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Bioengineering

पौधों को बायोमोलेक्यूल्स और रंगों के वितरण के लिए कठोर या लचीले सब्सट्रेट्स पर लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर सरणियों का उपयोग करना

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65602
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 3, 3,5, 6, 5, 2
1Biophysical Sciences, The University of Chicago, 2Molecular Genetics and Cell Biology, The University of Chicago, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 4Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 5Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 6Department of Chemistry, East Tennessee State University

Summary

यहां हम लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर (वीएसीएनएफ) को माइक्रोफैब्रिकेशन करने, वीएसीएनएफ को लचीले सब्सट्रेट्स में स्थानांतरित करने और बायोमोलेक्यूल और डाई डिलीवरी के लिए पौधों को कठोर और लचीले सब्सट्रेट दोनों पर वीएसीएनएफ लागू करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।

Abstract

बरकरार पौधों को बायोमोलेक्यूल्स और अभेद्य रंगों का वितरण एक बड़ी चुनौती है। नैनोमटेरियल्स पौधों को डीएनए के वितरण के लिए अप-एंड-आने वाले उपकरण हैं। इन नए उपकरणों के रूप में रोमांचक हैं, उन्हें अभी तक व्यापक रूप से लागू किया जाना बाकी है। कठोर सब्सट्रेट (बैकिंग) पर निर्मित नैनोमटेरियल्स विशेष रूप से घुमावदार पौधों की संरचनाओं पर सफलतापूर्वक लागू करना मुश्किल है। यह अध्ययन लंबवत रूप से संरेखित कार्बन नैनोफाइबर सरणियों को माइक्रोफैब्रिकेशन करने और उन्हें कठोर से एक लचीले सब्सट्रेट में स्थानांतरित करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। हम विस्तार से बताते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि इन तंतुओं (या तो कठोर या लचीले सब्सट्रेट्स पर) का उपयोग पौधों को क्षणिक परिवर्तन या डाई (जैसे, फ्लोरेसिन) वितरण के लिए कैसे किया जा सकता है। हम दिखाते हैं कि लचीले वीएसीएनएफ सरणियों को बनाने के लिए कठोर सिलिकॉन सब्सट्रेट से एक लचीले एसयू -8 एपॉक्सी सब्सट्रेट में कैसे वीएसीएनएफ स्थानांतरित किया जा सकता है। एसयू -8 की हाइड्रोफोबिक प्रकृति को दूर करने के लिए, लचीली फिल्म में फाइबर को एक पतली सिलिकॉन ऑक्साइड परत (2-3 एनएम) के साथ लेपित किया गया था। घुमावदार पौधों के अंगों को वितरण के लिए इन तंतुओं का उपयोग करने के लिए, हम वीएसीएनएफ फिल्मों के फाइबर साइड पर डाई या डीएनए समाधान की 1 μL बूंद जमा करते हैं, 10 मिनट प्रतीक्षा करते हैं, फिल्मों को पौधे के अंग पर रखते हैं और पौधों की कोशिकाओं में फाइबर को चलाने के लिए रोलिंग गति के साथ एक स्वैब का उपयोग करते हैं। इस विधि के साथ, हमने घुमावदार सतहों वाले पौधों के अंगों में डाई और डीएनए वितरण हासिल किया है।

Introduction

पौधे परिवर्तन (क्षणिक और स्थिर दोनों) अभी तक सभी पौधों के ऊतकों और प्रजातियों में व्यापक रूप से प्राप्त करने योग्य नहीं हुआ है। पौधों का क्षणिक परिवर्तन एक ऐसी प्रक्रिया है जिसके द्वारा प्लास्मिड में एन्कोड किए गए जीन अस्थायी रूप से पौधों में पेश किए जाते हैं लेकिन जीनोम में स्थिर रूप से शामिल नहीं होते हैं। पारंपरिक तरीके जो कण बमबारी, एग्रोबैक्टीरिया, इलेक्ट्रोपोरेशन या प्रोटोप्लास्ट के पॉलीथीन ग्लाइकॉल उपचार का उपयोग करते हैं, धीमे हैं या बोझिल हो सकते हैं। इसके अलावा, वे हर पौधे की प्रजाति 1,2,3,4 पर लागू नहीं होते हैं। डीएनए वितरण के लिए नैनोमटेरियल्स का उपयोग एक तेजी से बढ़ता क्षेत्र है जो अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था मेंहै। नैनोमटेरियल्स, विशेष रूप से कार्बन नैनोफाइबर का उपयोगघाव प्रतिक्रिया के बिना पौधे की पत्तियों को प्रोटीन, डेक्सट्रान और रंजक देने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इस काम का लक्ष्य पौधों को बायोमोलेक्यूल्स या रंजक देने के लिए एक प्रकार के नैनोमटेरियल, कार्बन नैनोफाइबर का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है। यहां, हम पसंद के बायोमोलेक्यूल के रूप में डीएनए पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो विभिन्न पौधों के अंगों में कोशिकाओं के क्षणिक परिवर्तन की अनुमति देता है।

इससे पहले, मॉर्गन एट अल.7 ने कठोर सिलिकॉन सब्सट्रेट से चिपके कार्बन नैनोफाइबर के उपयोग का प्रदर्शन किया ताकि सलाद, एन बेंथामियाना और चिनार की पत्तियों और एराबिडोप्सिस की पत्तियों और जड़ों को क्षणिक रूप से बदल दिया जा सके। यद्यपि विभिन्न अंगों पर परिवर्तन सफल थे, फाइबर को घुमावदार सतहों, जैसे कि जड़ों या फलों के साथ पौधे के ऊतकों पर लागू करना अधिक कठिन था। हमने तर्क दिया कि नैनोफाइबर के लिए एक लचीला समर्थन अंग के आकार के बेहतर अनुरूप होकर वितरण की उनकी दक्षता में सुधार कर सकता है।

यहां, हम लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर को बनाने और डिजाइन करने, वीएसीएनएफ को लचीले सब्सट्रेट्स में स्थानांतरित करने और बायोमोलेक्यूल्स और रंगों को वितरित करने के लिए पौधों को कठोर और लचीले सब्सट्रेटदोनों पर वीएसीएनएफ लागू करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का विवरण देते हैं। कार्बन नैनोफाइबर का उत्पादन नी उत्प्रेरक के साथ प्रत्यक्ष वर्तमान उत्प्रेरक प्लाज्मा-संवर्धित रासायनिक वाष्प जमाव (डीसी सी-पीईसीवीडी) का उपयोग करके किया गया था। नी उत्प्रेरक डॉट्स की स्थिति, व्यास और ऊंचाई को इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी, धातु वाष्पीकरण और लिफ्ट-ऑफ प्रक्रियाओं के संयोजन का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था जैसा कि मेलेको एट अल.8,9 द्वारा वर्णित है। डबल-लेयर ई-बीम प्रतिरोध का उपयोग करके, लंबे फाइबर10 देने के लिए सब्सट्रेट पर एक मोटा नी उत्प्रेरक जमा किया जा सकता है। एक कठोर से एक लचीले सब्सट्रेट में फाइबर स्थानांतरण फ्लेचर एट अल .11 में वर्णित विधियों के संशोधन पर आधारित है, जिसमें वर्तमान तरीकों में एक अनाकार कार्बन परत या एक बलिदान फोटोरेसिस्ट परत के उपयोग को छोड़ दिया गया है। फाइबर ट्रांसफर के साथ एसयू -8 लिफ्ट-ऑफ एसयू -8 12,13,14 को अंडरबेकिंग और अंडरएक्सपोज़िंग से उत्पन्न आंतरिक तन्यता तनाव का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। एसयू -8, एक जटिल बहुलक, स्वाभाविक रूप से हाइड्रोफोबिक है, जो डीएनए वितरण की सुविधा के लिए इसका उपयोग मुश्किल बनाता है। एसयू -8 की हाइड्रोफोबिक प्रकृति का मुकाबला करने के लिए, हम एसयू -8 में फाइबर एम्बेडेड होने के15 बाद परमाणु परत जमाव के माध्यम से सिलिकॉन ऑक्साइड की एक पतली परत लागू करते हैं। डाई डिलीवरी के लिए एक कठोर सब्सट्रेट पर फाइबर का अनुप्रयोग डेवर्न एट अल.6 में वर्णित चिमटी टैपिंग के प्रभाव बल और मॉर्गन एट अल.7 में वर्णित ऑन-प्लांट और ऑन-चिप विधियों का उपयोग करता है। लचीली वीएसीएनएफ फिल्मों को मॉर्गन एट अल.7से ऑन-चिप विधि के साथ फिल्म पर डीएनए या डाई बूंदों को अर्ध-सुखाकर घुमावदार पौधों की सतहों पर लागू किया जाता है और फिर एक छोटे मेकअप एप्लिकेटर16,17 का उपयोग करके घुमावदार पौधों की सतहों पर फिल्मों को रोल किया जाता है। चित्रा 1 पौधों को कठोर और लचीले सब्सट्रेट्स में फाइबर लागू करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों को दर्शाता है।

