Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ved hjelp av vertikalt justerte karbon nanofiberarrayer på stive eller fleksible underlag for levering av biomolekyler og fargestoffer til planter

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65602
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 3, 3,5, 6, 5, 2
1Biophysical Sciences, The University of Chicago, 2Molecular Genetics and Cell Biology, The University of Chicago, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 4Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 5Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 6Department of Chemistry, East Tennessee State University

Summary

Her beskriver vi metoder for mikrofabrikasjon av vertikalt justerte karbonnanofibre (VACNF), overføring av VACNFer til fleksible substrater og påføring av VACNFer på både stive og fleksible underlag til planter for biomolekyl og fargestofflevering.

Abstract

Levering av biomolekyler og ugjennomtrengelige fargestoffer til intakte planter er en stor utfordring. Nanomaterialer er up-and-coming verktøy for levering av DNA til planter. Så spennende som disse nye verktøyene er, har de ennå ikke blitt mye brukt. Nanomaterialer produsert på stivt substrat (backing) er spesielt vanskelig å lykkes med å anvende på buede plantestrukturer. Denne studien beskriver prosessen for mikrofabrikasjon vertikalt justerte karbon nanofiber arrays og overføre dem fra et stivt til et fleksibelt substrat. Vi detaljerer og demonstrerer hvordan disse fibrene (på enten stive eller fleksible substrater) kan brukes til forbigående transformasjon eller fargestoff (f.eks. fluorescein) levering til planter. Vi viser hvordan VACNF-er kan overføres fra stivt silisiumsubstrat til et fleksibelt SU-8 epoksysubstrat for å danne fleksible VACNF-arrayer. For å overvinne den hydrofobe naturen til SU-8 ble fibre i den fleksible filmen belagt med et tynt silisiumoksydlag (2-3 nm). For å bruke disse fibrene til levering til buede planteorganer, deponerer vi en 1 μL dråpe fargestoff eller DNA-løsning på fibersiden av VACNF-filmer, venter 10 minutter, plasserer filmene på planteorganet og bruker en vattpinne med en rullende bevegelse for å drive fibre inn i planteceller. Med denne metoden har vi oppnådd fargestoff og DNA-levering i planteorganer med buede overflater.

Introduction

Plantetransformasjon (både forbigående og stabil) har ennå ikke blitt allment oppnåelig i alle plantevev og arter. Den forbigående transformasjonen av planter er en prosess der gener kodet i plasmider midlertidig blir introdusert i planter, men er ikke stabilt innlemmet i genomet. Tradisjonelle metoder som bruker partikkelbombardement, agrobakterier, elektroporering eller polyetylenglykolbehandling av protoplaster er langsom eller kan være tungvint. Videre er de ikke anvendelige for alle plantearter 1,2,3,4. Bruk av nanomaterialer til DNA-levering er et spirende felt som fortsatt er i sin spede begynnelse5. Nanomaterialer, spesielt karbonnanofibre, har også blitt brukt til å levere proteiner, dextrans og fargestoffer til planteblader uten å forårsake sårrespons6. Målet med dette arbeidet er å gi en detaljert protokoll for bruk av en type nanomateriale, karbonnanofibre, for levering av biomolekyler eller fargestoffer til planter. Her fokuserer vi på DNA som det valgte biomolekylet, som tillater forbigående transformasjon av celler i forskjellige planteorganer.

Tidligere demonstrerte Morgan et al.7 bruken av karbonnanofibre festet til stivt silisiumsubstrat for forbigående å transformere blader av salat, N. benthamiana og poppel, og både blader og røtter av Arabidopsis. Selv om transformasjoner var vellykkede på en rekke organer, var fibre vanskeligere å bruke på plantevev med buede overflater, som røtter eller frukt. Vi resonnerte at en fleksibel støtte for nanofibre kan forbedre leveringseffektiviteten ved å tilpasse seg organets form bedre.

Her beskriver vi metoder som brukes til å fremstille og designe vertikalt justerte karbonnanofibre, overføre VACNFer til fleksible substrater og påføre VACNFer på både stive og fleksible underlag til planter for å levere biomolekyler og fargestoffer. Karbonnanofibre ble produsert ved bruk av likestrøms katalytisk plasmaforsterket kjemisk dampavsetning (DC C-PECVD) med Ni-katalysator. Posisjonen, diameteren og høyden på Ni-katalysatorpunkter ble styrt ved hjelp av en kombinasjon av elektronstrålelitografi, metallfordampning og løfteprosesser som beskrevet av Melechko et al.8,9. Ved hjelp av en dobbeltlags e-strålemotstand kan en tykkere Ni-katalysator avsettes på underlaget for å gi lengre fibre10. Fiberoverføring fra et stivt til et fleksibelt substrat er basert på en modifikasjon av metoder beskrevet i Fletcher et al.11, med de nåværende metodene som forutsetter bruk av et amorft karbonlag eller et offerfotoresistlag. SU-8 lift-off med fiberoverføring oppnås ved å utnytte den iboende strekkspenningen som følge av underbaking og undereksponering av SU-812,13,14. SU-8, en kompleks polymer, er naturlig hydrofob, noe som gjør bruken for å lette DNA-levering vanskelig. For å motvirke den hydrofobe naturen til SU-8, påfører vi et tynt lag silisiumoksid via atomlagsavsetning15 etter at fibre er innebygd i SU-8. Påføring av fibre på et stivt substrat for levering av biomolekyl / fargestoff utnytter slagkraften til pinsetttapping beskrevet i Davern et al.6 og metodene på anlegget og på brikken beskrevet i Morgan et al.7. Fleksible VACNF-filmer påføres buede planteoverflater ved først å halvtørke DNA eller fargestoffdråper på filmen som med on-chip-metoden fra Morgan et al.7og deretter rulle filmene på buede planteflater ved hjelp av en liten sminkeapplikator16,17. Figur 1 viser ulike tilnærminger for å påføre fibre i stive og fleksible substrater på planter.

