Bursu 2021-67034-35167 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
References
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
- Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
- Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).
- Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
- Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).
- Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).
- Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).
- Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).
- Nelson-Fitzpatrick, N. Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).
- Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
- Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A.
- Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).
- Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527 (2011).
- Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
- Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008 (2019).
- Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
- Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crafts, A. S.
- Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
- Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
- Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).
- Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
- Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
- Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
- Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
- Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).