Protocol

1. VACNFs उत्पादन (चित्रा 2 और चित्रा 3)

  1. पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए) 495 ए 4 के साथ एक सिलिकॉन वेफर स्पिनकोट 4000 आरपीएम पर प्रतिरोध करता है और इसे 5 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर बेक करता है।
    नोट: अगले चरण में जाने से पहले वेफर को 10 सेकंड के लिए ठंडा होने दें।
  2. प्रतिरोध की एक दूसरी परत (पीएमएमए 950 ए 2) को स्पिनकोट करें और इसे 5 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  3. 3 मिमी x 3 मिमी सरणियों में एक निर्दिष्ट पार्श्व रिक्ति (पिच: 10 μm, या 35 μm) पर 300 nm के व्यास के साथ उत्प्रेरक बिंदुओं को परिभाषित करने के लिए इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग करें।
  4. 1: 3 मिथाइल-आइसोब्यूटिल कीटोन के 30-40 एमएल में प्रतिरोध विकसित करें: 1.5 मिनट के लिए आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए), इसके बाद इसे आईपीए के साथ धोएं और इसे एन2 के साथ सुखाएं।
    नोट: एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप (20x उद्देश्य) का उपयोग करके डॉट्स की सरणी की जांच करें।
  5. सिलिकॉन आदि में ऑक्सीजन प्लाज्मा (डेस्कम) में 6 एस एक्सपोजर के साथ अवशिष्ट प्रतिरोध के वेफर को साफ करें।
  6. पहले धातु की एक चिपकने वाली परत (टीआई या सीआर, 10 एनएम) जमा करने के लिए इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण का उपयोग करें और फिर एक दूसरी परत जमा करें, जो नी उत्प्रेरक (130 एनएम या 150 एनएम) है। टीआई या नी धातु के जमाव के दौरान, धारा को 10 केवी पर 0.2 ए से नीचे रखें, दबाव 5 x 10-6 टॉर से नीचे रखें, और लाइन-ऑफ-साइट जमाव के लिए जमाव दर ~ 1 ए / एस पर रखें।
  7. अंतर्निहित प्रतिरोध परत पर जमा धातु (नी) को हटाने के लिए अनुक्रमिक स्नान सोनिकेशन का उपयोग करें, जिससे नी सीधे सिलिकॉन वेफर पर जमा हो जाता है। इस प्रक्रिया को लिफ्ट-ऑफ कहा जाता है।
    1. इसके लिए, एसीटोन के साथ 3 कंटेनर तैयार करें और 1 मिनट के लिए एसीटोन में वेफर को स्नान करें; 35 kHz की आवृत्ति पर कमरे के तापमान (RT, 20 °C) पर 3 बार दोहराएं। आईपीए के साथ कुल्ला करें और एन2 के साथ सूखा लें।
      नोट: वेफर पर एसीटोन को कभी सूखने न दें। अंतिम एसीटोन सोनिकेशन के बाद, तुरंत आईपीए से कुल्ला करें और फिर एन2 गैस से सुखाएं। यदि किसी भी बिंदु पर वेफर समय से पहले सूख जाता है (आईपीए कुल्ला करने से पहले) तो संभावना है कि सभी अतिरिक्त धातु और प्रतिरोध को हटाया नहीं जाएगा और एसीटोन एक अवशेष छोड़ सकता है।
  8. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके उत्प्रेरक आकार की ज्यामिति की जांच करें। वीएसीएनएफ चिप्स की एसईएम छवियों को कैप्चर करने के लिए, मंच को 30 डिग्री कोण पर झुकाएं और ~ 100 पीए की बीम धारा और ~ 5 मिमी कामकाजी दूरी के साथ 1-3 केवी के वोल्टेज का उपयोग करें।
    नोट: उत्प्रेरक को हॉकी पुक (एक कॉम्पैक्ट सिलेंडर) की तरह दिखना चाहिए (चित्रा 4)। कॉम्पैक्ट सिलेंडर की ऊंचाई सिलिकॉन वेफर पर जमा नी की मोटाई को प्रतिबिंबित करना चाहिए। यदि नी डॉट की प्रोफ़ाइल लंबी है और ज्वालामुखी (चित्रा 4) के समान शीर्ष पर अवतल प्रतीत होती है, तो उत्प्रेरक के कई नी बूंदों में डूबने की अधिक संभावना है जिसके परिणामस्वरूप कार्बन नैनोफाइबर9 (चित्रा 4 और चित्रा 5) की शाखाएं होती हैं। इस तरह की समस्याएं लंबे जमाव समय या लिफ्ट-ऑफ प्रक्रिया के साथ मुद्दों के कारण धातु वाष्पीकरण के दौरान पिघलने का विरोध कर सकती हैं (चित्रा 4 और चित्रा 5)।
  9. सिलिकॉन वेफर को चौथाई करें और इसे एसिटिलीन / अमोनिया मिश्रण के साथ प्रत्यक्ष वर्तमान प्लाज्मा वर्धित रासायनिक वाष्प जमाव कक्ष (डीसी-पीईसीवीडी) में रखें। नैनोफाइबर की लंबाई और टेपर को नियंत्रित करने के लिए विकास मापदंडों को अनुकूलित करें (टिप्स <200 एनएम)।
    1. 1-1.5 ए की धारा और 440-560 वी की वोल्टेज रेंज का उपयोग करें। फाइबर बढ़ते समय, अमोनिया प्रवाह के साथ पूर्व-उपचार चरण का उपयोग करें जबकि मशीन और सब्सट्रेट 620 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होते हैं। प्लाज्मा शुरू करने से 10 सेकंड पहले कार्बन स्रोत (एसिटिलीन) को चालू करना सुनिश्चित करें।
      नोट: क्वार्टर वेफर्स का उपयोग तब किया जाता है जब पीईसीवीडी मशीन रन पैरामीटर को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। 40 μm से अधिक लंबाई और व्यास में 200 nm से कम युक्तियों वाले फाइबर का उत्पादन करने के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का सुझाव दिया जाता है: 130 nm की Ni उत्प्रेरक मोटाई के साथ, 1.75 A की धारा का उपयोग करें, 70 मिनट का विकास समय, और एसिटिलीन: अमोनिया अनुपात 45 मानक घन सेंटीमीटर प्रति मिनट (एससीसीएम) : 100 एससीसीएम। 150 एनएम की नी मोटाई के साथ, 1.5 ए की धारा, 80 मिनट का विकास समय, और 48 एससीसीएम: 100 एससीसीएम के एसिटिलीन: अमोनिया अनुपात का उपयोग करें। उत्प्रेरक मोटाई की परवाह किए बिना VACNFs को विकसित करने के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 620 डिग्री सेल्सियस का विकास तापमान, प्लाज्मा के दौरान 10 टन का दबाव, और 20 मिमी की शॉवर सिर की ऊंचाई (चित्रा 6)।
  10. 1 केवी की त्वरण क्षमता के साथ 30 ° झुकाव पर एसईएम का उपयोग करके परिणामी तंतुओं की ज्यामिति का आकलन करें।
    नोट: इष्टतम फाइबर सीधे और गैर-शाखाहोंगे। इलेक्ट्रॉन बीम बाष्पीकरणकर्ता के साथ नी उत्प्रेरक के क्रिस्टल अभिविन्यास को नियंत्रित करना असंभव है। नतीजतन, उत्प्रेरक डीवेटिंग9 के कारण कुछ फाइबर होंगे जो शाखा करेंगे। इसके अलावा, क्रिस्टल अभिविन्यास के कारण वीएसीएनएफ अलग-अलग ऊंचाइयों तक बढ़ते हैं, इसलिए सभी वीएसीएनएफ पर समान ऊंचाई मुश्किल है।
  11. 45 सेकंड के लिए 1000 आरपीएम पर फाइबर पर फोटोरेसिस्ट (एसपीआर 955) की एक परत को स्पिनकोट करें। फिर 1/4 वेफर को डाइकिंग आरी का उपयोग करके 3 मिमी x 3 मिमी सरणियों में डाइस करें। फाइबर को बाद में उपयोग के लिए इस बिंदु पर स्टोर करें।
    नोट: यदि फाइबर को एक लचीले सब्सट्रेट में स्थानांतरित करने की योजना बना रहे हैं तो चरण 1.11 का संचालन न करें।