Protocol

1. Produksjon av VACNF-er (figur 2 og figur 3)

  1. Spincoat en silisiumskive med polymetylmetakrylat (PMMA) 495 A4 motstå ved 4000 o / min og stek den ved 180 ° C i 5 minutter.
    MERK: La skiven avkjøles i 10 s før du går videre til neste trinn.
  2. Strøk et nytt lag motstand (PMMA 950 A2) og stek det ved 180 °C i 5 minutter.
  3. Bruk elektronstrålelitografi til å definere katalysatorpunktene med diameter på 300 nm ved en spesifisert sideavstand (stigning: 10 μm eller 35 μm) i 3 mm x 3 mm arrayer.
  4. Utvikle resisten i 30-40 ml 1:3 metyl-isobutylketon: isopropylalkohol (IPA) i 1,5 min, etterfulgt av å skylle den med IPA og tørke den med N2.
    MERK: Se etter en rekke prikker ved hjelp av et lysfeltmikroskop (20x objektiv).
  5. Rengjør skiven på restmotstanden med en 6 s eksponering i oksygenplasma (descum) i en silisiumetser.
  6. Bruk elektronstrålefordampning til å deponere først et klebende lag av metall (Ti eller Cr, 10 nm) og deretter avsette et andre lag, som er Ni-katalysatoren (130 nm eller 150 nm). Under Ti eller Ni metallavsetning, hold strømmen under 0,2 A ved 10 kV, trykket under 5 x 10-6 Torr, og avsetningshastigheten ved ~ 1 A / s for siktlinjeavsetning.
  7. Bruk sekvensiell badsonikering for å fjerne metallet (Ni) avsatt på det underliggende motstandslaget, slik at Ni blir avsatt direkte på silisiumskiven. Denne prosessen kalles lift-off.
    1. For dette, lag 3 beholdere med aceton og bad sonicate waferen i aceton i 1 min; Gjenta 3 ganger ved romtemperatur (RT, 20 °C) med en frekvens på 35 kHz. Skyll med IPA og tørk med N2.
      MERK: La aldri aceton tørke på skiven. Etter den siste acetoniske sonikeringen, skyll straks med IPA og tørk deretter med N2 gass. Hvis waferen på noe tidspunkt blir for tidlig tørr (før IPA-skylling), er det mulighet for at ikke alt overflødig metall og motstand vil bli fjernet, og acetonen kan etterlate rester.
  8. Kontroller geometrien til katalysatorformen ved hjelp av skanningelektronmikroskopi (SEM). For å ta SEM-bilder av VACNF-brikkene, vipp scenen til en 30 ° vinkel og bruk en spenning på 1-3 kV, med en strålestrøm på ~ 100 pA og en ~ 5 mm arbeidsavstand.
    MERK: Katalysatoren skal se ut som en hockeypuck (en kompakt sylinder) (figur 4). Høyden på den kompakte sylinderen skal gjenspeile tykkelsen på Ni avsatt på silisiumskiven. Hvis profilen til Ni-prikken er høy og ser ut til å være konkav øverst, som ligner en vulkan (figur 4), er katalysatoren mer sannsynlig å dewet i flere Ni-dråper som resulterer i forgrening av karbonnanofibrene9 (figur 4 og figur 5). Slike problemer kan skyldes motstand mot smelting under metallfordampning på grunn av lange avsetningstider eller problemer med løfteprosedyren (figur 4 og figur 5).
  9. Kvart silisiumskiven og plasser den i likestrømsforsterket kjemisk dampavsetningskammer (DC-PECVD) med acetylen/ammoniakkblandingen. Optimaliser vekstparametrene for å kontrollere lengden og avsmalningen av nanofibre (tips <200 nm).
    1. Bruk en strøm på 1-1,5 A og et spenningsområde på 440-560 V. Når du dyrker fibrene, bruk en forbehandlingsfase med ammoniakkstrøm mens maskinen og substratet varmes opp til 620 °C. Sørg for å slå på karbonkilden (acetylen) 10 s før du starter plasmaet.
      MERK: Quarter wafere brukes i tilfelle PECVD-maskinens kjøreparametere må optimaliseres. For å produsere fibre med lengder større enn 40 μm og tips mindre enn 200 nm i diameter, foreslås følgende parametere: med en Ni-katalysatortykkelse på 130 nm, bruk en strøm på 1,75 A, veksttid på 70 minutter og en acetylen : ammoniakkforhold på 45 standard kubikkcentimeter per minutt (sccm): 100 sccm. Med en Ni-tykkelse på 150 nm, bruk en strøm på 1,5 A, en veksttid på 80 minutter og en acetylen : ammoniakkforhold på 48 sccm : 100 sccm. Bruk følgende parametere for å dyrke VACNFer uavhengig av katalysatortykkelse: veksttemperatur på 620 °C, trykk på 10 torr under plasma og en dusjhodehøyde på 20 mm (figur 6).
  10. Vurdere geometrien til de resulterende fibrene ved hjelp av SEM ved en 30 ° tilt med et akselerasjonspotensial på 1 kV.
    MERK: Optimale fibre vil være rette og ikke-forgrenende. Det er umulig å kontrollere krystallorienteringen til Ni-katalysatoren med elektronstrålefordamperen. Som et resultat vil det være noen fibre som forgrener seg på grunn av katalysatoravfukting9. Krystallorienteringen får også VACNFene til å vokse til forskjellige høyder, så ensartede høyder på alle VACNFer er vanskelige.
  11. Spincoat et lag fotoresist (SPR955) på fibrene ved 1000 o / min i 45 s. Terning deretter 1/4 wafer i 3 mm x 3 mm arrays ved hjelp av en dicing sag. Oppbevar fibrene på dette tidspunktet for senere bruk.
    MERK: Ikke utfør trinn 1.11 hvis du planlegger å overføre fibre til et fleksibelt underlag.

2. Transferring VACNFs til et fleksibelt substrat (figur 7 og figur 8)

  1. Etter at fibrene er syntetisert, spincoat SU-8 2015 fotoresist på wafers eller kvart wafere ved 4000 rpm i 45 s.
  2. Stek skiven mykt i 3 min ved 95 °C.
  3. Bruk en kontaktjustering til å eksponere skiven med en 3 mm 3 mm matrisemønstret maske som justerer seg etter det definerte mønsteret fra elektronstrålelitografi ved 95 mJ/cm2.
    MERK: Bruk en nærhetskontaktmodus med et eksponeringsgap som er 20 μm større enn den høyeste fiberen. Det er mulighet for at fibre kan bli slått over i løpet av dette trinnet i prosessen.
  4. Stek etter eksponering i 6 min ved 95 °C.
  5. Utvikle waferen i SU-8 utvikler i 15 s, skyll den med IPA, og tørk waferen med N2, flytt fra topp til bunn.
    MERK: Når du utvikler skiven, må du sørge for at den er helt nedsenket.
  6. Spincoatmønstrede skiver med et beskyttende lag av tynn fotoresist (SPR 955 CM 0,7) ved 3000 o / min i 45 s og softbake i 30 s ved 90 °C.
  7. Deponer et tynt silisiumoksidlag til skiven (2-3 nm) ved å plassere den i en atomlagsavsetning i 22 sykluser ved 100 °C.
  8. Bruk en tersag til å skjære platen i 3 mm x 3 mm firkanter. Juster terninger sagen til det eksisterende mønsteret på skiven.
  9. Vurdere geometrien til de resulterende fibrene ved hjelp av SEM ved en 30 ° tilt med et akselerasjonspotensial på 3 kV.
  10. Stopp her hvis du lagrer sjetonger for langvarig bruk (>1 uke). Oppbevar chips i mørket.
  11. For å skille fleksible underlag fra stive underlag, plasser individuelle spon i aceton i 30 minutter eller til SU-8 begynner å krølle.
  12. Vask SU-8 film (enten festet til eller løsnet fra stive underlag) med IPA i 5 min og deretter med vann i 5 min. Legg sjetongene i en kommersiell boks med en klebrig pute når du transporterer dem.
  13. VALGFRITT: Plasser den fiberløse siden av SU-8-filmen på vannløselig tape eller på toppen av tynn silikongummi med et tynt polyetylentereftalat (PET) (12,5 μm tykt) bakside.
    1. Bruk en pinsett for å overføre SU-8-filmen. Trykk på kantene på SU-8-firkanten for å hjelpe den å feste seg til båndet / silikongummi-PET; Dette er for å unngå å bryte av fibre. På dette tidspunktet er VACNF-filmene klare til umiddelbar bruk.
    2. For å klargjøre en silikongummi / PET-holder, gjør du følgende: Bruk et 2-delt sett for silikongummi, bland de to delene sammen (elastomeren og tverrbinderen). Klipp deretter ut en firkant med PET og teip den ned i en klar plastfat. Hell et veldig tynt lag silikongummi på toppen av PET og herd det ved 80 °C i 1-2 timer.

