Summary
Här beskriver vi metoder för mikrofabrikation av vertikalt inriktade kolnanofibrer (VACNF), överföring av VACNF till flexibla substrat och applicering av VACNF på både styva och flexibla substrat till växter för leverans av biomolekyler och färgämnen.
Abstract
Att leverera biomolekyler och ogenomträngliga färgämnen till intakta växter är en stor utmaning. Nanomaterial är nya verktyg för leverans av DNA till växter. Även om dessa nya verktyg är spännande har de ännu inte tillämpats i stor utsträckning. Nanomaterial som tillverkas på styvt substrat (underlag) är särskilt svåra att framgångsrikt tillämpa på krökta växtstrukturer. Denna studie beskriver processen för mikrotillverkning av vertikalt inriktade kolnanofibermatriser och överföring av dem från ett styvt till ett flexibelt substrat. Vi beskriver och demonstrerar hur dessa fibrer (på antingen styva eller flexibla substrat) kan användas för transient transformation eller färgämnesleverans (t.ex. fluorescein) till växter. Vi visar hur VACNF:er kan överföras från ett styvt kiselsubstrat till ett flexibelt SU-8 epoxisubstrat för att bilda flexibla VACNF-arrayer. För att övervinna SU-8:s hydrofoba natur belades fibrerna i den flexibla filmen med ett tunt kiseloxidskikt (2-3 nm). För att använda dessa fibrer för leverans till böjda växtorgan deponerar vi en 1 μL droppe färgämne eller DNA-lösning på fibersidan av VACNF-filmer, väntar 10 min, placerar filmerna på växtorganet och använder en pinne med en rullande rörelse för att driva fibrer in i växtceller. Med denna metod har vi uppnått färg- och DNA-leverans i växtorgan med krökta ytor.
Introduction
Växtomvandling (både övergående och stabil) har ännu inte blivit allmänt uppnåelig i alla växtvävnader och arter. Den transienta omvandlingen av växter är en process genom vilken gener som kodas i plasmider tillfälligt förs in i växter men inte inkorporeras stabilt i genomet. Traditionella metoder som använder partikelbombardemang, agrobakterier, elektroporering eller polyetylenglykolbehandling av protoplaster är långsamma eller kan vara besvärliga. Dessutom är de inte tillämpliga på alla växtarter 1,2,3,4. Användningen av nanomaterial för DNA-leverans är ett växande område som fortfarande är i sin linda5. Nanomaterial, särskilt kolnanofibrer, har också framgångsrikt använts för att leverera proteiner, dextraner och färgämnen till växtblad utan att orsaka sårrespons6. Målet med detta arbete är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för att använda en typ av nanomaterial, kolnanofibrer, för att leverera biomolekyler eller färgämnen till växter. Här fokuserar vi på DNA som den biomolekyl som valts, vilket möjliggör transient transformation av celler i olika växtorgan.
Tidigare har Morgan et al.7 demonstrerat användningen av kolnanofibrer fästa på styvt kiselsubstrat för att tillfälligt omvandla blad av sallad, N. benthamiana och poppel, och både blad och rötter av Arabidopsis. Även om omvandlingar var framgångsrika på en mängd olika organ, var fibrer svårare att applicera på växtvävnader med krökta ytor, såsom rötter eller frukter. Vi resonerade att en flexibel bärare för nanofibrer skulle kunna förbättra deras effektivitet genom att bättre anpassa sig till organets form.
Här beskriver vi metoder som används för att tillverka och designa vertikalt inriktade kolnanofibrer, överföra VACNF:er till flexibla substrat och applicera VACNF:er på både styva och flexibla substrat till växter för att leverera biomolekyler och färgämnen. Kolnanofibrer producerades med hjälp av likströmskatalytisk plasmaförstärkt kemisk ångdeponering (dc C-PECVD) med Ni-katalysator. Positionen, diametern och höjden på Ni-katalysatorprickarna kontrollerades med hjälp av en kombination av elektronstrålelitografi, metallavdunstning och lyftprocesser som beskrivs av Melechko et al.8,9. Med hjälp av ett dubbelskikts e-strålmotstånd kan en tjockare Ni-katalysator deponeras på substratet för att ge längre fibrer10. Fiberöverföring från ett styvt till ett flexibelt substrat är baserat på en modifiering av metoder som beskrivs i Fletcher et al.11, där de nuvarande metoderna avstår från användning av ett amorft kolskikt eller ett offerfotoresistskikt. SU-8 lyft med fiberöverföring uppnås genom att utnyttja den inneboende dragspänningen till följd av underbakning och underexponering av SU-812,13,14. SU-8, en komplex polymer, är naturligt hydrofob, vilket gör det svårt att använda den för att underlätta DNA-leverans. För att motverka SU-8:s hydrofoba natur applicerar vi ett tunt lager kiseloxid via atomlagerdeponering15 efter att fibrerna bäddats in i SU-8. Applicering av fibrer på ett styvt substrat för leverans av biomolekyler/färgämnen utnyttjar slagkraften från pincetttappning som beskrivs i Davern et al.6 och de metoder på växt och på chip som beskrivs i Morgan et al.7. Flexibla VACNF-filmer appliceras på böjda växtytor genom att först halvtorka DNA eller färgdroppar på filmen som med on-chip-metoden från Morgan et al.7och sedan rulla filmerna på böjda växtytor med hjälp av en liten sminkapplikator16,17. Figur 1 visar olika tillvägagångssätt för applicering av fibrer i styva och flexibla substrat på växter.
Protocol
1. Produktion av VACNF-fonder (figur 2 och figur 3)
- Spinna en kiselskiva med polymetylmetakrylat (PMMA) 495 A4 vid 4000 rpm och grädda den vid 180 °C i 5 min.
OBS: Låt skivan svalna i 10 s innan du går vidare till nästa steg. - Pensla ett andra lager resist (PMMA 950 A2) och grädda i 180 °C i 5 minuter.
- Använd elektronstrålelitografi för att definiera katalysatorpunkterna med diametrar på 300 nm vid ett specificerat avstånd i sidled (stigning: 10 μm eller 35 μm) i matriser med måtten 3 mm x 3 mm.