2. एकलचीले सब्सट्रेट (चित्रा 7 और चित्रा 8) के लिए वीएसीएनएफ को रैनफेर करना।

  1. फाइबर संश्लेषित होने के बाद, स्पिनकोट एसयू -8 2015 45 सेकंड के लिए 4000 आरपीएम पर वेफर्स या क्वार्टर वेफर्स पर फोटोरेसिस्ट करता है।
  2. वेफर को 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए नरम बेक करें।
  3. एक संपर्क संरेखक का उपयोग करके, वेफर को 3 मिमी 3 मिमी सरणी पैटर्न वाले मास्क के साथ उजागर करें जो 95 एमजे / सेमी2 पर इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी से परिभाषित पैटर्न के साथ संरेखित होता है।
    नोट: एक्सपोजर गैप के साथ एक निकटता संपर्क मोड का उपयोग करें जो सबसे ऊंचे फाइबर से 20 μm अधिक है। संभावना है कि प्रक्रिया में इस चरण के दौरान तंतुओं को खटखटाया जा सकता है।
  4. 95 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए पोस्ट-एक्सपोज़र बेक करें।
  5. 15 सेकंड के लिए एसयू -8 डेवलपर में वेफर विकसित करें, इसे आईपीए के साथ कुल्ला करें, और ऊपर से नीचे की ओर जाते हुए एन2 के साथ वेफर को सुखाएं।
    नोट: वेफर विकसित करते समय, सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से जलमग्न है।
  6. स्पिनकोट पैटर्न वाले वेफर्स 45 सेकंड के लिए 3000 आरपीएम पर पतली फोटोरेसिस्ट (एसपीआर 955 सेमी 0.7) की सुरक्षात्मक परत के साथ और 90 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए सॉफ्टबेक करते हैं।
  7. 100 डिग्री सेल्सियस पर 22 चक्रों के लिए परमाणु परत के जमाव में रखकर वेफर (2-3 एनएम) में एक पतली सिलिकॉन ऑक्साइड परत जमा करें।
  8. वेफर को 3 मिमी x 3 मिमी वर्गों में काटने के लिए डाइकिंग आरी का उपयोग करें। डाइकिंग को वेफर पर पहले से मौजूद पैटर्न के साथ संरेखित करें।
  9. 3 केवी की त्वरण क्षमता के साथ 30 ° झुकाव पर एसईएम का उपयोग करके परिणामी तंतुओं की ज्यामिति का आकलन करें।
  10. लंबे समय तक उपयोग के लिए चिप्स संग्रहीत करने पर यहां रुकें (> 1 सप्ताह)। चिप्स को अंधेरे में स्टोर करें।
  11. कठोर सब्सट्रेट्स से लचीले सब्सट्रेट्स को अलग करने के लिए, अलग-अलग चिप्स को एसीटोन में 30 मिनट के लिए रखें या जब तक एसयू -8 कर्ल न होने लगे।
  12. एसयू -8 फिल्मों (या तो कठोर सब्सट्रेट्स से जुड़े या अलग) को आईपीए के साथ 5 मिनट के लिए धोएं और फिर 5 मिनट के लिए पानी के साथ। चिप्स को परिवहन करते समय चिपचिप्स को चिपचिपे पैड के साथ एक वाणिज्यिक बॉक्स में रखें।
  13. वैकल्पिक: एसयू -8 फिल्म के फाइबररहित पक्ष को पानी में घुलनशील टेप पर या पतली पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट (पीईटी) (12.5 μm मोटी) समर्थन के साथ पतली सिलिकॉन रबर के शीर्ष पर रखें।
    1. एसयू -8 फिल्म को स्थानांतरित करने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें। सिलिकॉन रबर-पीईटी से चिपके रहने में मदद करने के लिए एसयू -8 वर्ग के किनारों पर दबाएं; यह तंतुओं को तोड़ने से बचने के लिए है। इस बिंदु पर, वीएसीएनएफ फिल्में तत्काल उपयोग के लिए तैयार हैं।
    2. पीईटी धारक तैयार करने के लिए, निम्नलिखित कार्य करें: सिलिकॉन रबर के लिए 2-भाग किट का उपयोग करके, दो भागों को एक साथ मिलाएं (इलास्टोमेर और क्रॉसलिंकर)। इसके बाद, पीईटी के एक वर्ग को काट लें और इसे एक स्पष्ट प्लास्टिक डिश में टेप करें। पीईटी के शीर्ष पर सिलिकॉन रबर की एक बहुत पतली परत डालें और इसे 1-2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।

3. एक कठोर सब्सट्रेट (चित्रा 1 ए) में फाइबर का उपयोग करके ऑन-प्लांट विधि (जहां वितरित करने के लिए समाधान की एक बूंद पौधे की सतह पर रखी जाती है)।

  1. उपयोग से पहले एसीटोन (100%, 5 मिनट), आईपीए (100%, 5 मिनट), और डीडीएच2ओ (5 मिनट) के इंक्रीमेंट वॉश के साथ फोटोरेसिस्ट को हटा दें।
  2. समर्थन के लिए पौधे के ऊतकों को कठोर सतह पर रखने के लिए रखें।
  3. पौधे के ऊतकों की सतह पर डाई या डीएनए (200 एनजी) की 1 μL बूंद रखें।
  4. बूंद के शीर्ष पर एक कठोर सब्सट्रेट के साथ एक वीएसीएनएफ चिप रखें, फाइबर उन्मुख इस तरह से कि वे बूंद के संपर्क में आएंगे।
    नोट: चिप्स का अभिविन्यास वेफर की "चमक" द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। चिप के चमकदार पक्ष में फाइबर होते हैं, और अपारदर्शी पक्ष नहीं होता है।
  5. चिमटी की एक जोड़ी के सपाट पक्ष का उपयोग करके, चिप को टैप करें। पौधे के उस क्षेत्र को चिह्नित करें जिसके संपर्क में चिप एक नरम-टिंप मार्कर का उपयोग करके आया था। डिलीवरी के बाद VACNF चिप्स को हटा दें।
    नोट: टैपिंग करते समय लागू बल की मात्रा उपयोग किए गए पौधे के ऊतकों के प्रकार के आधार पर भिन्न होगी। फाइबर के प्रत्यारोपण का संचालन करने से पहले चिप्स टैप करने का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है। पौधे के ऊतकों को नुकसान से बचें। क्षति स्पष्ट है जब कोई पौधे के ऊतकों में वीएसीएनएफ चिप की रूपरेखा देख सकता है।
  6. नियंत्रण के लिए चरण 3.1-3.5 दोहराएं (+ डाई / डीएनए, -फाइबर; -डाई / डीएनए, + फाइबर; और -डाई / डीएनए, -फाइबर)। -फाइबर एक चिप का फाइबररहित पक्ष है।
  7. यदि आवश्यक हो तो लंबे समय तक चलने वाली स्थितियों (16 घंटे प्रकाश, 8 घंटे अंधेरे) में आर्द्र कक्षों में बरकरार पौधों या उत्पादित पौधों के अंगों को स्टोर करें। उत्पादित अंगों के लिए, गीले पेपर तौलिए के साथ एक प्लास्टिक पेट्री डिश का उपयोग करें।

4. ऑन-चिप विधि (जहां वितरित करने के लिए समाधान की एक बूंद को वीएसीएनएफ चिप पर रखा जाता है), कठोर सब्सट्रेट (चित्रा 1 बी)।

  1. उपयोग से पहले एसीटोन (100%, 5 मिनट), आईपीए (100%, 5 मिनट), और डीडीएच2ओ (5 मिनट) के इंक्रीमेंट वॉश के साथ फोटोरेसिस्ट को हटा दें।
  2. कठोर सब्सट्रेट के साथ वीएसीएनएफ चिप के फाइबर साइड पर डाई या प्लास्मिड डीएनए (200 एनजी) की 1 μL बूंद डालें। चिप के केंद्र में बूंद रखना सुनिश्चित करें और कई फाइबर को कवर करें। बूंद को 15 मिनट के लिए सूखने दें।
    नोट: चिप्स का अभिविन्यास वेफर की "चमक" द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। चिप के चमकदार पक्ष में फाइबर होते हैं, और अपारदर्शी पक्ष नहीं होता है।
  3. पत्तियों या अन्य उत्पादित अंगों के साथ काम करते समय, उन्हें एक कठोर सतह के ऊपर रखें। बरकरार पौधों के साथ काम करते समय, उस अंग के नीचे एक कठोर सतह रखें जिस पर वीएसीएनएफ लागू होते हैं।
  4. 15 मिनट सुखाने के चरण के बाद, वीएसीएनएफ चिप को इस तरह रखें कि फाइबर साइड पौधे के ऊतकों के संपर्क में आए। चिमटी की एक जोड़ी के पीछे के छोर के साथ चिप को टैप करें।
    नोट: टैपिंग करते समय लागू बल की मात्रा उपयोग किए गए पौधे के ऊतकों के प्रकार के आधार पर भिन्न होगी। चिप्स टैप करने का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है।
  5. ऑन-प्लांट विधि के चरण 3.6-3.7 को दोहराएं।

5. ऑन-चिप विधि (चित्रा 1 सी) का उपयोग करके पौधे के ऊतकों के लिए एसयू -8 फिल्मों में वीएसीएनएफ लागू करना।

  1. एसयू -8 फिल्म के फाइबर साइड पर डाई या डीएनए (200 एनजी) की 1 μL बूंद रखें और इसे 10 मिनट के लिए सूखने दें। चिप के केंद्र में बूंद रखना सुनिश्चित करें।
    नोट: उपयोग किए गए सब्सट्रेट के आधार पर अलग-अलग सुखाने का समय है।
  2. तेज चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके, पौधे की सतह पर वीएसीएनएफ फिल्म रखें।
    नोट: एसयू -8 फिल्मों को जितनी देर तक हवा में छोड़ दिया जाता है, फिल्में उतनी ही भंगुर हो जाती हैं। एसयू -8 फिल्मों को खोने के जोखिम को सीमित करने के लिए, एसयू -8 फिल्मों के पास सभी पौधों / नमूने और उपकरण रखना सुनिश्चित करें।
  3. धीरे से वीएसीएनएफ फिल्म के ऊपर एक छोटा मेकअप एप्लिकेटर रोल करें। उन क्षेत्रों को चिह्नित करें जहां लचीले सब्सट्रेट्स को नरम-टिंप मार्कर के साथ रखा गया है। टेप का उपयोग करके पौधे की सतह से लचीले सब्सट्रेट ्स को हटा दें।
    नोट: मेकअप एप्लिकेटर को रोल करते समय लागू बल की मात्रा उपयोग किए गए पौधे के ऊतकों के बीच भिन्न होगी। बायोमोलेक्यूल या डाई डिलीवरी आयोजित करने से पहले वीएसीएनएफ फिल्मों को लागू करने का अभ्यास करें। पौधे के ऊतकों को दिखाई देने वाली क्षति स्पष्ट है जब कोई पौधे के ऊतकों में वीएसीएनएफ फिल्म की रूपरेखा देख सकता है।
  4. ऑन-प्लांट विधि के चरण 3.7 में उल्लिखित पौधों को नियंत्रित और संग्रहीत करने के लिए चरण 5.1-5.3 दोहराएं।

6. सभी वितरण विधियों के लिए माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण

  1. वितरित फ्लोरोसेंट जांच / रिपोर्टर के लिए उपयुक्त उत्सर्जन और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नमूनों की छवि बनाएं।
    नोट: क्षणिक परिवर्तन के लिए आवश्यक समय पौधों की प्रजातियों और वितरित मार्कर के साथ भिन्न होता है। उदाहरण के लिए, एराबिडोप्सिस में 48 घंटे के बाद फ्लोरोसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था जबकि सलाद पत्ते7 में 96 घंटे था।
  2. इमेजिंग करते समय, अलग फाइबर वाले क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने का प्रयास करें। तंतुओं के अलग-अलग झुकाव होंगे। प्रसव की सफलता टूटे हुए तंतुओं की उपस्थिति पर निर्भर नहीं है।
    नोट: पीईसीवीडी18 में फाइबर गठन के परिणामस्वरूप सिलिकॉन नाइट्राइड परत के गठन के कारण फाइबर सबसे आम उत्तेजना / उत्सर्जन सेटिंग्स के साथ फ्लोरोसेंट होंगे।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम 5 छवियों को कैप्चर करें। परिणामी संकेत अलग-अलग होंगे।
  4. इमेजजे19 का उपयोग करके 20 μm x 20 μm confocal छवि क्षेत्रों 7 में कुल प्रतिदीप्ति (एकीकृत घनत्व) के रूप में प्रतिदीप्ति मूल्यों को मापें।

Representative Results

कठोर या लचीले सब्सट्रेट्स पर वीएसीएनएफ चिप्स का विशिष्ट लाभ एक पौधे पर विशिष्ट स्थानों पर बायोमोलेक्यूल्स या रंजक पहुंचाने की क्षमता है (चित्रा 1)। यहां, हमने डिलीवरी का आकलन करने के लिए फ्लोरेसेंस रीडआउट का उपयोग किया। विभिन्न पौधों, सब्सट्रेट्स और वितरण विधियों (ऑन-चिप या ऑन-प्लांट) का उपयोग करके, डाई फ्लोरेसिन की उपस्थिति के समय में अंतर हो सकता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वीएसीएनएफ चिप्स / फिल्में डिलीवरी के लिए काम करती हैं, डाई डिलीवरी के लिए फाइबर का उपयोग करना एक तेज़ दृष्टिकोण है (चित्रा 9)। चित्रा 9 में अलग-अलग समय के साथ लेबल की गई छवियां एक ही नमूने से दृश्य के विभिन्न क्षेत्र हैं। ऑन-प्लांट विधि का उपयोग करते समय, फ्लोरोसेसिन डाई को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रसव के तुरंत बाद देखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यदि एक पौधे को फ्लोरेसिन डाई देने के बाद समय के साथ एक ही क्षेत्र की छवि बनाई जाती है, तो समय के साथ सिग्नल की तीव्रता कम उज्ज्वल हो जाती है (चित्रा 10)। फ्लोरेसिन डाई संभवतः प्लास्मोडेमाटा20,21 के माध्यम से दृश्य क्षेत्र से पत्ती के अन्य क्षेत्रों में जा सकती है। ऑन-प्लांट विधि की तुलना में, कठोर सब्सट्रेट पर फाइबर के साथ ऑन-चिप विधि में, डाई पूरे क्षेत्र में धीमी गति से चलती है (चित्रा 9)। यह कोशिकाओं में फाइबर / रीहाइड्रेटिंग से अलग होने वाली डाई का परिणाम हो सकता है और इस प्रकार स्थानांतरित करने में अधिक समय लग सकता है।

लचीले सब्सट्रेट में फाइबर स्ट्रॉबेरी और सेब जैसी घुमावदार सतहों पर डाई वितरण के लिए उपयुक्त थे (चित्र 11 और चित्रा 12)। स्ट्रॉबेरी के साथ एक लचीले सब्सट्रेट का उपयोग करते हुए, एक मजबूत फ्लोरेसिन संकेत तुरंत देखा गया (चित्रा 11), जबकि सेब में एक मजबूत फ्लोरेसिन संकेत देखने में 2 घंटे लगे (चित्रा 12 बी, डी)। फ्लोरोसेंट मार्करों को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड की सफल डिलीवरी को परिणामी संकेत (चित्रा 12 एफ, चित्रा 13 और चित्रा 14) खोजने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यह निर्धारित करने के लिए नियंत्रण आवश्यक हैं कि पसंद के पौधे में फ्लोरोसेंट मार्कर के समान कोई ऑटोफ्लोरेसेंस नहीं है जिसे हम फाइबर द्वारा वितरित करना चाहते हैं। अकेले फाइबर का उपयोग यह निर्धारित करने में सहायक होता है कि क्या चिमटी के साथ लागू प्रभाव बल से पौधे के ऊतकों को नुकसान होता है या यदि नमूने के भीतर देखी गई प्रतिदीप्ति वीएसीएनएफ के कारण होती है, जो उनके सिलिकॉन नाइट्राइड परत18 (चित्रा 13 सी-डी) के कारण स्वाभाविक रूप से फ्लोरोसेंट होते हैं। पौधे के ऊतकों में लगाए गए फाइबर घाव की प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करते हैं जैसा कि एच 2ओ2 उत्पादन 6 द्वारा मूल्यांकन किया गयाहै। अंत में, +डीएनए के नियंत्रण का उपयोग करते हुए, फाइबर यह पुष्टि करने के लिए आवश्यक है कि डीएनए अकेले टैपिंग के माध्यम से पौधे में प्रवेश नहीं कर रहा है और पुष्टि करता है कि फाइबर पौधे की कोशिकाओं में वितरण के लिए आवश्यक हैं (चित्रा 13 ई-एफ)। एक कठोर सब्सट्रेट पर वीएसीएनएफ का उपयोग करके वितरण के ऑन-प्लांट या ऑन-चिप तरीकों का उपयोग करते समय कोई अलग अंतर नहीं होना चाहिए, जैसा कि प्रतिदीप्ति मूल्यों में महत्वपूर्ण अंतर की कमी से संकेत मिलता है (चित्रा 13 आई)। ऑन-चिप डीएनए डिलीवरी के साथ लचीली वीएसीएनएफ फिल्मों का उपयोग करने के परिणामस्वरूप स्टोर से खरीदे गए सेब और प्याज में एपिडर्मल कोशिकाओं का सफल क्षणिक परिवर्तन हुआ (चित्रा 12 एफ और चित्रा 14)।