3. Metode på planten (hvor en dråpe løsning som skal leveres plasseres på en planteoverflate) ved bruk av fibre i et stivt substrat (figur 1A)

  1. Fjern fotoresisten med trinnvis vask av aceton (100 %, 5 min), IPA (100 %, 5 min) og ddH2O (5 min) før bruk.
  2. Plasser plantevevet som skal spiddet på en hard overflate for støtte.
  3. Plasser en 1 μL dråpe fargestoff eller DNA (200 ng) på overflaten av plantevevet.
  4. Plasser en VACNF-brikke med et stivt underlag på toppen av dråpen, med fibrene orientert slik at de kommer i kontakt med dråpen.
    MERK: Orienteringen av sjetongene kan bestemmes av "blankhet" av skiven. Den skinnende siden av brikken har fibre, og den ugjennomsiktige siden gjør det ikke.
  5. Bruk den flate siden av en pinsett, trykk på brikken. Merk området av planten som brikken kom i kontakt med ved hjelp av en myk tippet markør. Fjern VACNF-brikkene etter levering.
    MERK: Mengden kraft som brukes ved tapping vil variere avhengig av hvilken type plantevev som brukes. Det anbefales å øve på å tappe sjetonger før du gjennomfører impalement av fibre. Unngå skade på plantevev. Skader er tydelige når man kan se omrisset av VACNF-brikken i plantevevet.
  6. Gjenta trinn 3.1–3.5 for kontroller (+Fargestoff/DNA, -Fibre; -Fargestoff/DNA, +Fibre; og -Fargestoff/DNA, -Fibre). -Fibre er den fiberløse siden av en brikke.
  7. Oppbevar intakte planter eller utskårne planteorganer i fuktige kamre i langdagsforhold (16 timer lys, 8 timer mørkt) om nødvendig. For utskårne organer, bruk en petriskål av plast med våte papirhåndklær.

4. On-chip-metode (hvor en dråpe løsning som skal leveres plasseres på en VACNF-brikke), stivt substrat (figur 1B)

  1. Fjern fotoresisten med trinnvis vask av aceton (100 %, 5 min), IPA (100 %, 5 min) og ddH2O (5 min) før bruk.
  2. Slipp 1 μL dråpe fargestoff eller plasmid-DNA (200 ng) på fibersiden av VACNF-brikken med stivt substrat. Sørg for å plassere dråpen i midten av brikken og dekk flere fibre. La dråpen tørke i 15 min.
    MERK: Orienteringen av sjetongene kan bestemmes av "blankhet" av skiven. Den skinnende siden av brikken har fibre, og den ugjennomsiktige siden gjør det ikke.
  3. Når du arbeider med blader eller andre utskårne organer, plasser dem på toppen av en hard overflate. Når du arbeider med intakte planter, plasser en hard overflate under organet som VACNFer påføres.
  4. Etter tørketrinnet på 15 minutter, plasser VACNF-brikken slik at fibersiden kommer i kontakt med plantevevet. Trykk på brikken med bakenden av en pinsett.
    MERK: Mengden kraft som brukes ved tapping vil variere avhengig av hvilken type plantevev som brukes. Det anbefales å øve på å tappe chips.
  5. Gjenta trinn 3.6–3.7 i metoden på anlegget.

5. Bruk av VACNFer i SU-8-filmer for å plante vev ved hjelp av on-chip-metoden (figur 1C)

  1. Plasser 1 μL dråpe fargestoff eller DNA (200 ng) på fibersiden av SU-8-filmen og la den tørke i 10 minutter. Pass på å plassere dråpen i midten av brikken.
    MERK: Det er forskjellige tørketider avhengig av underlaget som brukes.
  2. Bruk en skarp pinsett til å plassere VACNF-filmen på planteoverflaten.
    MERK: Jo lenger SU-8-filmene blir utelatt i luften, jo mer sprø blir filmene. For å begrense risikoen for å miste SU-8-filmene, sørg for å ha alle planter / prøver og utstyr i nærheten av SU-8-filmene.
  3. Rull forsiktig en liten sminkeapplikator over VACNF-filmen. Merk områdene der de fleksible underlagene er plassert med en markør med myke tipper. Fjern de fleksible underlagene fra planteoverflaten ved hjelp av tape.
    MERK: Mengden kraft som påføres når du ruller sminkeapplikatoren vil variere mellom plantevevene som brukes. Øv på å bruke VACNF-filmene før du utfører biomolekyl eller fargestofflevering. Synlig skade på plantevev er tydelig når man kan se konturene av VACNF-film i plantevevet.
  4. Gjenta trinn 5.1–5.3 for kontroller og lagre anlegg som nevnt i trinn 3.7 i anleggsmetoden.

6. Mikroskopi og bildeanalyse for alle leveringsmetoder

  1. Avbilde prøvene ved hjelp av et konfokalmikroskop ved hjelp av utslipps- og eksitasjonsbølgelengder som passer for den leverte fluorescerende sonden / reporteren.
    MERK: Tiden som kreves for den forbigående transformasjonen varierer med plantearten og markøren som leveres. For eksempel ble uttrykket av fluorescerende markører detektert etter 48 timer i Arabidopsis versus 96 timer i salatblader7.
  2. Når du avbilder, prøv å fokusere på et område med frittliggende fibre. Fibre vil ha forskjellige retninger. Suksessen med levering er ikke avhengig av utseendet på ødelagte fibre.
    MERK: Fibre vil være fluorescerende med de vanligste eksitasjons- / utslippsinnstillingene på grunn av dannelsen av silisiumnitridlag som følge av fiberdannelsen i PECVD18.
  3. Ta minst 5 bilder for hver prøve. Det resulterende signalet vil variere.
  4. Mål fluorescensverdiene som total fluorescens (integrert tetthet) i 20 μm x 20 μm konfokale bildeområder7 ved hjelp av ImageJ19.