- Utveckla resisten i 30-40 ml 1:3 metyl-isobutylketon: isopropylalkohol (IPA) i 1,5 min, följt av att skölja den med IPA och torka den med N2 .
OBS: Kontrollera om det finns en matris av prickar med hjälp av ett ljusfältsmikroskop (20x objektiv). - Rengör skivan från restresisten med en 6 s exponering i syreplasma (descum) i en kiseletsare.
- Använd elektronstråleavdunstning för att först deponera ett vidhäftande metallskikt (Ti eller Cr, 10 nm) och sedan deponera ett andra lager, som är Ni-katalysatorn (130 nm eller 150 nm). Under Ti- eller Ni-metallavsättning, håll strömmen under 0.2 A vid 10 kV, trycket under 5 x 10-6 Torr och avsättningshastigheten vid ~1 A/s för avsättning av siktlinje.
- Använd sekventiell bad ultraljudsbehandling för att ta bort metallen (Ni) som deponeras på det underliggande resistskiktet, vilket lämnar Ni deponeras direkt på kiselskivan. Denna process kallas lift-off.
- För detta, förbered 3 behållare med aceton och bada sonikerat skivan i aceton i 1 min; upprepa 3 gånger vid rumstemperatur (RT, 20 °C) med en frekvens av 35 kHz. Skölj med IPA och torka med N2.
OBS: Låt aldrig aceton torka på skivan. Efter den sista acetonultraljudsbehandlingen, skölj omedelbart med IPA och torka sedan medN2-gas . Om skivan vid något tillfälle blir för torr (före IPA-sköljning) finns det möjlighet att inte all överflödig metall och motstånd kommer att avlägsnas och acetonet kan lämna rester.
- För detta, förbered 3 behållare med aceton och bada sonikerat skivan i aceton i 1 min; upprepa 3 gånger vid rumstemperatur (RT, 20 °C) med en frekvens av 35 kHz. Skölj med IPA och torka med N2.
- Kontrollera geometrin hos katalysatorformen med hjälp av svepelektronmikroskopi (SEM). För att ta SEM-bilder av VACNF-chipsen, luta scenen till en 30° vinkel och använd en spänning på 1-3 kV, med en strålström på ~100 pA och ett ~5 mm arbetsavstånd.
OBS: Katalysatorn ska se ut som en hockeypuck (en kompakt cylinder) (Figur 4). Höjden på den kompakta cylindern bör återspegla tjockleken på Ni som deponeras på kiselskivan. Om Ni-punktens profil är hög och verkar vara konkav i toppen, som liknar en vulkan (figur 4), är det mer sannolikt att katalysatorn avvätas i flera Ni-droppar vilket resulterar i förgrening av kolnanofibrerna9 (figur 4 och figur 5). Sådana problem kan bero på att motstå smältning under metallavdunstning på grund av långa avsättningstider eller problem med lyftproceduren (Figur 4 och Figur 5). - Fjärdedel av kiselskivan och placera den i likströmsplasmaförstärkta kemiska ångavsättningskammaren (dc-PECVD) med acetylen/ammoniakblandningen. Optimera tillväxtparametrarna för att kontrollera längden och avsmalningen av nanofibrer (spetsar <200 nm).
- Använd en ström på 1-1,5 A och ett spänningsområde på 440-560 V. När du odlar fibrerna, använd en förbehandlingsfas med ammoniakflöde medan maskinen och substratet värms upp till 620 °C. Se till att slå på kolkällan (acetylen) 10 s innan du startar plasman.
OBS: Kvartsskivor används om PECVD-maskinens körparametrar behöver optimeras. För att producera fibrer med längder större än 40 μm och spetsar mindre än 200 nm i diameter föreslås följande parametrar: med en Ni-katalysatortjocklek på 130 nm, använd en ström på 1,75 A, tillväxttid på 70 min och ett acetylen : ammoniakförhållande på 45 standardkubikcentimeter per minut (sccm): 100 sccm. Med en Ni-tjocklek på 150 nm, använd en ström på 1,5 A, en tillväxttid på 80 min och ett acetylen : ammoniakförhållande på 48 sccm : 100 sccm. Använd följande parametrar för att odla VACNF oavsett katalysatortjocklek: tillväxttemperatur på 620 °C, tryck på 10 torr under plasma och en duschmunstyckshöjd på 20 mm (figur 6).
- Använd en ström på 1-1,5 A och ett spänningsområde på 440-560 V. När du odlar fibrerna, använd en förbehandlingsfas med ammoniakflöde medan maskinen och substratet värms upp till 620 °C. Se till att slå på kolkällan (acetylen) 10 s innan du startar plasman.
- Bedöm geometrin hos de resulterande fibrerna med hjälp av SEM vid en 30° lutning med en accelerationspotential på 1 kV.
OBS: Optimala fibrer kommer att vara raka och icke-förgrenade. Det är omöjligt att kontrollera kristallorienteringen av Ni-katalysatorn med elektronstråleförångaren. Som ett resultat kommer det att finnas några fibrer som förgrenar sig på grund av katalysatoravvätning9. Dessutom gör kristallorienteringen att VACNF:erna växer till olika höjder, så enhetliga höjder på alla VACNF:er är svåra. - Spinnbelägg ett lager fotoresist (SPR955) på fibrerna vid 1000 rpm i 45 s. Tärna sedan 1/4 skivan i 3 mm x 3 mm matriser med hjälp av en tärningssåg. Förvara fibrerna vid denna tidpunkt för senare användning.
OBS: Utför inte steg 1.11 om du planerar att överföra fibrer till ett flexibelt substrat.
2. Transferring av VACNF:er till ett flexibelt substrat (figur 7 och figur 8)
- Efter att fibrerna har syntetiserats, spincoat SU-8 2015 fotoresist på wafers eller quarter wafers vid 4000 rpm i 45 s.
- Mjukgrädda rånet i 3 min i 95 °C.
- Använd en kontaktaligner och exponera skivan med en 3 mm 3 mm arraymönstrad mask som överensstämmer med det definierade mönstret från elektronstrålelitografi vid 95 mJ/cm2.
OBS: Använd ett närhetskontaktläge med ett exponeringsgap som är 20 μm större än den högsta fibern. Det finns en möjlighet att fibrer kan välta under detta steg i processen. - Grädda efter exponeringen i 6 minuter vid 95 °C.