असफल प्रयोगों में विभिन्न क्षेत्रों में फाइबर टूट सकते हैं, लेकिन प्लास्मिड डीएनए या डाई देने के प्रयास से कोई परिणामी प्रतिदीप्ति संकेत नहीं होगा। यदि पौधे पर बहुत अधिक दबाव लागू किया जाता है, तो स्पष्ट ऊतक क्षति होगी (चित्रा 15)। यह यांत्रिक क्षति पौधे में छोटे छेद या पारदर्शी क्षेत्रों की तरह दिख सकती है जैसे कि माइक्रोस्कोप के तहत पौधे को देखते समय कोशिकाओं की एक परत हटा दी गई हो। कभी-कभी चिप के निशान दिखाई देंगे। एक प्रयोग जिसमें डीएनए वितरण के बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता नहीं लगाया जाता है, कम गुणवत्ता वाले डीएनए के उपयोग के कारण भी हो सकता है, इसलिए ताजा डीएनए तैयार करना उपयोगी हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: कठोर और लचीले सब्सट्रेट्स पर फाइबर का उपयोग करके पौधे के ऊतकों को डाई / डीएनए वितरण का योजनाबद्ध । (ए) ऑन-प्लांट, फाइबर-मध्यस्थता डाई / डीएनए वितरण। डीएनए समाधान की 1-μL बूंद को एक पत्ती की सतह पर रखा जाता है और VACNF चिप को बूंद के ऊपर रखा जाता है। चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके, चिप को धीरे से ऊतक में टैप किया जाता है। कठोर सब्सट्रेट को ऊतक के भीतर नैनोफाइबर छोड़कर हटा दिया जाता है। (बी) ऑन-चिप फाइबर-मध्यस्थता डीएनए वितरण। डाई या डीएनए समाधान की एक 1 μL बूंद को VACNF चिप पर डाला जाता है और 15 मिनट के लिए सुखाया जाता है। अर्धशुष्क डीएनए के साथ चिप को पत्ती की सतह के शीर्ष पर रखा जाता है और पैनल ए के रूप में ऊतक में टैप किया जाता है। (सी) ऑन-चिप एसयू -8 फिल्म डीएनए वितरण। फाइबर को कठोर सिलिकॉन सब्सट्रेट से लचीले एसयू -8 बैकिंग में स्थानांतरित किया जाता है। डीएनए समाधान की 1 μL बूंद को VACNF फिल्म पर डाला जाता है और 10 मिनट के लिए सुखाया जाता है। डीएनए के साथ वीएसीएनएफ फिल्म को फिर मेकअप एप्लिकेटर का उपयोग करके एक घुमावदार पौधे की सतह पर घुमाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर सरणी बनाने के लिए वर्कफ़्लो। वीएसीएनएफ का उत्पादन करने के लिए, पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए 495 ए 4 के बाद पीएमएमए 950 ए 2) की एक दोहरी परत को सिलिकॉन वेफर पर स्पिन-लेपित किया जाता है। इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग व्यास में 300 एनएम डॉट्स की एक सरणी को परिभाषित करने के लिए किया जाता है। प्रतिरोध तब मिथाइल आइसोबुटिल कीटोन / आइसोप्रोपेनोल (एमआईबीके / आईपीए), 1.5 मिनट के लिए 1: 3 में विकसित किया जाता है। धातु बाष्पीकरणकर्ता का उपयोग करके, वेफर पर टीआई (10 एनएम) की एक चिपकने वाली परत लागू की जाती है, इसके बाद नी की एक परत (130 एनएम या 150 एनएम) होती है। शेष प्रतिरोध को फिर लिफ्ट-ऑफ (एसीटोन में स्नान सोनिकेशन) के माध्यम से हटा दिया जाता है। उत्प्रेरक डॉट्स की ज्यामिति का निरीक्षण एसईएम के माध्यम से किया जाता है। यदि उत्प्रेरक हॉकी पुक से मिलते जुलते हैं और सपाट होते हैं, तो उन्हें प्लाज्मा एन्हांस्ड रासायनिक वाष्प जमाव (पीईसीवीडी) मशीन में रखा जाता है और फाइबर उगाए जाते हैं। तब एसईएम का उपयोग करके तंतुओं का निरीक्षण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आदर्श लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर की एसईएम छवियां । (ए) ~ 35 μm पिच और 10-15 μm की ऊंचाई के साथ VACNFs का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, 30 ° कोण पर चित्रित किया गया। यह छवि चित्रा 7 सी में डुप्लिकेट है। (बी) ~ 20 μm पिच और 20-30 μm ऊंचाई के साथ VANCF का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, और 30 ° कोण पर चित्रित किया गया। (सी) ~ 35 μm पिच, 50-60 μm ऊंचाई के साथ VANCF का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, और 30 ° कोण पर चित्रित। (डी) 200 एनएम व्यास के साथ वीएसीएनएफ टिप <का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। फाइबर टिप व्यास (150-300 एनएम) में भिन्नता है। क्योंकि तंतुओं को 30 ° कोण पर चित्रित किया गया था, ऊंचाइयां पाप (30 °) = 1/2 के कारक द्वारा वास्तविक ऊंचाई से छोटी प्रतीत होती हैं। पैनल ए और बी को मॉर्गन एट अल .7 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: बढ़ते VACNFs से पहले उत्प्रेरक ज्यामिति की SEM छवियां । (A) लिफ्ट-ऑफ के बाद उत्प्रेरक की SEM छवि। ध्यान दें कि उत्प्रेरक के रिम के आसपास फोटोरेसिस्ट मौजूद है, जिसके परिणामस्वरूप ज्वालामुखी का आकार होता है। (बी, सी) एसईएम छवियां एकल-परत पीएमएमए प्रतिरोध का उपयोग करने के बाद उत्प्रेरक के ज्वालामुखी आकार दिखाती हैं। (डी) पीएमएमए की दोहरी परतों से बना वांछित हॉकी पुक उत्प्रेरक आकार। चूंकि तंतुओं को पैनल ए, बी और डी में 30 डिग्री कोण पर चित्रित किया गया था, इसलिए ऊंचाइयां पाप (30 °) = 1/2 के कारक द्वारा वास्तविक ऊंचाई से छोटी प्रतीत होती हैं। स्केल बार 100 एनएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फाइबर विकास पर उत्प्रेरक डॉट आकार का प्रभाव: उत्प्रेरक सामग्री के इष्टतम व्यास को स्थापित करने के लिए, फाइबर को 200-600 एनएम तक के डॉट आकार से उगाया गया था। 400-600 एनएम तक के डॉट आकार ने उत्प्रेरक के विघटन और कई तंतुओं के विकास को जन्म दिया। सबसे अच्छा फाइबर ज्यामिति 300 एनएम व्यास द्वारा उत्पादित किया गया था। छोटे बिंदुओं ने अपर्याप्त फाइबर ऊंचाई का नेतृत्व किया। इस तथ्य के कारण कि तंतुओं को 30 ° कोण पर चित्रित किया गया था, ऊंचाइयां पाप (30 °) = 1/2 के कारक द्वारा वास्तविक ऊंचाई से छोटी प्रतीत होती हैं। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ का उपयोग करके चित्र लिए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी (ओआरएनएल) में उपयोग किए जाने वाले प्रत्यक्ष प्रवाह - प्लाज्मा वर्धित रासायनिक वाष्प जमाव (डीसी-पीईसीवीडी) प्रणाली का योजनाबद्ध चित्रण। ओआरएनएल में कस्टम सिस्टम में एक बड़ा शॉवरहेड है जो फ़ीड गैसों और प्लाज्मा के लिए आउटपुट के लिए रिएक्टर के रूप में कार्य करता है। सब्सट्रेट के लिए गर्म चरण के सापेक्ष शॉवरहेड को 300 वी की डीसी क्षमता पर बनाए रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एक कठोर सब्सट्रेट से एक लचीले सब्सट्रेट में फाइबर को स्थानांतरित करने के लिए वर्कफ़्लो। नैनोफाइबर संश्लेषण और निरीक्षण के बाद, प्रत्येक वेफर को 45 सेकंड के लिए 4000 आरपीएम पर एसयू -8 2015 के साथ स्पिन-लेपित किया जाता है। वेफर को फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए नरम बेक किया जाता है। फिर वेफर को यूवी प्रकाश के संपर्क में लाया जाता है और 95 एमजे / सेमी 2 पर मास्क संरेखक में पैटर्न किया जाताहै। 95 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए पोस्टबेकिंग के बाद, वेफर को एसयू -8 डेवलपर में 15 सेकंड के लिए विकसित किया जाता है, आईपीए के साथ धोया जाता है, और एन2 गैस के साथ सुखाया जाता है। एसपीआर 955 सेमी 0.7 की एक सुरक्षात्मक प्रतिरोध परत को 3000 आरपीएम पर वेफर पर स्पिन-लेपित किया जाता है और 30 सेकंड के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर सॉफ्टबेक किया जाता है। लचीला सब्सट्रेट हाइड्रोफिलिक15 बनाने के लिए एक सिलिकॉन ऑक्साइड परत (2-3 एनएम) को परमाणु परत जमाव (एएलडी) (100 डिग्री सेल्सियस पर 22 चक्र) के माध्यम से वेफर में जोड़ा जाता है। वेफर को फिर एक डाइकिंग आरी के साथ 3 मिमी x 3 मिमी वर्गों में काट दिया जाता है। उपयोग के समय, अलग-अलग चिप्स को एसीटोन में रखा जाता है जब तक कि एसयू -8 कर्ल करना शुरू नहीं करता है और अवतल (>30 मिनट) बन जाता है। इस समय, अधिकांश चिप्स पर एसयू -8 परत को तेज चिमटी के साथ किनारे पर पकड़ा जा सकता है और अंतर्निहित सिलिकॉन सब्सट्रेट से एक बरकरार 3 मिमी वर्ग फिल्म के रूप में छील दिया जा सकता है। फिल्म को फिर आईपीए और पानी में 5 मिनट के लिए क्रमिक रूप से धोया जाता है और तुरंत उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एक कठोर सब्सट्रेट से एक लचीले सब्सट्रेट में फाइबर ट्रांसफर की एसईएम छवियां। दिखाए गए चित्र प्रतिनिधि हैं लेकिन विभिन्न नमूनों से आते हैं। (ए) पीईसीवीडी वृद्धि के बाद लंबे फाइबर ( चित्र 2 सी के समान छवि)। (बी, सी) एसयू -8 के आवेदन के बाद फाइबर। एपॉक्सी तंतुओं के आधार के चारों ओर फैलता है। उजागर फाइबर की लंबाई 5 μm से 30 μm तक थी। (D) लिफ्ट-ऑफ के बाद Su-8 में एम्बेडेड फाइबर ने अपनी ज्यामिति को बनाए रखा। इस तथ्य के कारण कि तंतुओं को 30 ° कोण पर चित्रित किया गया था, ऊंचाइयां पाप (30 °) = 1/2 के कारक द्वारा वास्तविक ऊंचाई से छोटी प्रतीत होती हैं। पैनल ए को मॉर्गन एट अल.7 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: कठोर सब्सट्रेट्स पर फाइबर के साथ ऑन-चिप और ऑन-प्लांट विधियों का उपयोग करके एराबिडोप्सिस पत्तियों को डाई वितरण। (A-P) छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। ऑन-चिप विधि (ए-एच): 10 μM फ्लोरेसिन डाई के 1 μL को VACNF चिप्स पर 15 मिनट के लिए सुखाया गया था, और फिर चिप्स को चिमटी के साथ एराबिडोप्सिस पत्तियों के अक्षीय पक्ष में टैप किया गया था। (A-D) प्रसव के बाद 5-15 मिनट के भीतर पत्तियों की छवि। (E-H) प्रसव के 1 घंटे बाद पत्तियों की छवि। (ए, ई) + डाई, + फाइबर। नियंत्रण: (बी, एफ) -डाई, -फाइबर; (सी, जी) -डाई, + फाइबर; (डी, एच) + डाई, -फाइबर। (I-P) ऑन-प्लांट विधि: पौधे की सतह पर 10 μM फ्लोरेसिन डाई के 1 μL को रखा गया था, चिप्स को इस तरह से तैनात किया गया था कि वे बूंद के संपर्क में आ गए, और चिप को एराबिडोप्सिस पत्तियों के अक्षीय पक्ष में टैप करने के लिए चिमटी का उपयोग किया गया। (आई-एल) प्रसव के बाद 5-15 मिनट के भीतर चित्रित किया गया और (एम-पी) प्रसव के 1 घंटे बाद चित्रित किया गया। (आई, एम) + डाई, + फाइबर। नियंत्रण: (जे, एन) -डाई, -फाइबर; (के, ओ) -डाई, + फाइबर; (एल, पी) + डाई, -फाइबर। पैनल ए-पी जेड-स्टैक्स से एकल प्लानर छवियां हैं। स्केल बार 20 μm हैं। फाइबर में 35 μm पिच होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: कठोर सब्सट्रेट के साथ ऑन-प्लांट विधि के माध्यम से एराबिडोप्सिस में डाई डिलीवरी का समय पाठ्यक्रम। छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। ऑन-प्लांट विधि का उपयोग करते हुए, फ्लोरेसिन डाई समाधान (10 μM) की 1 μL बूंद को एक पत्ती की सतह पर रखा गया था, और VACNF चिप को बूंद के ऊपर रखा गया था। चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके, चिप को धीरे से ऊतक में टैप किया गया था। +डाई, + फाइबर एक ही क्षेत्र की छवियां हर 5 मिनट में प्राप्त की गईं। स्केल बार 20 μm हैं। फाइबर में 35 μm पिच होती है। पैनल जेड-स्टैक्स से एकल प्लानर छवियां हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: वीएसीएनएफ फिल्मों का उपयोग करके स्ट्रॉबेरी फल को डाई डिलीवरी । (ए-एच) छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। ऑन-चिप विधि का उपयोग करते हुए, डाई की बूंदों को वीएसीएनएफ फिल्मों पर सुखाया गया था, जिसे बाद में मेकअप एप्लिकेटर का उपयोग करके फलों की सतहों पर घुमाया गया था। फ्लोरेसिन डाई (10 μM) स्ट्रॉबेरी कोशिकाओं में वितरित किया गया था और (A) 10 मिनट और (B) 1 घंटे के बाद चित्रित किया गया था। (ई, एफ) -डाई, + फाइबर क्रमशः 10 मिनट और 1 घंटे के बाद नियंत्रण करते हैं। (जी, एच) + डाई, -फाइबर क्रमशः 10 मिनट और 1 घंटे के बाद नियंत्रण करते हैं। स्केल बार 40 μm हैं। पैनल A-H 188 μm z-स्टैक्स के अधिकतम अनुमान हैं। फाइबर में 35 μm पिच होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: डाई डिलीवरी और वीएसीएनएफ फिल्मों के माध्यम से सेब का क्षणिक परिवर्तन। (ए-एफ) छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। ऑन-चिप विधि का उपयोग करते हुए, फ्लोरेसिन डाई (10 μM, B और D) की 1 μL बूंदें या प्लास्मिड एन्कोडिंग pUBQ10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) की 1 μL बूंदों को VACNF फिल्मों पर सुखाया गया, जिन्हें बाद में मेकअप एप्लिकेटर का उपयोग करके फलों की सतहों पर घुमाया गया। फ्लोरेसिन डाई को सेब एपिडर्मिस में पहुंचाया गया था और (बी) 10 मिनट और (डी) 2 घंटे के बाद चित्रित किया गया था। (एफ) 48 घंटे (ए, सी, ई) के बाद वीएसीएनएफ फिल्मों के माध्यम से डीएनए-वाईएफपी वितरण और अभिव्यक्ति कोई उपचार नियंत्रण (-डाई / डीएनए-वाईएफपी, -फाइबर)। स्केल बार 40 μm हैं। पैनल A-D z-स्टैक्स से एकल प्लानर छवियां हैं। पैनल E और F 53 μm z-स्टैक्स का अधिकतम प्रक्षेपण हैं। फाइबर पिच 35 μm है। तीर फ्लोरेसिन या वाईएफपी संकेतों को दर्शाते हैं। * फाइबर को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्र 13: ऑन-प्लांट या ऑन-चिप वीएसीएनएफ विधियों का उपयोग करके एराबिडोप्सिस पत्तियों का क्षणिक परिवर्तन। (ए)-एच) डीएनए डिलीवरी के 48 घंटे बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवियों को प्राप्त किया गया था। (ए, सी, ई, जी) ऑन-प्लांट विधि: प्लास्मिड एन्कोडिंग पीयूबीक्यू10: वाईएफपी (डीएनए-वाईएफपी) (200 एनजी) के 1 μL को एराबिडोप्सिस पत्तियों के अक्षीय पक्ष पर रखा गया था। चिप्स को इस तरह से तैनात किया गया था कि वे बूंद के संपर्क में आ गए, और चिमटी के बर्तन का उपयोग चिप को पत्ती के ऊतकों में टैप करने के लिए किया जाता था। (बी, डी, एफ, एच) ऑन-चिप विधि: डीएनए-वाईएफपी (200 एनजी) के 1 μL को VACNF चिप्स पर 15 मिनट के लिए सुखाया गया था और फिर चिप्स वेयर को चिमटी के साथ एराबिडोप्सिस पत्तियों के अक्षीय पक्ष में टैप किया गया था। +डीएनए-वाईएफपी, + फाइबर (ए) ऑन-प्लांट और (बी) ऑन-चिप के लिए। नियंत्रण: (सी, डी) -डीएनए-वाईएफपी, + फाइबर; (ई, एफ) + डीएनए-वाईएफपी, -फाइबर; और (जी, एच) -डीएनए, -फाइबर। (I) वाईएफपी चैनल से प्रतिदीप्ति का उपयोग करके 2-3 प्रयोगों से संयुक्त 5 जैविक प्रतिकृतियों की छवियों से 25 20 × 20 μm क्षेत्रों की सापेक्ष औसत प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता का ग्राफ। ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण स्टोमेटा (*) वाले क्षेत्रों को बाहर रखा गया था। -डीएनए-वाईएफपी, -फाइबर स्थिति से औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रत्येक औसत से घटाया गया था। 2-वे एनोवा (और टुकी परीक्षण) का उपयोग महत्व परीक्षण के लिए किया गया था, और त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। विभिन्न अक्षर उपचार (पी < 0.0001) के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं। दिखाए गए सभी चित्र 40 μm z-स्टैक्स के अधिकतम अनुमान हैं। स्केल बार 20 μm हैं। सफेद तीर छवियों में फाइबर का संकेत देते हैं। फाइबर पिच 35 μm है। यह आंकड़ा मॉर्गन एट अल.7 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 14
चित्र 14: वीएसीएनएफ फिल्मों का उपयोग करके प्याज का क्षणिक परिवर्तन। डीएनए डिलीवरी के 48 घंटे बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवियों को प्राप्त किया गया था। ऑन-चिप विधि का उपयोग करते हुए, 1 μL प्लास्मिड डीएनए एन्कोडिंग pUBQ10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) बूंदों को 10 मिनट के लिए VACNF फिल्मों पर सुखाया गया, जिसे बाद में पौधे के अंग सतहों पर घुमाया गया। (ए) डीएनए-वाईएफपी को वितरित किया गया था, और वाईएफपी को प्याज एपिडर्मिस में व्यक्त किया गया था। (बी) कोई उपचार नियंत्रण नहीं; (सी) नियंत्रण (+डीएनए-वाईएफपी, -फाइबर) और (डी) नियंत्रण (-डीएनए-वाईएफपी, + फाइबर)। स्केल बार 40 μm हैं। फाइबर में 35 μm पिच होती है। छवियां 115 μm z-स्टैक्स के अधिकतम अनुमान हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 15
चित्रा 15: वीएसीएनएफ फिल्म आवेदन से सलाद पत्ते में ऊतक क्षति । (ए-डी) छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। (ए) ऑन-चिप विधि का उपयोग वीएसीएनएफ फिल्मों के माध्यम से सलाद पत्ते को डीएनए देने के लिए किया गया था। पीयूबीक्यू 10: वाईएफपी डीएनए (200 एनजी) बूंदों को वीएसीएनएफ फिल्मों पर10 मिनट के लिए सुखाया गया था, जिसे फिर अलग सलाद पत्ते के अक्षीय पक्ष पर घुमाया गया और 4 दिनों के लिए आर्द्रता कक्ष में संग्रहीत किया गया। (बी) नियंत्रण (-डीएनए-वाईएफपी, + फाइबर)। (सी) नियंत्रण (+डीएनए-वाईएफपी, -फाइबर), और (डी) कोई उपचार नहीं (-डीएनए-वाईएफपी, -फाइबर)। स्केल सलाखों 40 μm हैं। VACNFs में 35 μm पिच है। तीर बहुत अधिक बल के साथ लचीले सब्सट्रेट के लुढ़कने के परिणामस्वरूप पौधे की क्षति को इंगित करते हैं। ध्यान दें कि सलाद पत्ते में सफल वीसीएनएफ-मध्यस्थता डीएनए वितरणअन्य प्रयोगों में हासिल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 16
चित्रा 16: पौधों में वीसीएनएफ-मध्यस्थता वितरण का वर्कफ़्लो। चरण 1 में, एसईएम का उपयोग करके फाइबर की ज्यामिति की जांच करें। उचित वितरण के लिए, फाइबर को व्यास < 200 एनएम के साथ एक टिप की आवश्यकता होती है। यदि लचीले सब्सट्रेट पर फाइबर का उपयोग किया जाता है, तो अगला कदम यह पुष्टि करना होगा कि फाइबर को एसयू -8 में स्थानांतरित किया जा रहा है और एसईएम के माध्यम से उजागर फाइबर की ऊंचाई की जांच करना है। चरण II में, हमने कठोर या लचीले सब्सट्रेट का उपयोग करके पसंद के पौधे / अंग में डाई पहुंचाने की कोशिश करके तंतुओं की उपयोगिता का परीक्षण किया। 1 μL बूंद का उपयोग करें, या तो इसे पौधे की सतह पर रखें या संक्षेप में इसे चिप / फिल्म पर सुखाएं। इस कदम और अन्य सभी चरणों के साथ, उचित नियंत्रण (-डाई, -फाइबर; -डाई, + फाइबर; और + डाई, -फाइबर) का उपयोग करना अनिवार्य है ताकि यह विश्वास हो सके कि सिग्नल बोनाफाइड डाई डिलीवरी से आता है। चरण III में, पुष्टि करें कि प्लास्मिड में रुचि का जीन मौजूद है, वितरित करने के लिए डीएनए की एकाग्रता निर्धारित करें, और अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए प्रसव के बाद इष्टतम समय का परीक्षण करें। चरण IV में, वितरित मार्कर की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परिणाम का मूल्यांकन किया गया था। यह आंकड़ा मॉर्गन एट अल.7 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस पेपर में, हमने लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर सरणियों के निर्माण के तरीके प्रस्तुत किए, फाइबर को एक लचीले सब्सट्रेट में स्थानांतरित किया, और पौधों को बायोमोलेक्यूल्स या रंजक के वितरण में उपयोग के लिए पौधों को कठोर या लचीले सब्सट्रेट में फाइबर लागू किया। हमने पेश की गई सामग्रियों के जमाव के लिए दो सामान्य दृष्टिकोणों, ऑन-चिप और ऑन-प्लांट विधियों का वर्णन किया और एक कठोर सब्सट्रेट पर फाइबर के साथ-साथ वीएसीएनएफ फिल्मों का उपयोग करके ऑन-चिप विधि में सफल परिणाम दिखाए। इन तंतुओं का अनुप्रयोग पारंपरिक पादप परिवर्तन विधियों (कण बमबारी, पीईजी या इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से प्रोटोप्लास्ट परिवर्तन) की तुलना में व्यवहार और सिद्धांत में सरल है और इसका उपयोग एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन के लिए उद्दंड पौधों के लिए किया जा सकता है। हालांकि, केवल कुछ कोशिकाएं बदल जाती हैं।

लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर का उत्पादन ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी सेंटर फॉर नैनोफेज मैटेरियल्स साइंसेज में उनके उपयोगकर्ता कार्यक्रम के माध्यम से किया गया था। उपयोगकर्ता VACNFs के उत्पादन के लिए इस सुविधा का उपयोग करने के लिए आवेदन कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, वीएसीएनएफ चिप्स का उत्पादन कार्बन स्रोत22,23 के साथ प्रत्यक्ष वर्तमान प्लाज्मा-संवर्धित रासायनिक वाष्प जमाव मशीनों के साथ साफ कमरे में किया जा सकता है। वर्णित विधियों के साथ, कुछ कदम हैं जो फाइबर के उत्पादन, फाइबर हस्तांतरण और वीएसीएनएफ चिप्स / फिल्मों के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण हैं। फाइबर अनुप्रयोग के काम करने के लिए, फाइबर सीधे होना चाहिएऔर सफल होने के लिए पौधे की कोशिकाओं में वितरण के लिए सिरे पर <200 एनएम का टेपरिंग व्यास होना चाहिए (चित्रा 3)। विशेष आकार और पिच के कार्बन नैनोफाइबर बनाने के लिए, विभिन्न प्रकार के पैरामीटर हैं जिन्हें बदला जा सकता है, जिसमें डॉट आकार, पार्श्व पिच और जमा उत्प्रेरक की मात्रा शामिल है। कार्बन नैनोफाइबर उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले इष्टतम डॉट आकार का चयन करने के लिए, फाइबर को विभिन्न डॉट आकारों से उगाया गया था (जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है)। हमने पाया कि 300 एनएम व्यास ने सबसे अच्छे फाइबर का उत्पादन किया, इसलिए इस डॉट आकार का चयन किया गया (चित्रा 5)। सही मापदंडों को खोजने के बाद, हमने चिप्स का उपयोग करने की कोशिश की जिसमें आदर्श ज्यामिति (सीधे और एक टिप व्यास <200 एनएम) के साथ >50% फाइबर होते हैं। तंतुओं की ज्यामिति की जांच करने के लिए, हमने वीएसीएनएफ चिप्स / फिल्मों के नमूने पर दृश्य के यादृच्छिक क्षेत्रों को चित्रित करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया।