Representative Results

Den distinkte fordelen med VACNF-brikker på stive eller fleksible substrater er evnen til å levere biomolekyler eller fargestoffer til bestemte steder på en plante (figur 1). Her brukte vi fluorescensavlesninger for å vurdere levering. Ved å bruke forskjellige planter, substrater og leveringsmetoder (on-chip eller on-plant), kan det være forskjeller i tidspunktet for utseendet til fargestofffluorescein. For å avgjøre om VACNF-brikker / filmer fungerer for levering, er en rask tilnærming å bruke fibre for fargestofflevering (figur 9). Bilder merket med forskjellige klokkeslett i figur 9 er forskjellige synsfelt fra de samme utvalgene. Ved bruk av plantemetode kan fluoresceinfargestoff observeres umiddelbart etter levering ved bruk av fluorescensmikroskopi. I tillegg, hvis det samme synsfeltet avbildes over tid etter å ha levert fluoresceinfargestoff til en plante, blir signalintensiteten mindre lys over tid (figur 10). Fluoresceinfargestoffet kan potensielt bevege seg fra synsfeltet til andre områder av bladet gjennom plasmodesmata20,21. Sammenlignet med on-plant-metoden, i on-chip-metoden med fibre på det stive substratet, beveger fargestoffet seg langsommere gjennom det spiddede området (figur 9). Dette kan være et resultat av at fargestoffet løsner fra fibre/rehydrering i cellene og dermed tar mer tid å bevege seg på.

Fibre i det fleksible substratet var egnet for fargestofflevering til buede overflater som jordbær og epler (figur 11 og figur 12). Ved hjelp av et fleksibelt substrat med jordbær ble det observert et sterkt fluoresceinsignal med en gang (figur 11), mens det tok 2 timer å se et sterkt fluoresceinsignal i epler (figur 12B,D). Den vellykkede leveransen av plasmider som koder for fluorescerende markører kan bestemmes ved hjelp av fluorescensmikroskopi for å finne det resulterende signalet (figur 12F, figur 13 og figur 14). Kontroller er nødvendige for å avgjøre om den valgte planten ikke har autofluorescens som ligner på fluorescerende markør vi ønsker å levere av fibre. Bruk av fibre alene er nyttig for å avgjøre om slagkraften påført pinsett resulterer i skade på plantevevet eller om den observerte fluorescensen i prøven skyldes VACNFene, som iboende er fluorescerende på grunn av deres silisiumnitridlag18 (figur 13C-D). Fibre spiddet i plantevev induserer ikke sårrespons vurdert ved H 2 O2 produksjon6. Til slutt, ved å bruke kontrollen av + DNA, -Fibre er nødvendig for å bekrefte at DNA ikke kommer inn i planten gjennom tapping alene og bekrefter at fibrene er nødvendige for levering i planteceller (figur 13E-F). Det bør ikke være noen tydelig forskjell når du bruker leveringsmetodene på anlegget eller på brikken ved bruk av VACNF-ene på et stivt substrat, som indikert av mangelen på signifikant forskjell i fluorescensverdier (figur 13I). Bruk av fleksible VACNF-filmer med on-chip DNA-levering resulterte i en vellykket forbigående transformasjon av epidermale celler i butikkkjøpte epler og løk (figur 12F og figur 14).