- Utveckla skivan i SU-8-framkallaren i 15 s, skölj den med IPA och torka skivan med N2, gå uppifrån och ner.
OBS: När du utvecklar skivan, se till att den är helt nedsänkt. - Spincoatmönstrade wafers med ett skyddande skikt av tunn fotoresist (SPR 955 CM 0,7) vid 3000 rpm i 45 s och softbake i 30 s vid 90 °C.
- Deponera ett tunt kiseloxidskikt på skivan (2–3 nm) genom att placera det i ett atomskikt under 22 cykler vid 100 °C.
- Använd en tärningssåg för att skära skivan i rutor på 3 mm x 3 mm. Rikta in tärningssågen mot det befintliga mönstret på skivan.
- Bedöm geometrin hos de resulterande fibrerna med hjälp av SEM vid en 30° lutning med en accelerationspotential på 3 kV.
- Stanna här om du förvarar chips för långvarig användning (>1 vecka). Förvara chipsen i mörkret.
- För att separera flexibla substrat från styva substrat, placera enskilda spån i aceton i 30 minuter eller tills SU-8 börjar krulla.
- Tvätta SU-8-filmer (antingen fästa på eller lossade från styva underlag) med IPA i 5 minuter och sedan med vatten i 5 minuter. Placera chipsen i en kommersiell låda med en klibbig dyna när du transporterar dem.
- VALFRITT: Placera den fiberfria sidan av SU-8-filmen på vattenlöslig tejp eller ovanpå tunt silikongummi med en tunn polyetentereftalat (PET) (12.5 μm tjock) baksida.
- Använd en pincett för att överföra SU-8-filmen. Tryck på kanterna på SU-8-kvadraten för att hjälpa den att fästa vid tejpen/silikongummi-PET; Detta för att undvika att fibrerna bryts av. Vid denna tidpunkt är VACNF-filmerna redo för omedelbar användning.
- För att förbereda en silikongummi/PET-hållare, gör följande: använd ett 2-delat kit för silikongummi och blanda ihop de två delarna (elastomeren och tvärbindaren). Skär sedan ut en fyrkant av PET och tejpa fast den i en genomskinlig plastskål. Häll ett mycket tunt lager silikongummi ovanpå PET och härda det vid 80 °C i 1-2 timmar.
3. Metod på anläggningen (där en droppe lösning som ska levereras placeras på en växtyta) med hjälp av fibrer i ett styvt substrat (figur 1A)
- Ta bort fotoresisten med stegtvättar av aceton (100 %, 5 min), IPA (100 %, 5 min) och ddH2O (5 min) före användning.
- Placera växtvävnaden som ska spetsas på en hård yta för stöd.
- Placera en 1 μL droppe färgämne eller DNA (200 ng) på ytan av växtvävnaden.
- Placera ett VACNF-chip med ett styvt substrat ovanpå droppen, med fibrerna orienterade så att de kommer i kontakt med droppen.
OBS: Chipsens orientering kan bestämmas av skivans "glans". Den blanka sidan av chipet har fibrer, och den ogenomskinliga sidan har det inte. - Använd den platta sidan av en pincett och knacka på chipet. Markera det område på växten som flisen kom i kontakt med med en markör med mjuk spets. Ta bort VACNF-chipsen efter leverans.
OBS: Mängden kraft som appliceras vid knackning kommer att variera beroende på vilken typ av växtvävnad som används. Det rekommenderas att öva på att knacka på chips innan du utför spetsning av fibrer. Undvik skador på växtvävnader. Skadan är uppenbar när man kan se konturerna av VACNF-chipet i växtvävnaden. - Upprepa steg 3.1-3.5 för kontroller (+Färgämne/DNA, -Fibrer; -Färgämne/DNA, +Fibrer; och -Färgämne/DNA, -Fibrer). -Fibrer är den fiberfria sidan av ett chip.
- Förvara intakta växter eller utskurna växtorgan i fuktiga kammare under långa dagar (16 timmar ljust, 8 timmar mörkt) om det behövs. För utskurna organ, använd en petriskål av plast med våta pappershanddukar.
4. On-chip-metod (där en droppe lösning som ska levereras placeras på ett VACNF-chip), styvt substrat (figur 1B)
- Ta bort fotoresisten med stegtvättar av aceton (100 %, 5 min), IPA (100 %, 5 min) och ddH2O (5 min) före användning.
- Droppa 1 μL droppe färgämne eller plasmid-DNA (200 ng) på fibersidan av VACNF-chipet med styvt substrat. Se till att placera droppen i mitten av chipet och täck flera fibrer. Låt droppen torka i 15 min.
OBS: Chipsens orientering kan bestämmas av skivans "glans". Den blanka sidan av chipet har fibrer, och den ogenomskinliga sidan har det inte. - När du arbetar med löv eller andra utskurna organ, placera dem ovanpå en hård yta. När du arbetar med intakta växter, placera en hård yta under organet som VACNF appliceras på.
- Efter 15 minuters torkningssteg, placera VACNF-chippet så att fibersidan kommer i kontakt med växtvävnaden. Knacka på chipet med baksidan av en pincett.
OBS: Mängden kraft som appliceras vid knackning kommer att variera beroende på vilken typ av växtvävnad som används. Det rekommenderas att öva på att knacka på marker. - Upprepa steg 3.6-3.7 i metoden på anläggningen.
5. Applicering av VACNF i SU-8-filmer på växtvävnad med hjälp av on-chip-metoden (figur 1C)
- Placera 1 μL droppe färgämne eller DNA (200 ng) på fibersidan av SU-8-filmen och låt den torka i 10 minuter. Var noga med att placera droppen i mitten av chipet.
OBS: Det finns olika torktider beroende på vilket underlag som används. - Använd en vass pincett och placera VACNF-filmen på växtytan.
OBS: Ju längre SU-8-filmerna lämnas ute i luften, desto sprödare blir filmerna. För att begränsa risken för att förlora SU-8-filmerna, se till att ha alla växter/prover och utrustning nära SU-8-filmerna. - Rulla försiktigt en liten sminkapplikator över VACNF-filmen. Markera de områden där de flexibla substraten placeras med en markör med mjuk spets. Ta bort de flexibla substraten från växtytan med tejp.