इसके अतिरिक्त, पौधों की कोशिकाओं के भीतर वितरण प्राप्त करने के लिए फाइबर की एक निश्चित न्यूनतम लंबाई होनी चाहिए। विभिन्न लंबाई के तंतुओं के उत्पादन का महत्व यह है कि गहरे ऊतक परतों में प्रवेश करने के लिए लंबे फाइबर का उपयोग किया जा सकता है। लचीली फिल्मों के लिए लंबे फाइबर (लंबाई में >40 μm) आवश्यक हैं क्योंकि फाइबर ट्रांसफर उनके आधार से फाइबर को तोड़कर काम करता है और फाइबर के शीर्ष पर SU-8 को परत करने की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली एसयू -8 परत की कामकाजी मोटाई 20-35 μm है। विभिन्न पौधों (घुमावदार या सपाट) के एपिडर्मिस के भीतर डिलीवरी को पूरा करने के लिए आवश्यक न्यूनतम ऊंचाई 10-15 μm 6,7 है। नतीजतन, VACNF फिल्मों के लिए >40 μm लंबाई वाले फाइबर आवश्यक हैं। कार्बन नैनोफाइबर का उत्पादन करते समय विचार करने के लिए कई अलग-अलग पैरामीटर हैं: उत्प्रेरक सामग्री, उत्प्रेरक ज्यामिति, उत्प्रेरक सामग्री की मोटाई के साथ-साथ पीईसीवीडी कक्ष (गैस अनुपात, दबाव, तापमान, वर्तमान, शॉवरहेड ऊंचाई, और विकास समय) 8,9,24,25 के भीतर की स्थितियां। मॉर्गन एट अल.7 और डेवर्न एट अल.6 द्वारा उपयोग किए जाने वाले 25 μm से अधिक कार्बन नैनोफाइबर का उत्पादन करने के लिए, हमने नी उत्प्रेरक की मात्रा में वृद्धि की, एसिटिलीन: अमोनिया अनुपात को बदल दिया, और वर्तमान और विकास समय में वृद्धि की। इसके अतिरिक्त, हमने उत्प्रेरक सामग्री की ज्यामिति पर अधिक ध्यान दिया। लंबे सीधे तंतुओं का उत्पादन करने के लिए, जमा उत्प्रेरक को ज्वालामुखी (चित्रा 4) जैसा दिखने वाले आकार के बजाय हॉकी पुक आकार की आवश्यकता होती है। ज्वालामुखी संरचनाएं लिफ्ट-ऑफ के बाद फोटोरेसिस्ट के अवशेषों से उत्पन्न होती हैं। ज्वालामुखियों के गठन को रोकने के लिए, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी26 के दौरान एक अंडरकट बनाने के लिए पीएमएमए की एक दोहरी परत का उपयोग किया गया था। जमा धातु उत्प्रेरक के उत्थान-ऑफ में अंडरकट सहायता करता है (चित्र 2)। उत्प्रेरक की मोटी परत लंबे वीएसीएनएफ के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। VACNFs की आकृति विज्ञान की जांच Merkulova et al.24 द्वारा की गई है। वीएसीएनएफ का ऊर्ध्वाधर संरेखण नी उत्प्रेरक टिप-प्रकार की वृद्धि और सब्सट्रेट के लंबवत डीसी क्षमता के संरेखण दोनों के कारण है (चित्रा 6)। शॉवरहेड पीईसीवीडी रिएक्टर (चित्रा 6) की ज्यामिति का वर्णन करता है और विद्युत क्षेत्र27 की क्षमता के स्रोत के रूप में कार्य करता है।

इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी के साथ उत्प्रेरक बिंदुओं की सरणी को परिभाषित करने के लिए, हमने एक इलेक्ट्रॉन बीम प्रतिरोध (पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट) लागू किया, फिर एक विशिष्ट आकार के साथ और वेफर पर विशिष्ट स्थानों में प्रतिरोध में छोटे छेद बनाने के लिए ई-बीम का उपयोग किया। वांछित व्यास के छेद ों को परिभाषित रिक्ति (पिच) के साथ एक नियमित ग्रिड पर रखा गया था और वांछित पैटर्न को निर्दिष्ट करने वाली एक फ़ाइल को मशीन में सब्सट्रेट लोड करने से पहले इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी टूल में लोड किया गया था। फाइबर ऊंचाई के अलावा, सफल फाइबर हस्तांतरण के लिए एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर एसीटोन स्नान में बिताए गए समय की मात्रा है। वीएसीएनएफ फिल्मों को एसीटोन स्नान में लंबे समय तक छोड़ने की आवश्यकता होती है ताकि उनके किनारे घुंघराले होने लगें; यदि उन्हें एसीटोन स्नान में बहुत कम समय के लिए छोड़ दिया जाता है, तो उन्हें चिप्स से उठाना अधिक कठिन होता है और वे टूट सकते हैं। चिप्स जितने पुराने होंगे, उन्हें एसीटोन स्नान में उतने ही लंबे समय तक रहना होगा। एसीटोन स्नान के बाद, फिल्मों / चिप्स को एक्सेस एसीटोन को हटाने के साथ-साथ फाइबर पर सुरक्षात्मक फोटोरेसिस्ट को हटाने के लिए आइसोप्रोपेनोल और पानी में रखा गया था।

स्पिन कोटिंग करने के लिए, वेफर्स या वेफर के टुकड़ों को स्पिन कोटर में वैक्यूम चक पर रखा जाता है, और वेफर की केंद्रीय स्थिति को स्पिन कोटर के परीक्षण फ़ंक्शन का उपयोग करके सत्यापित किया जाता है। प्रतिरोध का एक छोटा पोखर (~ 2.5 सेमी व्यास) वेफर और स्पन (45 सेकंड के लिए 3000 आरपीएम) के केंद्र में लगाया जाता है, स्पिन कोटिंग से पहले और बाद में फाइबर की छवियों को चित्र 8 में शामिल किया गया है जो फाइबर ज्यामिति (ऊंचाई, अभिविन्यास और पिच) के संरक्षण को दर्शाता है। तंतुओं की उपस्थिति तंतुओं के आधार पर अच्छी तरह से प्रतिरोध का कारण बनती है और इसके परिणामस्वरूप अपेक्षा से अधिक मोटी परतें होती हैं। वीएसीएनएफ वृद्धि के बाद स्पिन-कोटिंग का अन्य समूहों11,18 द्वारा पता लगाया गया है।