Mislykkede eksperimenter kan ha fibre brutt av i forskjellige synsfelt, men det vil ikke være noe resulterende fluorescenssignal fra forsøket på å levere plasmid-DNA eller fargestoff. Hvis det påføres for mye trykk på planten, vil det være tydelig vevsskade (figur 15). Denne mekaniske skaden kan se ut som små hull eller gjennomsiktige områder i planten som om et lag med celler er fjernet når man ser på planten under et mikroskop. Noen ganger vil avtrykk av brikken være synlige. Et eksperiment der fluorescerende proteinuttrykk ikke oppdages etter DNA-levering, kan også skyldes bruk av DNA av lav kvalitet, så det kan være nyttig å tilberede ferskt DNA.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av fargestoff/DNA-tilførsel til plantevev ved bruk av fibre på stive og fleksible substrater . (A) På-plante, fibermediert fargestoff / DNA-levering. En 1-μL dråpe fargestoff / DNA-løsning plasseres på overflaten av et blad og VACNF-brikken plasseres på toppen av dråpen. Ved hjelp av en pinsett tappes brikken forsiktig inn i vevet. Det stive substratet fjernes og etterlater nanofibre i vevet. (B) On-chip fibermediert DNA-levering. En 1 μL dråpe fargestoff eller DNA-løsning slippes på VACNF-brikken og tørkes i 15 minutter. Brikken med halvtørket DNA plasseres på toppen av bladoverflaten og tappes inn i vevet som i panel A. (C) On-chip SU-8 film DNA-levering. Fibre overføres fra det stive silisiumsubstratet til fleksibel SU-8-støtte. En 1 μL dråpe fargestoff/DNA-løsning slippes på VACNF-filmen og tørkes i 10 minutter. VACNF-filmen med halvtørket fargestoff/DNA rulles deretter på en buet planteoverflate ved hjelp av en sminkeapplikator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for å lage vertikalt justerte karbonnanofiberarrayer. For å produsere VACNFer spinnes et dobbeltlag av polymetylmetakrylat (PMMA 495 A4 etterfulgt av PMMA 950 A2) på en silisiumskive. Elektronstrålelitografi brukes til å definere en rekke prikker 300 nm i diameter. Resisten utvikles deretter i metylisobutylketon/isopropanol (MIBK/IPA), 1:3 i 1,5 min. Ved hjelp av en metallfordamper påføres et klebende lag av Ti (10 nm) på waferen, etterfulgt av et lag med Ni (130 nm eller 150 nm). Den gjenværende motstanden fjernes deretter via løft (badsonikering i aceton). Geometrien til katalysatorprikker inspiseres via SEM. Hvis katalysatorene ligner hockeypucker og er flate, plasseres de i plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) -maskinen og fibre dyrkes. Fibrene ble deretter inspisert ved hjelp av SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: SEM-bilder av ideelle vertikalt justerte karbonnanofibre . (A) Elektronmikrografi av VACNFer med en ~ 35 μm stigning og en høyde på 10-15 μm, avbildet i en 30 ° vinkel. Dette bildet er duplisert i figur 7C. (B) Elektronmikrografi av VANCFer med ~20 μm stigning og 20-30 μm høyde, og avbildet i en 30° vinkel. (C) Elektronmikrografi av VANCFer med ~ 35 μm stigning, 50-60 μm høyde, og avbildet i en 30 ° vinkel. (D) Elektronmikrografi av VACNF-spiss med en diameter <200 nm. Det er variasjon i fiberspissens diameter (150-300 nm). Fordi fibrene ble avbildet i 30° vinkel, ser høydene ut til å være mindre enn den faktiske høyden med en faktor på sin (30 °) = 1/2. Panel A og B er gjengitt med tillatelse fra Morgan et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: SEM-bilder av katalysatorgeometri før voksende VACNFer. (A) SEM-bilde av katalysatoren etter oppskytning. Legg merke til at fotoresist er tilstede rundt kanten av katalysatoren, noe som resulterer i en vulkanform. (B,C) SEM-bilder viser vulkanformene til katalysatoren etter bruk av et enkeltlags PMMA-motstand. (D) Ønsket hockey puck katalysator form laget av doble lag av PMMA. Fordi fibrene ble avbildet i 30° vinkel i panelene A, B og D, ser høydene ut til å være mindre enn den faktiske høyden med en faktor på sin (30°) = 1/2. Skalastenger representerer 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekt av katalysatorpunktstørrelse på fibervekst: For å etablere den optimale diameteren av katalysatormaterialet, ble fibre dyrket fra punktstørrelser fra 200-600 nm. Prikkstørrelser fra 400-600 nm førte til dewetting av katalysatoren og veksten av flere fibre. Den beste fibergeometrien ble produsert med en diameter på 300 nm. Mindre prikker førte til utilstrekkelig fiberhøyde. På grunn av det faktum at fibrene ble avbildet i 30° vinkel, synes høydene å være mindre enn den faktiske høyden med en faktor på sin (30°) = 1/2. Bildene ble tatt ved hjelp av skanning elektronmikrograf. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk illustrasjon av likestrøm - plasma forbedret kjemisk dampavsetning (dc-PECVD) system brukt ved Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Det tilpassede systemet på ORNL har et stort dusjhode som fungerer som reaktor for mategasser og utgang for plasma. Dusjhodet ble opprettholdt ved et DC-potensial på 300 V i forhold til det oppvarmede trinnet for underlaget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Arbeidsflyt for overføring av fibre fra et stivt underlag til et fleksibelt underlag. Etter nanofibersyntese og inspeksjon spinnes hver wafer med SU-8 2015 ved 4000 o / min i 45 s. Platen mykes deretter i 3 min ved 95 °C. Deretter utsettes skiven for UV-lys og mønstres i en maskejustering på 95 mJ/cm2. Etter etterbaking i 6 min ved 95 °C utvikles skiven i SU-8-utvikleren i 15 s, skylles med IPA og tørkes med N2-gass . Et beskyttende motstandslag av SPR 955 CM 0.7 er spinnbelagt på skiven ved 3000 o / min og mykt ved 90 ° C i 30 s. Et silisiumoksidlag (2-3 nm) tilsettes deretter waferen via atomlagsavsetning (ALD) (22 sykluser ved 100 °C) for å gjøre det fleksible substratet hydrofilt15. Skiven blir deretter terninger i 3 mm x 3 mm firkanter med en terninger sag. På brukstidspunktet plasseres individuelle sjetonger i aceton til SU-8 begynner å krølle og blir konkav (>30 min). På dette tidspunktet kan SU-8-laget på de fleste chips gripes på kanten med skarp pinsett og skrelles fra det underliggende silisiumsubstratet som en intakt 3 mm firkantfilm. Filmen vaskes deretter suksessivt i IPA og vann i 5 min hver og brukes umiddelbart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: SEM-bilder av fiberoverføring fra et stivt underlag til et fleksibelt underlag. Bildene som vises, er representative, men kommer fra forskjellige utvalg. (A) Lange fibre etter PECVD-vekst (samme bilde som i figur 2C). (B,C) Fibre etter påføring av SU-8. Epoksyen brønner opp rundt fiberbunnen. Den eksponerte fiberlengden varierte fra 5 μm til 30 μm. (D) Fibre innebygd i Su-8 etter løfting beholdt geometrien. På grunn av det faktum at fibrene ble avbildet i 30° vinkel, ser høydene ut til å være mindre enn den faktiske høyden med en faktor på sin (30 °) = 1/2. Panel A er gjengitt med tillatelse fra Morgan et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Fargestofflevering til Arabidopsis-blader ved bruk av on-chip og on-plant metoder med fibre på stive underlag. (A-P) Bildene ble tatt ved hjelp av konfokalmikroskopi. On-chip-metode (A-H): 1 μL 10 μM fluoresceinfargestoff ble tørket i 15 minutter på VACNF-chips, og deretter ble sjetongene tappet inn i den abaxiale siden av Arabidopsis-bladene med pinsett. (AD) Blader avbildet innen 5-15 min etter levering. (E-H) Blader avbildet 1 time etter levering. (A,E) +Fargestoff, +Fibre. Kontroller: (B,F) -fargestoff, -fibre; (c,g) -fargestoff, +fibre; (D,H) +Fargestoff, -fibre. (I-P) Metode på anlegget: 1 μL 10 μM fluoresceinfargestoff ble plassert på planteoverflaten, flis ble plassert slik at de kom i kontakt med dråpen, og pinsett ble brukt til å tappe brikken inn i abaxialsiden av Arabidopsis-bladene. (I-L) avbildet innen 5-15 minutter etter levering og (M-P) avbildet 1 time etter levering. (I,M) +Fargestoff, +Fibre. kontroller: (J,N) -fargestoff, -fibre; (K,O) -fargestoff, +fibre; (L,P) +Fargestoff, -fibre. Panel A-P er enkeltplane bilder fra z-stakker. Skalastenger er 20 μm. Fibre har en 35 μm stigning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Tidsforløp for fargestofflevering i Arabidopsis via plantemetode med stivt substrat. Bildene ble tatt ved hjelp av konfokalmikroskopi. Ved bruk av metoden på anlegget ble 1 μL dråpe fluoresceinfargestoffoppløsning (10 μM) plassert på overflaten av et blad, og VACNF-brikken ble plassert på toppen av dråpen. Ved hjelp av en pinsett ble brikken forsiktig tappet inn i vevet. +Fargestoff, +Fiberbilder av samme område ble tatt hvert 5. Skalastenger er 20 μm. Fibre har en 35 μm stigning. Paneler er enkeltplane bilder fra z-stakker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Fargestoff til jordbærfrukt ved bruk av VACNF-filmer. (A-H) Bildene ble tatt ved hjelp av konfokalmikroskopi. Ved hjelp av on-chip-metoden ble fargestoffdråper tørket på VACNF-filmer, som deretter ble rullet på fruktoverflater ved hjelp av en sminkeapplikator. Fluoresceinfargestoff (10 μM) ble levert til jordbærceller og avbildet etter (A) 10 min og (B) 1 time. (C,D) Ingen behandlingskontroller (-fargestoff, -fibre). (E,F) -Fargestoff, +Fibre kontroller etter henholdsvis 10 min og 1 time. (G,H) +Fargestoff, -Fibre kontroller etter henholdsvis 10 min og 1 time. Skalastengene er 40 μm. Paneler A-H er maksimale projeksjoner på 188 μm z-stabler. Fibre har en 35 μm stigning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12: Fargestofflevering og forbigående transformasjon av epler via VACNF-filmer. (A-F) Bildene ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopi. Ved hjelp av on-chip-metoden ble 1 μL dråper fluoresceinfargestoff (10 μM, B og D) eller 1 μL plasmidkoding pUBQ10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) tørket på VACNF-filmer, som deretter ble rullet på fruktflater ved hjelp av en sminkeapplikator. Fluoresceinfargestoff ble levert til epleepidermis og avbildet etter (B) 10 min og (D) 2 timer. (D) Fargestoffet tok litt tid å diffundere inn i cellene etter levering. DNA-YFP levering og uttrykk via VACNF filmer etter (F) 48 h. (A, C, E) ingen behandlingskontroller (-Dye / DNA-YFP, -Fibres). Skalastengene er 40 μm. Paneler A-D er enkeltplane bilder fra z-stabler. Panelene E og F er den maksimale projeksjonen på 53 μm z-stabler. Fiberhøyden er 35 μm. Pilene angir fluorescein- eller YFP-signaler. * indikerer fibre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: Transient transformasjon av Arabidopsis-blader ved bruk av on-plant eller on-chip VACNFs metoder. (A-H) Bildene ble tatt ved hjelp av konfokalmikroskopi 48 timer etter DNA-levering. (A,C,E,G) Metode på planten: 1 μL plasmidkoding pUBQ10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) ble plassert på den abaxiale siden av Arabidopsis-blader. Chips ble plassert slik at de kom i kontakt med dråpen, og pinsett pleide å tappe brikken inn i bladvev. (B,D,F,H) On-chip metode: 1 μL DNA-YFP (200 ng) ble tørket i 15 minutter på VACNF-chips og deretter tappet sjetongene inn i den abaxiale siden av Arabidopsis-bladene med pinsett. +DNA-YFP, +Fibre for (A) on-plant og (B) on-chip. Kontroller: (C,D) -DNA-YFP, + fibre; (E,F) +DNA-YFP, -fibre; og (G,H) -DNA, -Fibre. (I) Graf over relativ gjennomsnittlig fluorescenssignalintensitet på 25 20 × 20 μm områder fra bilder av 5 biologiske replikater kombinert fra 2-3 eksperimenter ved bruk av fluorescens fra YFP-kanalen. Regioner med spalteåpning (*) ble ekskludert på grunn av autofluorescens. Den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten fra -DNA-YFP, -Fibers tilstand ble trukket fra hvert gjennomsnitt. 2-veis ANOVA (og Tukey-test) ble brukt til signifikanstesting, og feilfelt representerer standardfeilen til gjennomsnittet. Ulike bokstaver viser signifikante forskjeller mellom behandlingene (P < 0,0001). Alle bildene som vises er maksimale projeksjoner på 40 μm z-stabler. Skalastenger er 20 μm. Hvite piler indikerer fibre i bildene. Fiberhøyden er 35 μm. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Morgan et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 14
Figur 14: Forbigående transformasjon av løk ved bruk av VACNF-filmer. Bildene ble tatt ved hjelp av konfokalmikroskopi 48 timer etter DNA-levering. Ved hjelp av on-chip-metoden ble 1 μL plasmid DNA-koding pUBQ 10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) dråper tørket på VACNF-filmer i10 minutter, som deretter ble rullet på planteorganoverflater. (A) DNA-YFP ble levert til, og YFP ble uttrykt i løkepidermis. (B) Ingen behandlingskontroll; (C) kontroll (+DNA-YFP, -fibre) og (D) kontroll (-DNA-YFP, +Fibre). Skalastengene er 40 μm. Fibre har en 35 μm stigning. Bilder er maksimale projeksjoner på 115 μm z-stabler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 15
Figur 15: Vevsskade i salat fra VACNF-filmapplikasjon . (A-D) Bildene ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopi. (A) On-chip-metoden ble brukt til å levere DNA til salatblader via VACNF-filmer. pUBQ 10: YFP DNA (200 ng) dråper ble tørket i10 minutter på VACNF-filmer, som deretter ble rullet på den abaxiale siden av frittliggende salatblader og lagret i et fuktighetskammer i 4 dager. (B) kontroll (-DNA-YFP, + Fibre). (C) kontroll (+DNA-YFP, -fibre), og (D) ingen behandling (-DNA-YFP, -fibre). Skalastenger er 40 μm. VACNF-er har en 35 μm stigning. Pilene peker på planteskader som følge av rulling av det fleksible underlaget med for mye kraft. Merk at vellykket VACNF-mediert DNA-levering i salat ble oppnådd i andre eksperimenter7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 16
Figur 16: Arbeidsflyt for VACNF-mediert levering i anlegg. I trinn I, kontroller geometrien til fibrene ved hjelp av SEM. For riktig levering trenger fibrene et tips med en diameter på <200 nm. Hvis du bruker fibre på fleksibelt substrat, vil neste trinn være å bekrefte at fibre overføres til SU-8 og å kontrollere høyden på de eksponerte fibrene via SEM. I trinn II testet vi bruken av fibrene ved å prøve å levere fargestoff inn i planten / organet du valgte ved hjelp av et stivt eller fleksibelt substrat. Bruk 1 μL dråpe, enten plasser den på planteoverflaten eller tørk den kort på sponet/filmen. Med dette trinnet og alle andre trinn, er det viktig å bruke de riktige kontrollene (-Dye, -Fibers; -Dye, + Fibers; og + Dye, -Fibers) for å være sikker på at signalet kommer fra bona fide fargestofflevering. I fase III, bekreft at genet av interesse er tilstede i plasmidet, bestem konsentrasjonen av DNA som skal leveres, og test den optimale tiden etter levering for å kontrollere uttrykk. I fase IV ble utfallet evaluert ved hjelp av konfokalmikroskopi for å kontrollere uttrykket av den leverte markøren. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Morgan et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I dette papiret presenterte vi metoder for å konstruere vertikalt justerte karbonnanofiberarrayer, overføre fibrene til et fleksibelt substrat og påføre fibre i enten et stivt eller fleksibelt substrat til planter for bruk i levering av biomolekyler eller fargestoffer til planter. Vi beskrev to generelle tilnærminger, on-chip og on-plant metoder, for deponering av de introduserte materialene og viste vellykkede resultater i fibre på et stivt substrat samt on-chip-metoden ved bruk av VACNF-filmer. Anvendelsen av disse fibrene er enklere i praksis og teori enn tradisjonelle plantetransformasjonsmetoder (partikkelbombardement, protoplasttransformasjon via PEG eller elektroporering) og kan brukes til planter som er gjenstridige mot Agrobacterium-mediert transformasjon. Imidlertid blir bare noen få celler transformert.