OBS: Mängden kraft som appliceras när du rullar sminkapplikatorn kommer att variera beroende på de växtvävnader som används. Öva på att applicera VACNF-filmerna innan du utför leverans av biomolekyler eller färgämnen. Synliga skador på växtvävnader är uppenbara när man kan se konturerna av VACNF-film i växtvävnaden. - Upprepa steg 5.1-5.3 för kontroller och lagringsanläggningar som nämns i steg 3.7 i metoden på anläggningen.
6. Mikroskopi och bildanalys för alla leveranssätt
- Ta en bild av proverna med ett konfokalmikroskop med emissions- och excitationsvåglängder som är lämpliga för den levererade fluorescerande sonden/reportern.
OBS: Den tid som krävs för den transienta omvandlingen varierar med växtarten och markören som levereras. Till exempel detekterades uttrycket av fluorescerande markörer efter 48 timmar i Arabidopsis jämfört med 96 timmar i salladsblad7. - När du avbildar, försök att fokusera på en region med lossnade fibrer. Fibrer kommer att ha olika orienteringar. Leveransens framgång är inte beroende av utseendet på avbrutna fibrer.
OBS: Fibrerna kommer att vara fluorescerande med de vanligaste excitations-/emissionsinställningarna på grund av bildandet av kiselnitridskikt till följd av fiberbildningen i PECVD18. - Ta minst 5 bilder för varje prov. Den resulterande signalen kommer att variera.
- Mät fluorescensvärdena som total fluorescens (integrerad densitet) i 20 μm x 20 μm konfokala bildområden7 med hjälp av ImageJ19.
Representative Results
Den tydliga fördelen med VACNF-chips på styva eller flexibla substrat är förmågan att leverera biomolekyler eller färgämnen till specifika platser på en anläggning (figur 1). Här använde vi fluorescensavläsningar för att bedöma leveransen. Genom att använda olika växter, substrat och leveransmetoder (on-chip eller on-plant) kan det finnas skillnader i tidpunkten för uppkomsten av färgämnesfluorescein. För att avgöra om VACNF-chips/filmer fungerar för leverans är ett snabbt tillvägagångssätt att använda fibrer för färgtillförsel (figur 9). Bilder märkta med olika tider i figur 9 är olika synfält från samma exempel. Vid användning av on-plant metod kan fluoresceinfärgämne observeras omedelbart efter leverans med hjälp av fluorescensmikroskopi. Dessutom, om samma synfält avbildas över tid efter att ha levererat fluoresceinfärgämne till en växt, blir signalintensiteten mindre ljus med tiden (figur 10). Fluoresceinfärgämnet kan potentiellt röra sig från synfältet till andra delar av bladet genom plasmodesmata20,21. Jämfört med on-plant-metoden, i on-chip-metoden med fibrer på det styva substratet, rör sig färgämnet långsammare genom hela det spetsade området (figur 9). Detta kan vara ett resultat av att färgämnet lossnar från fibrerna/återfuktar i cellerna och därmed tar längre tid att röra sig.
Fibrerna i det flexibla substratet var lämpliga för färgtillförsel till böjda ytor som jordgubbar och äpplen (Figur 11 och Figur 12). Med hjälp av ett flexibelt substrat med jordgubbar observerades en stark fluoresceinsignal direkt (Figur 11), medan det tog 2 timmar att se en stark fluoresceinsignal i äpplen (Figur 12B,D). Den framgångsrika leveransen av plasmider som kodar för fluorescerande markörer kan bestämmas med hjälp av fluorescensmikroskopi för att hitta den resulterande signalen (Figur 12F, Figur 13 och Figur 14). Kontroller är nödvändiga för att avgöra om den valda växten inte har någon autofluorescens som liknar den fluorescerande markör vi vill leverera med fibrer. Att enbart använda fibrer är till hjälp för att avgöra om slagkraften som appliceras med pincett resulterar i skador på växtvävnaden eller om den observerade fluorescensen i provet beror på VACNF:erna, som i sig är fluorescerande på grund av deras kiselnitridskikt18 (Figur 13C-D). Fibrer spetsade i växtvävnad inducerar inte sårrespons enligt bedömning av H 2 O2produktion6. Slutligen, med hjälp av kontrollen av +DNA, -Fibrer är nödvändigt för att bekräfta att DNA inte kommer in i växten enbart genom knackning och bekräftar att fibrerna är nödvändiga för leverans till växtceller (Figur 13E-F). Det bör inte finnas någon tydlig skillnad vid användning av on-plant eller on-chip-leveransmetoder med VACNF:er på ett styvt substrat, vilket indikeras av att det inte finns någon signifikant skillnad i fluorescensvärden (figur 13I). Att använda de flexibla VACNF-filmerna med DNA-leverans på chipet resulterade i en framgångsrik transient omvandling av epidermala celler i köpta äpplen och lök (Figur 12F och Figur 14).
Misslyckade experiment kan ha fibrer avbrutna i olika synfält, men det kommer inte att finnas någon fluorescenssignal från försöket att leverera plasmid-DNA eller färgämne. Om för mycket tryck appliceras på växten kommer det att finnas uppenbara vävnadsskador (Figur 15). Denna mekaniska skada kan se ut som små hål eller genomskinliga områden i växten, som om ett lager av celler har tagits bort när man tittar på växten i mikroskop. Ibland kommer avtryck av chipet att vara synliga. Ett experiment där fluorescerande proteinuttryck inte detekteras efter DNA-leverans kan också bero på användning av DNA av låg kvalitet, så det kan vara användbart att förbereda färskt DNA.