प्रक्रिया के भीतर एक और कदम जो महत्वपूर्ण महत्व का है, यह सुनिश्चित करना है कि वीएसीएनएफ चिप्स / फिल्मों पर सही मात्रा में बल लागू किया जाए। वितरण तंत्र कठोर सब्सट्रेट्स 6,7 पर चिमटी के आवेग बल के माध्यम से सेल की दीवारों में छोटे पंचर बनाने वाले फाइबर पर निर्भर है या लचीले सब्सट्रेट्स पर मिनी-मेकअप एप्लिकेटर के साथ रोल कर रहा है। परिणाम पर प्रभाव डाले बिना फाइबर टूट सकते हैं या नहीं भी हो सकते हैं और पौधेकी कोशिकाओं 6,7में स्थिर रह सकते हैं, लेकिन दबाव को सही करने के लिए डाई अपटेक और ऊतक क्षति के लिए परीक्षा के साथ संयोजन में अभ्यास आवश्यक है। फिल्मों के साथ डीएनए वितरण के बाद उपयुक्त इमेजिंग समय बिंदुओं का चयन करना महत्वपूर्ण है क्योंकि पता लगाने योग्य अभिव्यक्ति का समय पौधों की प्रजातियोंऔर वितरित किए जा रहे वैक्टर के प्रकारों के बीच भिन्न होता है (चित्रा 16)।

मोटे तौर पर यह विधि पौधों पर लागू होती है, इसकी कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, वीएसीएनएफ फिल्मों में सिलिकॉन ऑक्साइड की एक पतली परत जोड़ने से एसयू -8 के शीर्ष पर फोटोरेसिस्ट की सुरक्षात्मक परत के कारण फिल्में हमेशा पूरी तरह से हाइड्रोफिलिक नहीं होती हैं। यदि यह समस्या अमल में आती है, तो सिलिकॉन ऑक्साइड की मोटी परतों को वीएसीएनएफ पर लागू किया जा सकता है। यह जांचने के लिए कि क्या फिल्में हाइड्रोफोबिक या हाइड्रोफिलिक हैं, उन्हें पानी में रखा जा सकता है। यदि फिल्में डूबती हैं, तो वे हाइड्रोफिलिक हैं, और यदि वे तैरते हैं, तो वे हाइड्रोफोबिक हैं। इसके अतिरिक्त, उत्पादित फाइबर के बैचों के बीच भिन्नता हो सकती है। डीसी-पीईसीवीडी मशीन में फाइबर बढ़ते समय कई पैरामीटर हैं जिन्हें बदला जा सकता है; इस प्रोटोकॉल में जो वर्णित है वह एनआई उत्प्रेरक की दो अलग-अलग मात्राओं के लिए मापदंडों का एक सेट है। इसके अतिरिक्त, नी उत्प्रेरक के क्रिस्टल अभिविन्यास को नियंत्रित नहीं किया जा सकता है28 और कुछ शाखाओं के परिणामस्वरूप अनिवार्य रूप से फाइबर होंगे।

जबकि हमने इस पेपर के लिए कठोर और लचीले सब्सट्रेटदोनों का उपयोग करके पौधों की कोशिकाओं को फ्लोरेसिन डाई और डीएनए के वितरण का प्रदर्शन किया, विधि को मोटे तौर पर अन्य बायोमोलेक्यूल्स और आनुवंशिक संशोधन दृष्टिकोणों के लिए लागू किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, सेब या अन्य फलों जैसे पौधों की प्रणालियों के लिए आरएनएआई साइलेंसिंग जहां स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों का उत्पादन करने में वर्षों लगेंगे। इसके अलावा, इन तंतुओं का उपयोग आनुवंशिक संपादन सामग्री देने या पौधों में स्थिर परिवर्तनों के लिए भी किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

नैनोफाइबर सरणियों को सेंटर फॉर नैनोफेज मैटेरियल्स साइंसेज में बनाया गया था, जो विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा (प्रस्ताव आईडी: CNMS2019-103 और CNMS2022-ए -1182) के ऊर्जा कार्यालय का एक विभाग है। सीएनएमएस से समर्थन एक सहकर्मी-समीक्षा प्रस्ताव प्रणाली के माध्यम से प्रदान किया जाता है और सफल आवेदकों को बिना किसी लागत के प्रदान किया जाता है जो अपने परिणामों को प्रकाशित करने का इरादा रखते हैं (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). हम नैनोफाइबर सरणियों के उत्पादन के साथ सहायता के लिए केविन लेस्टर और सीएनएमएस को धन्यवाद देते हैं। हम प्रयोगात्मक डिजाइन पर महत्वपूर्ण चर्चा के लिए डॉ जॉन कॉघमेन, डॉ टिमोथी मैकनाइट, डॉ एम्बर वेब, डेरिल ब्रिग्स और ट्रैविस बी को धन्यवाद देते हैं। हम पीईसीवीडी मशीन के योजनाबद्ध के लिए डॉ एडम रोंडिनोन को धन्यवाद देते हैं। हम वैज्ञानिक चित्रों के लिए लेस्ली कैरोल को धन्यवाद देते हैं। इस काम को बायोइमेजिंग साइंस प्रोग्राम, अमेरिकी ऊर्जा विभाग, विज्ञान, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान कार्यालय, डीई-SC0019104 और संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग, 2021-67013-34835 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जेएमएम को संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा समर्थित किया गया था: राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान: कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रीडॉक्टोरल फैलोशिप 2021-67034-35167।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct Fastenal  690535
2-Propanol (IPA)  Fischer Scientific A451-4
4" Lid Entegris H22-401-0615 Wafer Carriers
4" tray Entegris H22-40-0615 Wafer Carriers
Accretech SS10 dicing saw Accreteck SS10
Acetone Fischer Scientific A18-4
Acetone used in the cleanroom at ORNL JT Baker 9005-05
Apples Grocery store No product number
Arabidopsis thaliana  Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago No product number
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine Oak Ridge National Laboratory  Custom-built
Cobham Green lettuce  Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis No product number Butterhead lettuce
Fluorescein dye Sigma Aldrich F2456-2.5G
Gel-box  Gel-Pak  AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool  Heidelberg DWL 66
ImageJ National Institues of Health  No product number
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL Doe and Ingalls CMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system JEOL 8100
Kimwipes Kimtech Kimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish VWR 11019-554
Layout Editor   juspertor GmbH No product number 
LSM 710 confocal microscope Zeiss No product number
LSM 800 confocal microscope Zeiss No product number
Make-up applicator  Amazon G2PLUS 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS
Merlin field emission scanning electron microscope Zeiss Merlin
MIBK/IPA  (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) Microchem M089025
Onions Grocery store No product number
Oxford FlexAl atomic layer deposition Oxford FlexAl
PMMA 495 A4 Microchem M130004
PMMA 950 A4 Microchem M230004 Can dilute down to A2
Polyethylene terephthalate (PET) Amazon KS-6304-21-11 Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc
Precision tweezers Aven Inc.  18032TT
pUBQ10:YFP-GW Arabidopsis Biological Resource Center CD3-1948
Silicon etcher (used for descum)  Oxford Plasmalab
Silicon rubber kit Smooth-On Inc Ecoflex 00-20
Silicon wafers Pure Wafer 4N0.001-.005SSP-INV
Spin coater Brewer Sciences Model 100CB
SPR 955cm 0.7  Megaposit 10018314
Strawberries Grocery store No product number
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 Series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 developer Microchem SU-8 2000 Series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Suss MicroTec contact aligner Suss MicroTec MA6/BA6
Table top microscope Phenom XL used for checking Ni catalysts after metal deposition
Thermionics VE-240 e-beam evaporator Thermionics VE-240

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References

  1. Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
  2. Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
  3. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
  4. Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).
  5. Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
  6. Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).
  7. Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).
  8. Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).
  9. Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).
  10. Nelson-Fitzpatrick, N. Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).
  11. Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
  12. Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. Processing of thin SU-8 films. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020 (2008).
  13. Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).
  14. Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527 (2011).
  15. Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
  16. Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008 (2019).
  17. Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
  18. Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Crafts, A. S. Translocation in plants. Plant Physiology. 13 (4), 791 (1938).
  21. Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
  22. Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
  23. Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).
  24. Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
  25. Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
  26. Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
  27. Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
  28. Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).

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लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर सरणी कठोर सब्सट्रेट लचीला सब्सट्रेट बायोमोलेक्यूल्स का वितरण रंगों की डिलीवरी नैनोमटेरियल्स पौधों को डीएनए वितरण माइक्रोफैब्रिकेशन क्षणिक परिवर्तन फ्लोरेसिन वितरण वीएसीएनएफ ट्रांसफर एसयू -8 एपॉक्सी सब्सट्रेट सिलिकॉन ऑक्साइड कोटिंग हाइड्रोफोबिक प्रकृति घुमावदार पौधे अंग डाई समाधान डीएनए समाधान वितरण
पौधों को बायोमोलेक्यूल्स और रंगों के वितरण के लिए कठोर या लचीले सब्सट्रेट्स पर लंबवत संरेखित कार्बन नैनोफाइबर सरणियों का उपयोग करना
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Morgan, J. M., Jelenska, J., Hensley, D. K., Li, P., Srijanto, B. R., Retterer, S. T., Standaert, R. F., Morrell-Falvey, J. L., Greenberg, J. T. Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants. J. Vis. Exp. (197), e65602, doi:10.3791/65602 (2023).

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