Vertikalt justerte karbonnanofibre ble produsert ved Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences gjennom deres brukerprogram. Brukere kan søke om å bruke dette anlegget for produksjon av VACNFer. Alternativt kan VACNF-brikker produseres i rene rom med likestrømsforsterkede kjemiske dampavsetningsmaskiner med en karbonkilde22,23. Med metodene som er beskrevet, er det noen få trinn som er kritiske for produksjonen av fibrene, fiberoverføringen og anvendelsen av VACNF-brikkene/filmene. For at fiberapplikasjonen skal fungere, må fibrene være rette og ha en avsmalnende diameter på <200 nm på spissen for levering i planteceller for å lykkes 6,7 (figur 3). For å lage karbonnanofibre av spesiell størrelse og tonehøyde, er det en rekke parametere som kan endres, inkludert punktstørrelse, sidehøyde og mengden katalysator som er avsatt. For å velge den optimale punktstørrelsen som skal brukes til karbonnanofiberproduksjonen, ble fibre dyrket fra forskjellige punktstørrelser (som vist i figur 5). Vi fant at 300 nm diametere produserte de beste fibrene, derfor ble denne punktstørrelsen valgt (figur 5). Etter å ha funnet de riktige parametrene, så vi etter å bruke sjetonger som har >50% fibre med den ideelle geometrien (rett og en spissdiameter <200 nm). For å sjekke geometrien til fibrene brukte vi skanning elektronmikroskopi for å avbilde tilfeldige synsfelt på en prøve av VACNF-brikker / filmer.