Figur 1: Schematisk bild av färgämne/DNA-leverans till växtvävnad med hjälp av fibrer på styva och flexibla substrat. (A) Fibermedierat färgämne/DNA-leverans på växten. En 1-μL droppe färgämne/DNA-lösning placeras på ytan av ett blad och VACNF-chipet placeras ovanpå droppen. Med hjälp av en pincett knackas chipet försiktigt in i vävnaden. Det styva substratet avlägsnas och lämnar nanofibrer i vävnaden. (B) Fibermedierad DNA-leverans på chipet. En droppe på 1 μl färgämne eller DNA-lösning droppas på VACNF-chipet och torkas i 15 minuter. Chipet med halvtorkat DNA placeras ovanpå bladytan och knackas in i vävnaden som i panel A. (C) DNA-leverans på chip SU-8-film. Fibrer överförs från det styva kiselsubstratet till flexibel SU-8-baksida. En droppe på 1 μL färgämne/DNA-lösning droppas på VACNF-filmen och torkas i 10 minuter. VACNF-filmen med det halvtorkade färgämnet/DNA:t rullas sedan på en böjd växtyta med hjälp av en sminkapplikator. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Arbetsflöde för att göra vertikalt inriktade kolnanofibermatriser. För att producera VACNF spinnbeläggs ett dubbelt lager polymetylmetakrylat (PMMA 495 A4 följt av PMMA 950 A2) på en kiselskiva. Elektronstrålelitografi används för att definiera en matris av punkter med en diameter på 300 nm. Resisten utvecklas sedan i metylisobutylketon/isopropanol (MIBK/IPA), 1:3 i 1,5 min. Med hjälp av en metallförångare appliceras ett självhäftande skikt av Ti (10 nm) på skivan, följt av ett lager av Ni (130 nm eller 150 nm). Det återstående motståndet avlägsnas sedan via lift-off (badultraljudsbehandling i aceton). Katalysatorpunkternas geometri inspekteras via SEM. Om katalysatorerna liknar hockeypuckar och är platta, placeras de i PECVD-maskinen (Plasma Enhanced Chemical Vapor Dedeposition) och fibrerna odlas. Fibrerna inspekterades sedan med hjälp av SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: SEM-bilder av ideala vertikalt inriktade kolnanofibrer. (A) Elektronmikroskop av VACNF:er med en stigning på ~35 μm och en höjd på 10-15 μm, avbildad i 30° vinkel. Den här bilden dupliceras i figur 7C. (B) Elektronmikroskop av VANCF med ~20 μm stigning och 20-30 μm höjd, och avbildad i 30° vinkel. (C) Elektronmikroskop av VANCFs med ~35 μm stigning, 50-60 μm höjd, och avbildad i en 30° vinkel. (D) Elektronmikroskop av VACNF-spets med en diameter <200 nm. Det finns variation i fiberspetsdiametrarna (150-300 nm). Eftersom fibrerna avbildades i 30° vinkel verkar höjderna vara mindre än den faktiska höjden med en faktor sin(30°) = 1/2. Panelerna A och B har återgivits med tillstånd från Morgan et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: SEM-bilder av katalysatorns geometri före odling av VACNF:er. (A) SEM-bild av katalysatorn efter start. Observera att fotoresist finns runt katalysatorns kant, vilket resulterar i en vulkanform. (B,C) SEM-bilder visar katalysatorns vulkanformer efter att ha använt ett PMMA-motstånd i ett lager. (D) Önskad form på hockeypuckens katalysator gjord av dubbla lager av PMMA. Eftersom fibrerna avbildades i 30° vinkel i panelerna A, B och D, verkar höjderna vara mindre än den faktiska höjden med en faktor sin(30°) = 1/2. Skalstaplar representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Effekt av katalysatorpunktstorlek på fibertillväxt: För att fastställa den optimala diametern på katalysatormaterialet odlades fibrer från punktstorlekar från 200-600 nm. Punktstorlekar från 400-600 nm ledde till avvätning av katalysatorn och tillväxt av flera fibrer. Den bästa fibergeometrin producerades med en diameter på 300 nm. Mindre prickar ledde till otillräcklig fiberhöjd. På grund av det faktum att fibrerna avbildades i 30° vinkel, verkar höjderna vara mindre än den faktiska höjden med en faktor sin(30°) = 1/2. Bilderna togs med hjälp av svepelektronmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Schematisk illustration av likströms- och plasmaförstärkt kemisk förångningsdeposition (dc-PECVD) som används vid Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Det anpassade systemet på ORNL har ett stort duschhuvud som fungerar som reaktor för matargaser och utgång för plasma. Duschmunstycket hölls vid en DC-potential på 300 V i förhållande till det uppvärmda steget för underlaget. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Arbetsflöde för överföring av fibrer från ett styvt substrat till ett flexibelt substrat. Efter nanofibersyntes och inspektion spinnbeläggs varje skiva med SU-8 2015 vid 4000 rpm i 45 s. Våffloren mjukgräddas sedan i 3 min vid 95 °C. Därefter utsätts skivan för UV-ljus och mönstras i en maskskena med en skena på 95 mJ/cm2. Efter eftergräddning i 6 minuter vid 95 °C framkallas rånet i SU-8-framkallaren i 15 s, sköljs med IPA och torkas medN2-gas . Ett skyddande resistent skikt på SPR 955 CM 0,7 spinnbeläggs på skivan vid 3000 rpm och mjukbakas vid 90 °C i 30 s. Ett kiseloxidskikt (2-3 nm) tillsätts sedan till skivan via atomlagerdeponering (ALD) (22 cykler vid 100 °C) för att göra det flexibla substratet hydrofilt15. Skivan tärnas sedan i rutor på 3 mm x 3 mm med en tärningssåg. Vid användningstillfället placeras enskilda chips i aceton tills SU-8 börjar krulla sig och blir konkav (>30 min). Vid denna tidpunkt kan SU-8-skiktet på de flesta chips gripas i kanten med en vass pincett och skalas av från det underliggande kiselsubstratet som en intakt 3 mm fyrkantsfilm. Filmen tvättas sedan successivt i IPA och vatten i 5 min vardera och används omedelbart. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: SEM-bilder av fiberöverföring från ett styvt substrat till ett flexibelt substrat. Bilderna som visas är representativa men kommer från olika prover. (A) Långa fibrer efter PECVD-tillväxt (samma bild som i figur 2C). (B,C) Fibrer efter applicering av SU-8. Epoxin väller upp runt basen av fibrerna. Den exponerade fiberlängden varierade från 5 μm till 30 μm. (D) Fibrer inbäddade i Su-8 efter lyft behöll sin geometri. På grund av det faktum att fibrerna avbildades i 30° vinkel, verkar höjderna vara mindre än den faktiska höjden med en faktor sin (30°) = 1/2. Panel A har återgetts med tillstånd från Morgan et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Färgleverans till Arabidopsis-blad med hjälp av on-chip och on-plant-metoder med fibrer på styva substrat. (A-P) Bilderna togs med hjälp av konfokalmikroskopi. On-chip-metod (A-H): 1 μL 10 μM fluoresceinfärgämne torkades i 15 minuter på VACNF-chips, och sedan tappades chipsen in i den abaxiala sidan av Arabidopsis-bladen med en pincett. (A-D) Lämnar avbildade inom 5-15 minuter efter leverans. (E-H) Löv fotograferade 1 h efter leverans. (A,E) + Färgämne, + Fibrer. Kontroller: (B,F) -färgämne, -fibrer; (C,G) -färgämne, +fibrer; (D,H) + färgämne, -fibrer. (I-P) Metod på växten: 1 μL 10 μM fluoresceinfärgämne placerades på växtytan, flisor placerades så att de kom i kontakt med droppen och pincett användes för att knacka in chipet i den abaxiala sidan av Arabidopsis-bladen. (I-L) avbildad inom 5-15 minuter efter förlossning och (M-P) avbildad 1 timme efter förlossning. (I,M) + Färgämne, + Fibrer. Kontroller: (J,N) -färgämne, -fibrer; (K,O) -färgämne, + fibrer; (L,P) + färgämne, -fibrer. Panelerna A-P är enkla plana bilder från z-stackar. Skalstaplarna är 20 μm. Fibrer har en stigning på 35 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Tidsförlopp för tillförsel av färgämne i Arabidopsis via on-plant-metod med styvt substrat. Bilderna togs med hjälp av konfokalmikroskopi. Med hjälp av on-plant-metoden placerades 1 μL droppe fluoresceinfärgämneslösning (10 μM) på ytan av ett blad och VACNF-chipet placerades ovanpå droppen. Med hjälp av en pincett knackades chipet försiktigt in i vävnaden. +Färgämne, +Fiberbilder av samma område togs var 5:e minut. Skalstaplarna är 20 μm. Fibrer har en stigning på 35 μm. Paneler är enkla plana bilder från z-stackar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Tillförsel av färgämnen till jordgubbsfrukter med hjälp av VACNF-filmer. (A-H) Bilderna togs med hjälp av konfokalmikroskopi. Med hjälp av on-chip-metoden torkades färgdroppar på VACNF-filmer, som sedan rullades på fruktytor med hjälp av en sminkapplikator. Fluoresceinfärgämne (10 μM) tillfördes jordgubbsceller och avbildades efter (A) 10 min och (B) 1 timme. (C,D) Inga behandlingskontroller (-Färgämne, -Fibrer). (E,F) -Färgämne, +Fibrer kontrolleras efter 10 min respektive 1 timme. (G,H) + Färgämne, -Fibrer styr efter 10 min respektive 1 timme. Skalstaplarna är 40 μm. Panelerna A-H är maximala projektioner av 188 μm z-stackar. Fibrer har en stigning på 35 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: Färgtillförsel och transient omvandling av äpplen via VACNF-filmer. (A-F) Bilderna genererades med hjälp av konfokalmikroskopi. Med hjälp av on-chip-metoden torkades 1 μL droppar fluoresceinfärgämne (10 μM, B och D) eller 1 μL plasmid som kodar för pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) på VACNF-filmer, som sedan rullades på fruktytor med hjälp av en sminkapplikator. Fluoresceinfärgämnet tillfördes till äpplets epidermis och avbildades efter (B) 10 min och (D) 2 timmar. (D) Det tog lite tid för färgämnet att diffundera in i cellerna efter förlossningen. DNA-YFP-leverans och -uttryck via VACNF-filmer efter (F) 48 timmar. (A,C,E) inga behandlingskontroller (-Dye/DNA-YFP, -Fibrer). Skalstaplarna är 40 μm. Panelerna A-D är enkla plana bilder från z-stackar. Panelerna E och F är den maximala projektionen av 53 μm z-stackar. Fiberstigningen är 35 μm. Pilar betecknar fluorescein- eller YFP-signaler. * indikerar fibrer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 13: Övergående omvandling av Arabidopsis-blad med hjälp av VACNF-metoder på plantor eller på chip. (En-H) Bilderna togs med konfokalmikroskopi 48 timmar efter DNA-leverans. (A,C,E,G) Metod på planta: 1 μL plasmid som kodar för pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) placerades på den abaxiala sidan av Arabidopsis-bladen. Spånen placerades så att de kom i kontakt med droppen, och pincetter användes för att knacka in chipet i bladvävnaden. (B,D,F,H) On-chip-metod: 1 μL DNA−YFP (200 ng) torkades i 15 minuter på VACNF-chips och sedan knackades chipsen in i den abaxiala sidan av Arabidopsis-bladen med en pincett. +DNA-YFP, +Fibrer för (A) on-plant och (B) on-chip. Kontroller: (C,D) -DNA-YFP, + fibrer; (E,F) +DNA-YFP, -Fibrer; och (G,H)-DNA, −Fibrer. (I) Graf över relativ genomsnittlig fluorescenssignalintensitet på 25 20 × 20 μm områden från bilder av 5 biologiska replikat kombinerade från 2-3 experiment med fluorescens från YFP-kanalen. Områden som innehöll klyvöppningar (*) uteslöts på grund av autofluorescens. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten från -DNA-YFP, -Fibers subtraherades från varje medelvärde. 2−vägs ANOVA (och Tukey−test) användes för signifikanstestning, och felstaplar representerar medelvärdets standardfel. Olika bokstäver visar signifikanta skillnader mellan behandlingarna (P < 0,0001). Alla bilder som visas är maximala projektioner på 40 μm z−stackar. Skalstaplarna är 20 μm. Vita pilar indikerar fibrer i bilderna. Fiberstigningen är 35 μm. Denna figur har återgetts med tillstånd från Morgan et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 14: Övergående omvandling av lök med hjälp av VACNF-filmer. Bilderna togs med konfokalmikroskopi 48 timmar efter DNA-leverans. Med hjälp av on-chip-metoden torkades 1 μL plasmid-DNA-kodande pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) droppar på VACNF-filmer i10 minuter, som sedan rullades på växtorganytor. (A) DNA-YFP levererades till, och YFP uttrycktes i lökepidermis. (B) Ingen kontroll av behandlingen. (C) kontroll (+DNA-YFP, -Fibrer) och (D) kontroll (-DNA-YFP, +Fibrer). Skalstaplarna är 40 μm. Fibrer har en stigning på 35 μm. Bilderna är maximala projektioner på 115 μm z-stackar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 15: Vävnadsskada i sallad från applicering av VACNF-film . (A-D) Bilderna genererades med hjälp av konfokalmikroskopi. (A) On-chip-metoden användes för att leverera DNA till salladsblad via VACNF-filmer. pUBQ 10:YFP DNA (200 ng) droppar torkades i10 minuter på VACNF-filmer, som sedan rullades på den abaxiala sidan av lossnade salladsblad och förvarades i en fuktkammare i 4 dagar. (B) kontroll (-DNA-YFP, +Fibrer). (C) kontroll (+DNA-YFP, -Fibrer) och (D) ingen behandling (-DNA-YFP, -Fibrer). Skalstaplar är 40 μm. VACNF:er har en stigning på 35 μm. Pilar pekar på växtskador till följd av rullning av det flexibla substratet med för mycket kraft. Observera att framgångsrik VACNF-medierad DNA-leverans i sallad uppnåddes i andra experiment7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 16: Arbetsflöde för VACNF-medierad leverans i anläggningar. I steg I, kontrollera fibrernas geometri med SEM. För korrekt leverans behöver fibrer en spets med en diameter <200 nm. Om du använder fibrer på flexibelt substrat skulle nästa steg vara att bekräfta att fibrerna överförs till SU-8 och att kontrollera höjden på de exponerade fibrerna via SEM. I steg II testade vi fibrernas användbarhet genom att försöka leverera färg till den valda växten/organet med hjälp av ett styvt eller flexibelt substrat. Använd 1 μL droppe, placera den antingen på växtytan eller torka den kort på chipet/filmen. Med detta steg och alla andra steg är det absolut nödvändigt att använda rätt kontroller (-Färgämne, -Fibrer; -Färgämne, +Fibrer och +Färgämne,-Fibrer) för att vara säker på att signalen kommer från äkta färgtillförsel. I steg III, bekräfta att genen av intresse finns i plasmiden, bestäm koncentrationen av DNA som ska levereras och testa den optimala tiden efter förlossningen för att kontrollera uttrycket. I steg IV utvärderades utfallet med hjälp av konfokalmikroskopi för att kontrollera uttrycket av den levererade markören. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Morgan et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
I den här artikeln presenterade vi metoder för att konstruera vertikalt inriktade kolnanofibermatriser, överföra fibrerna till ett flexibelt substrat och applicera fibrer i antingen ett styvt eller flexibelt substrat på växter för användning vid leverans av biomolekyler eller färgämnen till växter. Vi beskrev två generella tillvägagångssätt, on-chip och on-plant metoder, för deponering av de introducerade materialen och visade framgångsrika resultat i fibrer på ett styvt substrat samt on-chip-metoden med VACNF-filmer. Tillämpningen av dessa fibrer är enklare i praktik och teori än traditionella växtomvandlingsmetoder (partikelbombardemang, protoplastomvandling via PEG eller elektroporering) och kan användas för växter som är motsträviga mot Agrobacterium-medierad transformation. Det är dock bara ett fåtal celler som omvandlas.
Vertikalt inriktade kolnanofibrer producerades vid Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences genom deras användarprogram. Användare kan ansöka om att använda denna anläggning för produktion av VACNF:er. Alternativt kan VACNF-chips produceras i renrum med likströmsplasmaförstärkta kemiska ångavsättningsmaskiner med en kolkälla22,23. Med de beskrivna metoderna finns det några steg som är avgörande för produktionen av fibrerna, fiberöverföringen och appliceringen av VACNF-chipsen/filmerna. För att fiberapplicering ska fungera måste fibrerna vara raka och ha en avsmalnande diameter på <200 nm vid spetsen för att leverans i växtceller ska lyckas 6,7 (figur 3). För att skapa kolnanofibrer av en viss storlek och tonhöjd finns det en mängd olika parametrar som kan ändras, inklusive punktstorlek, lateral stigning och mängden katalysator som deponeras. För att välja den optimala punktstorleken som ska användas för kolnanofiberproduktionen odlades fibrer från olika punktstorlekar (som visas i figur 5). Vi fann att 300 nm i diameter gav de bästa fibrerna, därför valdes denna punktstorlek (figur 5). Efter att ha hittat rätt parametrar tittade vi på att använda chips som har >50 % fibrer med den idealiska geometrin (rak och en spetsdiameter <200 nm). För att kontrollera fibrernas geometri använde vi svepelektronmikroskopi för att avbilda slumpmässiga synfält på ett prov av VACNF-chips/filmer.
Dessutom måste fibrerna ha en viss minimilängd för att uppnå leverans i växtceller. Vikten av att producera fibrer av olika längd är att längre fibrer kan användas för att tränga in i djupare vävnadslager. Längre fibrer (>40 μm långa) är viktiga för flexibla filmer eftersom fiberöverföringen fungerar genom att bryta fibrerna från basen och kräver att SU-8 läggs ovanpå fibrerna. Arbetstjockleken på SU-8-skiktet som används för detta protokoll är 20-35 μm. Den minsta höjd som krävs för att åstadkomma leverans i epidermis av olika växter (böjda eller platta) är 10-15 μm 6,7. Som ett resultat är fibrer med längder >40 μm nödvändiga för VACNF-filmer. Det finns flera olika parametrar att ta hänsyn till vid tillverkning av kolnanofibrer: katalysatormaterial, katalysatorgeometri, tjocklek på katalysatormaterial samt förhållanden i PECVD-kammaren (gasförhållande, tryck, temperatur, ström, duschmunstyckets höjd och tillväxttid)8,9,24,25. För att producera kolnanofibrer längre än 25 μm som används av Morgan et al.7 och Davern et al.6, ökade vi mängden Ni-katalysator, ändrade förhållandet mellan acetylen och ammoniak och ökade strömmen och tillväxttiden. Dessutom ägnade vi mer uppmärksamhet åt katalysatormaterialets geometri. För att producera höga raka fibrer behövde den deponerade katalysatorn ha en hockeypuckform snarare än en form som liknar en vulkan (figur 4). Vulkanstrukturer uppstår från rester av fotoresist efter start. För att förhindra bildandet av vulkaner användes ett dubbelt lager av PMMA för att skapa en underskärning under elektronstrålelitografi26. Underskärningen hjälper till att lyfta av den avsatta metallkatalysatorn (figur 2). Katalysatorns tjocka skikt är viktigt för tillväxten av höga VACNF:er. Morfologin hos VACNF:erna har undersökts av Merkulova et al.24. Den vertikala inriktningen av VACNF:er beror på både tillväxten av Ni-katalysatorspetsens typ och inriktningen av DC-potentialen vinkelrätt mot substratet (figur 6). Duschhuvudet beskriver geometrin hos PECVD-reaktorn (figur 6) och fungerar som källa för potentialen för det elektriska fältet27.