I tillegg må fibrene ha en viss minimumslengde for å oppnå levering i planteceller. Betydningen av å produsere fibre av forskjellig lengde er at lengre fibre kan brukes til å trenge inn i dypere vevslag. Lengre fibre (>40 μm i lengde) er avgjørende for fleksible filmer, da fiberoverføringen fungerer ved å bryte fibrene fra basen og krever lagdeling av SU-8 på toppen av fibrene. Arbeidstykkelsen til SU-8-laget som brukes til denne protokollen er 20-35 μm. Minimumshøyden som er nødvendig for å oppnå levering i epidermis av forskjellige planter (buet eller flatt) er 10-15 μm 6,7. Som et resultat er fibre med lengder >40 μm nødvendige for VACNF-filmer. Det er flere forskjellige parametere å vurdere når man produserer karbonnanofibre: katalysatormateriale, katalysatorgeometri, tykkelse av katalysatormateriale samt forhold i PECVD-kammeret (gassforhold, trykk, temperatur, strøm, dusjhodehøyde og veksttid) 8,9,24,25. For å produsere karbonnanofibre lengre enn 25 μm brukt av Morgan et al.7 og Davern et al.6, økte vi mengden Ni-katalysator, endret acetylen: ammoniakkforholdet og økte strømmen og veksttiden. I tillegg har vi lagt mer vekt på geometrien til katalysatormaterialet. For å produsere høye rette fibre måtte den avsatte katalysatoren ha en hockeypuckform i stedet for en form som ligner en vulkan (figur 4). Vulkanstrukturer oppstår fra rester av fotoresist etter oppskytning. For å forhindre dannelse av vulkaner ble et dobbeltlag av PMMA brukt til å lage et undersnitt under elektronstrålelitografi26. Underskjæringen hjelper til med å løfte den avsatte metallkatalysatoren (figur 2). Det tykke laget av katalysatoren er viktig for veksten av høye VACNFer. Morfologien til VACNFene har blitt undersøkt av Merkulova et al.24. Den vertikale justeringen av VACNFer skyldes både Ni-katalysatorspisstypeveksten og justeringene av DC-potensialet vinkelrett på substratet (figur 6). Dusjhodet beskriver geometrien til PECVD-reaktoren (figur 6) og fungerer som kilde for potensialet for det elektriske feltet27.

For å definere rekken av katalysatorpunkter med elektronstrålelitografi, brukte vi en elektronstrålemotstand (polymetylmetakrylat), og brukte deretter e-strålen til å lage små hull i motstanden med en bestemt form og på bestemte steder på waferen. Hull med ønsket diameter ble plassert på et vanlig rutenett med den definerte avstanden (tonehøyde) og en fil som spesifiserte ønsket mønster ble lastet inn i elektronstrålelitografiverktøyet før underlaget ble lastet inn i maskinen. I tillegg til fiberhøyde er en annen kritisk parameter for vellykket fiberoverføring mengden tid brukt i acetonbadet. VACNF-filmene må stå i acetonbadet lenge nok til at kantene begynner å krølle seg; Hvis de blir igjen i acetonbadet i for liten tid, er de vanskeligere å løfte av sjetongene og kan bryte. Jo eldre sjetongene er, desto lengre må de forbli i acetonbadet. Etter acetonbadet ble filmene/flisene plassert i isopropanol og vann for å fjerne tilgangsaceton samt å fjerne den beskyttende fotoresisten på fibrene.

For å utføre spinnbelegg plasseres wafere eller waferstykker på en vakuumchuck i spinnbelegget, og waferens sentrale posisjon verifiseres ved hjelp av testfunksjonen til spinnbeleggeren. En liten sølepytt (~ 2,5 cm i diameter) motstand påføres midten av waferen og spunnet (3000 o / min i 45 s) Bilder av fibrene før og etter spinnbelegg er inkludert i figur 8 som viser bevaring av fibergeometri (høyde, orientering og tonehøyde). Tilstedeværelsen av fibre forårsaker motstand mot godt opp ved foten av fibrene og resulterer i tykkere lag enn forventet. Spin-coating etter VACNF-vekst har blitt utforsket av andre grupper11,18.