För att definiera matrisen av katalysatorprickar med elektronstrålelitografi applicerade vi ett elektronstrålemotstånd (polymetylmetakrylat) och använde sedan e-strålen för att göra små hål i resisten med en specifik form och på specifika platser på skivan. Hål med önskad diameter placerades på ett vanligt rutnät med det definierade avståndet (stigning) och en fil som specificerade det önskade mönstret laddades in i elektronstrålelitografiverktyget innan substratet laddades in i maskinen. Förutom fiberhöjden är en annan kritisk parameter för framgångsrik fiberöverföring den tid som spenderas i acetonbadet. VACNF-filmerna måste lämnas i acetonbadet tillräckligt länge för att deras kanter ska börja krulla; Om de lämnas i acetonbadet för kort tid är de svårare att lyfta bort från chipsen och kan gå sönder. Ju äldre chipsen är, desto längre måste de ligga kvar i acetonbadet. Efter acetonbadet placerades filmerna/chipsen i isopropanol och vatten för att avlägsna aceton samt för att ta bort den skyddande fotoresisten på fibrerna.
För att utföra spinnbeläggning placeras wafers eller waferbitar på en vakuumchuck i spinncoatern, och skivans centrala position verifieras med hjälp av spinnbestrykarens testfunktion. En liten pöl (~2.5 cm i diameter) av resist appliceras på mitten av skivan och snurras (3000 rpm i 45 s) Bilder av fibrerna före och efter spinnbeläggning ingår i figur 8 som visar bevarandet av fibergeometri (höjd, orientering och stigning). Närvaron av fibrer gör att resist väller upp vid basen av fibrerna och resulterar i tjockare lager än förväntat. Spin-beläggning efter VACNF-tillväxt har undersökts av andra grupper11,18.
Ett annat steg i processen som är av avgörande betydelse är att se till att rätt mängd kraft appliceras på VACNF-chips/filmer. Leveransmekanismen är beroende av att fibrerna gör små punkteringar i cellväggarna via pincettens impulskraft, knackar på styva substrat 6,7 eller rullar med mini-makeup-applikatorn på flexibla substrat. Fibrer kan brytas av och förbli inbäddade i växtceller6,7 utan att det påverkar resultatet, men övning i samband med undersökning av färgupptag och vävnadsskador är nödvändig för att få rätt tryck. Dessutom är det viktigt att välja lämpliga avbildningstidpunkter efter DNA-leverans med VACNF-chips/filmer eftersom tiden till detekterbart uttryck varierar mellan växtarter och de typer av vektorer som levereras7 (figur 16).
Även om denna metod är allmänt tillämplig på växter har den några begränsningar. Att till exempel lägga till ett tunt lager kiseloxid till VACNF-filmerna resulterar inte alltid i att filmerna blir helt hydrofila på grund av det skyddande skiktet av fotoresist som läggs ovanpå SU-8. Om detta problem uppstår kan tjockare lager av kiseloxid appliceras på VACNF:er. För att testa om filmerna är hydrofoba eller hydrofila kan de placeras i vatten. Om filmerna sjunker är de hydrofila, och om de flyter är de hydrofoba. Dessutom kan det finnas variation mellan partier av fibrer som produceras. Det finns flera parametrar som kan ändras när fibrerna odlas i dc-PECVD-maskinen; det som beskrivs i detta protokoll är en uppsättning parametrar för två olika mängder Ni-katalysator. Dessutom kan kristallorienteringen av Ni-katalysatorn inte kontrolleras28 och viss förgrening kommer oundvikligen att resultera i fibrerna.
Även om vi demonstrerade leveransen av fluoresceinfärgämne och DNA till växtceller med hjälp av både styva och flexibla substrat för denna artikel, bör metoden vara allmänt tillämplig för andra biomolekyler och genetiska modifieringsmetoder, till exempel RNAi-avstängning för växtsystem som äpplen eller andra frukter där det skulle ta år att producera stabila transgena linjer. Dessutom kan dessa fibrer också användas för att leverera genetiska redigeringsmaterial eller för stabila transformationer i växter.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Nanofibermatriser tillverkades vid Center for Nanophase Materials Sciences, som är en Department of Energy Office of Science User Facility (Proposal ID: CNMS2019-103 och CNMS2022-A-1182). Stöd från CNMS beviljas genom ett expertgranskat förslagssystem och tillhandahålls utan kostnad till framgångsrika sökande som avser att publicera sina resultat (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Vi tackar Kevin Lester och CNMS för hjälp med produktionen av nanofiberarrayer. Vi tackar Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs och Travis Bee för kritiska diskussioner om experimentell design. Vi tackar Dr. Adam Rondinone för schemat av PECVD-maskinen. Vi tackar Leslie Carol för de vetenskapliga illustrationerna. Detta arbete finansierades av Bioimaging Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 och United States Department of Agriculture, 2021-67013-34835. JMM stöddes av United States Department of Agriculture: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
References
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
- Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
- Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).
- Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
- Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).
- Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).
- Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).
- Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).
- Nelson-Fitzpatrick, N. Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).
- Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
- Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A.
- Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).
- Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527 (2011).
- Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
- Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008 (2019).
- Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
- Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crafts, A. S.
- Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
- Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
- Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).
- Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
- Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
- Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
- Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
- Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).