Et annet trinn i prosessen som er av avgjørende betydning er å sikre at riktig mengde kraft påføres VACNF-brikker / filmer. Tilførselsmekanismen er avhengig av at fibre lager små punkteringer i cellevegger via impulskraften til pinsetten, banker på stive underlag 6,7 eller ruller med mini-sminkeapplikatoren på fleksible underlag. Fibre kan eller ikke kan bryte av og forbli innebygd i planteceller6,7 uten å påvirke utfallet, men praksis i forbindelse med undersøkelse for fargestoffopptak og vevskader er nødvendig for å få trykket riktig. I tillegg er det viktig å velge passende avbildningstidspunkter etter DNA-levering med VACNF-brikker/filmer, da tiden til detekterbart uttrykk varierer mellom plantearter og hvilke typer vektorer som leveres7 (figur 16).

Så bredt anvendelig som denne metoden er for planter, har den noen begrensninger. For eksempel vil tilsetning av et tynt lag silisiumoksid til VACNF-filmene ikke alltid resultere i at filmer blir helt hydrofile på grunn av det beskyttende laget av fotoresist lagt på toppen av SU-8. Hvis dette problemet oppstår, kan tykkere lag av silisiumoksid påføres VACNFer. For å teste om filmene er hydrofobe eller hydrofile, kan de plasseres i vann. Hvis filmene synker, er de hydrofile, og hvis de flyter, er de hydrofobe. I tillegg kan det være variasjon mellom partier av produserte fibre. Det er flere parametere som kan endres når fibrene vokser i dc -PECVD-maskinen; det som er beskrevet i denne protokollen er et sett med parametere for to forskjellige mengder Ni-katalysator. I tillegg kan krystallorienteringen til Ni-katalysatoren ikke kontrolleres28 , og noen forgrening vil uunngåelig resultere i fibrene.

Mens vi demonstrerte levering av fluoresceinfargestoff og DNA til planteceller ved hjelp av både stive og fleksible substrater for dette papiret, bør metoden være bredt anvendelig for andre biomolekyler og genetiske modifikasjonsmetoder, for eksempel RNAi-silencing for plantesystemer som epler eller andre frukter der det ville ta år å produsere stabile transgene linjer. Videre kan disse fibrene også brukes til å levere genetiske redigeringsmaterialer eller for stabile transformasjoner i planter.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Nanofiberarrays ble produsert ved Center for Nanophase Materials Sciences, som er en Department of Energy Office of Science User Facility (Forslag ID: CNMS2019-103 og CNMS2022-A-1182). Støtte fra CNMS tildeles gjennom et fagfellevurdert forslagssystem og gis uten kostnad til vellykkede søkere som har til hensikt å publisere sine resultater (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Vi takker Kevin Lester og CNMS for hjelp med produksjon av nanofiberarrays. Vi takker Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs og Travis Bee for kritiske diskusjoner om eksperimentell design. Vi takker Dr. Adam Rondinone for skjematisk av PECVD maskinen. Vi takker Leslie Carol for de vitenskapelige illustrasjonene. Dette arbeidet ble finansiert av Bioimaging Science Program, US Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 og United States Department of Agriculture, 2021-67013-34835. JMM ble støttet av United States Department of Agriculture: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct Fastenal  690535
2-Propanol (IPA)  Fischer Scientific A451-4
4" Lid Entegris H22-401-0615 Wafer Carriers
4" tray Entegris H22-40-0615 Wafer Carriers
Accretech SS10 dicing saw Accreteck SS10
Acetone Fischer Scientific A18-4
Acetone used in the cleanroom at ORNL JT Baker 9005-05
Apples Grocery store No product number
Arabidopsis thaliana  Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago No product number
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine Oak Ridge National Laboratory  Custom-built
Cobham Green lettuce  Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis No product number Butterhead lettuce
Fluorescein dye Sigma Aldrich F2456-2.5G
Gel-box  Gel-Pak  AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool  Heidelberg DWL 66
ImageJ National Institues of Health  No product number
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL Doe and Ingalls CMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system JEOL 8100
Kimwipes Kimtech Kimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish VWR 11019-554
Layout Editor   juspertor GmbH No product number 
LSM 710 confocal microscope Zeiss No product number
LSM 800 confocal microscope Zeiss No product number
Make-up applicator  Amazon G2PLUS 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS
Merlin field emission scanning electron microscope Zeiss Merlin
MIBK/IPA  (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) Microchem M089025
Onions Grocery store No product number
Oxford FlexAl atomic layer deposition Oxford FlexAl
PMMA 495 A4 Microchem M130004
PMMA 950 A4 Microchem M230004 Can dilute down to A2
Polyethylene terephthalate (PET) Amazon KS-6304-21-11 Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc
Precision tweezers Aven Inc.  18032TT
pUBQ10:YFP-GW Arabidopsis Biological Resource Center CD3-1948
Silicon etcher (used for descum)  Oxford Plasmalab
Silicon rubber kit Smooth-On Inc Ecoflex 00-20
Silicon wafers Pure Wafer 4N0.001-.005SSP-INV
Spin coater Brewer Sciences Model 100CB
SPR 955cm 0.7  Megaposit 10018314
Strawberries Grocery store No product number
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 Series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 developer Microchem SU-8 2000 Series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Suss MicroTec contact aligner Suss MicroTec MA6/BA6
Table top microscope Phenom XL used for checking Ni catalysts after metal deposition
Thermionics VE-240 e-beam evaporator Thermionics VE-240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
  2. Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
  3. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
  4. Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).
  5. Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
  6. Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).
  7. Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).
  8. Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).
  9. Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).
  10. Nelson-Fitzpatrick, N. Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).
  11. Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
  12. Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. Processing of thin SU-8 films. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020 (2008).
  13. Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).
  14. Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527 (2011).
  15. Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
  16. Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008 (2019).
  17. Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
  18. Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Crafts, A. S. Translocation in plants. Plant Physiology. 13 (4), 791 (1938).
  21. Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
  22. Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
  23. Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).
  24. Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
  25. Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
  26. Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
  27. Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
  28. Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).

Tags

Vertikalt justerte karbon nanofiberarrayer stivt substrat fleksibelt substrat levering av biomolekyler levering av fargestoffer nanomaterialer DNA-levering til planter mikrofabrikasjon forbigående transformasjon fluoresceinlevering VACNFs overføring SU-8 epoksysubstrat silisiumoksidbelegg hydrofob natur buede planteorganer fargestoffløsning levering av DNA-løsning
Ved hjelp av vertikalt justerte karbon nanofiberarrayer på stive eller fleksible underlag for levering av biomolekyler og fargestoffer til planter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, J. M., Jelenska, J.,… More

Morgan, J. M., Jelenska, J., Hensley, D. K., Li, P., Srijanto, B. R., Retterer, S. T., Standaert, R. F., Morrell-Falvey, J. L., Greenberg, J. T. Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants. J. Vis. Exp. (197), e65602, doi:10.3791/65602 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter