Summary
Hier beschrijven we methoden voor het microfabriceren van verticaal uitgelijnde koolstofnanovezels (VACNF's), het overbrengen van VACNF's naar flexibele substraten en het toepassen van VACNF's op zowel stijve als flexibele substraten op planten voor de levering van biomoleculen en kleurstoffen.
Abstract
De levering van biomoleculen en ondoordringbare kleurstoffen aan intacte planten is een grote uitdaging. Nanomaterialen zijn opkomende hulpmiddelen voor de levering van DNA aan planten. Hoe opwindend deze nieuwe tools ook zijn, ze moeten nog op grote schaal worden toegepast. Nanomaterialen die op een stijf substraat (backing) worden vervaardigd, zijn bijzonder moeilijk met succes toe te passen op gebogen plantenstructuren. Deze studie beschrijft het proces voor het microfabriceren van verticaal uitgelijnde koolstofnanovezelarrays en het overbrengen ervan van een stijf naar een flexibel substraat. We beschrijven en demonstreren hoe deze vezels (op stijve of flexibele substraten) kunnen worden gebruikt voor tijdelijke transformatie of kleurstofafgifte (bijv. fluoresceïne) aan planten. We laten zien hoe VACNF's kunnen worden overgebracht van stijf siliciumsubstraat naar een flexibel SU-8 epoxysubstraat om flexibele VACNF-arrays te vormen. Om de hydrofobe aard van SU-8 te overwinnen, werden vezels in de flexibele film gecoat met een dunne laag siliciumoxide (2-3 nm). Om deze vezels te gebruiken voor levering aan gebogen plantenorganen, deponeren we een druppel kleurstof of DNA-oplossing van 1 μL aan de vezelzijde van VACNF-films, wachten 10 minuten, plaatsen de films op het plantenorgaan en gebruiken een wattenstaafje met een rollende beweging om vezels in plantencellen te drijven. Met deze methode hebben we kleurstof- en DNA-afgifte bereikt in plantenorganen met gebogen oppervlakken.
Introduction
Planttransformatie (zowel tijdelijk als stabiel) moet nog op grote schaal worden bereikt in alle plantenweefsels en -soorten. De voorbijgaande transformatie van planten is een proces waarbij genen die in plasmiden zijn gecodeerd, tijdelijk in planten worden geïntroduceerd, maar niet stabiel in het genoom worden opgenomen. Traditionele methoden die gebruik maken van deeltjesbombardement, agrobacteriën, elektroporatie of polyethyleenglycolbehandeling van protoplasten zijn traag of kunnen omslachtig zijn. Bovendien zijn ze niet van toepassing op elke plantensoort 1,2,3,4. Het gebruik van nanomaterialen voor DNA-levering is een ontluikend veld dat nog in de kinderschoenen staat5. Nanomaterialen, met name koolstofnanovezels, zijn ook met succes gebruikt om eiwitten, dextrans en kleurstoffen aan plantenbladeren af te geven zonder wondrespons te veroorzaken6. Het doel van dit werk is om een gedetailleerd protocol te bieden voor het gebruik van één type nanomateriaal, koolstofnanovezels, voor het leveren van biomoleculen of kleurstoffen aan planten. Hier richten we ons op DNA als het biomolecuul bij uitstek, dat de voorbijgaande transformatie van cellen in verschillende plantenorganen mogelijk maakt.
Eerder demonstreerden Morgan et al.7 het gebruik van koolstofnanovezels die op stijf siliciumsubstraat zijn aangebracht om bladeren van sla, N. benthamiana en populier, en zowel bladeren als wortels van Arabidopsis tijdelijk te transformeren. Hoewel transformaties succesvol waren op een verscheidenheid aan organen, waren vezels moeilijker aan te brengen op plantenweefsels met gebogen oppervlakken, zoals wortels of fruit. We redeneerden dat een flexibele drager voor nanovezels hun efficiëntie van afgifte zou kunnen verbeteren door zich beter aan te passen aan de vorm van het orgaan.
Hierin beschrijven we methoden die worden gebruikt voor het vervaardigen en ontwerpen van verticaal uitgelijnde koolstofnanovezels, het overbrengen van VACNF's naar flexibele substraten en het aanbrengen van VACNF's op zowel stijve als flexibele substraten op planten om biomoleculen en kleurstoffen af te leveren. Koolstofnanovezels werden geproduceerd met behulp van gelijkstroom katalytische plasma-versterkte chemische dampafzetting (dc C-PECVD) met Ni-katalysator. De positie, diameter en hoogte van Ni-katalysatorstippen werden gecontroleerd met behulp van een combinatie van elektronenbundellithografie, metaalverdamping en lift-off-processen zoals beschreven door Melechko et al.8,9. Met behulp van een dubbellaagse e-beam resist kan een dikkere Ni-katalysator op het substraat worden afgezet om langere vezels te geven10. Vezeloverdracht van een stijf naar een flexibel substraat is gebaseerd op een wijziging van de methoden beschreven in Fletcher et al.11, waarbij de huidige methoden afzien van het gebruik van een amorfe koolstoflaag of een opofferende fotoresistlaag. SU-8 lift-off met vezeloverdracht wordt bereikt door gebruik te maken van de intrinsieke trekspanning die het gevolg is van onderbakken en onderbelichten van de SU-812,13,14. SU-8, een complex polymeer, is van nature hydrofoob, wat het gebruik ervan voor het vergemakkelijken van DNA-afgifte bemoeilijkt. Om de hydrofobe aard van SU-8 tegen te gaan, brengen we een dunne laag siliciumoxide aan via atoomlaagafzetting15 nadat vezels zijn ingebed in SU-8. Toepassing van vezels op een stijf substraat voor de afgifte van biomoleculen/kleurstoffen maakt gebruik van de slagkracht van het tikken met een pincet beschreven in Davern et al.6 en de on-plant en on-chip methoden beschreven in Morgan et al.7. Flexibele VACNF-films worden aangebracht op gebogen plantoppervlakken door eerst DNA- of kleurstofdruppels op de film te semidrogen, zoals bij de on-chip-methode van Morgan et al.7, en vervolgens de films op gebogen plantoppervlakken te rollen met behulp van een kleine make-upapplicator16,17. Figuur 1 toont verschillende benaderingen voor het aanbrengen van vezels in stijve en flexibele substraten op planten.
Protocol
1. Productie van VACNF's (figuur 2 en figuur 3)
- Spincoat een siliciumwafel met polymethylmethacrylaat (PMMA) 495 A4 resist bij 4000 rpm en bak deze gedurende 5 minuten op 180 °C.
NOTITIE: Laat de wafel 10 seconden afkoelen voordat u doorgaat naar de volgende stap. - Spincoat een tweede laag resist (PMMA 950 A2) en bak deze 5 minuten op 180 °C.
- Gebruik elektronenbundellithografie om de katalysatorpunten met een diameter van 300 nm te definiëren bij een gespecificeerde laterale afstand (pitch: 10 μm of 35 μm) in arrays van 3 mm x 3 mm.
- Ontwikkel de resist in 30-40 ml 1:3 methyl-isobutylketon: isopropylalcohol (IPA) gedurende 1,5 minuut, gevolgd door het te spoelen met IPA en te drogen metN2.
NOTITIE: Controleer de reeks stippen met behulp van een helderveldmicroscoop (20x objectief). - Reinig de wafer van de resterende weerstand met een blootstelling van 6 s in zuurstofplasma (uitschot) in een siliconenetser.
- Gebruik elektronenbundelverdamping om eerst een hechtlaag metaal (Ti of Cr, 10 nm) af te zetten en vervolgens een tweede laag, de Ni-katalysator (130 nm of 150 nm). Houd tijdens Ti- of Ni-metaalafzetting de stroom onder 0.2 A bij 10 kV, de druk onder 5 x 10-6 Torr en de afzettingssnelheid onder ~1 A/s voor zichtlijnafzetting.
- Gebruik sequentiële badsonicatie om het metaal (Ni) te verwijderen dat op de onderliggende weerstandslaag is afgezet, waardoor het Ni direct op de siliciumwafer wordt afgezet. Dit proces wordt lift-off genoemd.
- Bereid hiervoor 3 containers met aceton voor en laat de wafel gedurende 1 minuut in aceton soniëren; herhaal dit 3 keer bij kamertemperatuur (RT, 20 °C) met een frequentie van 35 kHz. Spoel af met IPA en droog af met N2.
NOTITIE: Laat aceton nooit opdrogen op de wafer. Na de laatste aceton-sonicatie onmiddellijk afspoelen met IPA en vervolgens drogen metN2-gas . Als de wafer op enig moment voortijdig droog wordt (voorafgaand aan IPA-spoeling), bestaat de mogelijkheid dat niet al het overtollige metaal en resist wordt verwijderd en dat de aceton een residu kan achterlaten.
- Bereid hiervoor 3 containers met aceton voor en laat de wafel gedurende 1 minuut in aceton soniëren; herhaal dit 3 keer bij kamertemperatuur (RT, 20 °C) met een frequentie van 35 kHz. Spoel af met IPA en droog af met N2.
- Controleer de geometrie van de vorm van de katalysator met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM). Om SEM-beelden van de VACNF-chips vast te leggen, kantelt u de tafel in een hoek van 30° en gebruikt u een spanning van 1-3 kV, met een straalstroom van ~100 pA en een werkafstand van ~5 mm.
OPMERKING: De katalysator moet eruitzien als een hockeypuck (een compacte cilinder) (Figuur 4). De hoogte van de compacte cilinder moet de dikte van Ni weerspiegelen die op de siliciumwafer is afgezet. Als het profiel van de Ni-stip lang is en aan de bovenkant concaaf lijkt te zijn, vergelijkbaar met een vulkaan (Figuur 4), dan is de kans groter dat de katalysator nat wordt in meerdere Ni-druppels, wat resulteert in vertakking van de koolstofnanovezels9 (Figuur 4 en Figuur 5). Dergelijke problemen kunnen het gevolg zijn van weerstand tegen smelten tijdens metaalverdamping vanwege lange afzettingstijden of problemen met de opstijgprocedure (Figuur 4 en Figuur 5). - Snijd de siliciumwafer in vieren en plaats deze in de gelijkstroomplasma-versterkte chemische dampafzettingskamer (dc-PECVD) met het acetyleen/ammoniakmengsel. Optimaliseer de groeiparameters om de lengte en taps toelopende nanovezels (tips <200 nm) te regelen.
- Gebruik een stroom van 1-1,5 A en een spanningsbereik van 440-560 V. Gebruik bij het kweken van de vezels een voorbehandelingsfase met ammoniakstroom terwijl de machine en het substraat opwarmen tot 620 °C. Zorg ervoor dat u de koolstofbron (acetyleen) 10 seconden voor het starten van het plasma inschakelt.
OPMERKING: Kwartwafers worden gebruikt voor het geval de parameters van de PECVD-machine moeten worden geoptimaliseerd. Om vezels te produceren met een lengte van meer dan 40 μm en tips met een diameter van minder dan 200 nm, worden de volgende parameters voorgesteld: gebruik bij een Ni-katalysatordikte van 130 nm een stroom van 1,75 A, groeitijd van 70 minuten en een acetyleen: ammoniakverhouding van 45 standaard kubieke centimeter per minuut (sccm) : 100 sccm. Gebruik bij een Ni-dikte van 150 nm een stroom van 1,5 A, een groeitijd van 80 minuten en een acetyleen: ammoniakverhouding van 48 sccm : 100 sccm. Gebruik de volgende parameters om VACNF's te kweken, ongeacht de dikte van de katalysator: groeitemperatuur van 620 °C, druk van 10 torr tijdens plasma en een douchekophoogte van 20 mm (Figuur 6).
- Gebruik een stroom van 1-1,5 A en een spanningsbereik van 440-560 V. Gebruik bij het kweken van de vezels een voorbehandelingsfase met ammoniakstroom terwijl de machine en het substraat opwarmen tot 620 °C. Zorg ervoor dat u de koolstofbron (acetyleen) 10 seconden voor het starten van het plasma inschakelt.
- Beoordeel de geometrie van de resulterende vezels met behulp van SEM bij een helling van 30° met een versnellingspotentiaal van 1 kV.
OPMERKING: Optimale vezels zijn recht en niet-vertakkend. Het is onmogelijk om de kristaloriëntatie van de Ni-katalysator te regelen met de elektronenbundelverdamper. Als gevolg hiervan zullen er enkele vezels zijn die vertakken als gevolg van katalysatorontvochtiging9. Ook zorgt de kristaloriëntatie ervoor dat de VACNF's tot verschillende hoogtes groeien, dus uniforme hoogtes op alle VACNF's zijn moeilijk. - Breng gedurende 45 s een laag fotoresist (SPR955) aan op de vezels bij 1000 tpm. Snijd vervolgens de 1/4 wafer in reeksen van 3 mm x 3 mm met behulp van een snijzaag. Bewaar de vezels op dit punt voor later gebruik.
OPMERKING: Voer stap 1.11 niet uit als u van plan bent vezels over te brengen naar een flexibel substraat.
2. Overdrachtvan VACNF's naar een flexibel substraat (figuur 7 en figuur 8)
- Nadat de vezels zijn gesynthetiseerd, spincoat SU-8 2015 fotoresist op de wafers of kwartwafers bij 4000 tpm gedurende 45 s.
- Bak de wafel 3 minuten zacht op 95 °C.
- Gebruik een contactuitlijner om de wafer bloot te leggen met een 3 mm 3 mm array-patroonmasker dat is uitgelijnd met het gedefinieerde patroon van elektronenbundellithografie bij 95 mJ/cm2.
NOTITIE: Gebruik een nabijheidscontactmodus met een belichtingsafstand die 20 μm groter is dan de hoogste vezel. Het is mogelijk dat vezels tijdens deze stap in het proces worden omgestoten. - Bak na blootstelling gedurende 6 minuten op 95 °C.
- Ontwikkel de wafer gedurende 15 s in SU-8 developer, spoel hem af met IPA en droog de wafer met N2, van boven naar beneden.
NOTITIE: Zorg er bij het ontwikkelen van de wafer voor dat deze volledig is ondergedompeld. - Spincoat patroonwafels met een beschermende laag van dunne fotoresist (SPR 955 CM 0,7) bij 3000 tpm gedurende 45 s en softbake gedurende 30 s bij 90 °C.
- Breng een dunne laag siliciumoxide aan op de wafer (2-3 nm) door deze gedurende 22 cycli bij 100 °C in een atoomlaagafzetting te plaatsen.
- Gebruik een snijzaag om de wafer in vierkanten van 3 mm x 3 mm te snijden. Lijn de snijzaag uit met het reeds bestaande patroon op de wafel.
- Beoordeel de geometrie van de resulterende vezels met behulp van SEM bij een helling van 30° met een versnellingspotentiaal van 3 kV.
- Stop hier als u chips bewaart voor langdurig gebruik (>1 week). Bewaar chips in het donker.
- Om flexibele substraten van stijve substraten te scheiden, plaatst u afzonderlijke chips gedurende 30 minuten in aceton of totdat de SU-8 begint te krullen.
- Was SU-8-films (bevestigd aan of losgemaakt van harde ondergronden) met IPA gedurende 5 minuten en vervolgens gedurende 5 minuten met water. Plaats de chips in een commerciële doos met een plakstrip wanneer u ze vervoert.
- OPTIONEEL: Plaats de vezelloze kant van de SU-8-film op in water oplosbare tape of op dun siliconenrubber met een dunne achterkant van polyethyleentereftalaat (PET) (12.5 μm dik).
- Gebruik een pincet om de SU-8 film over te brengen. Druk op de randen van het SU-8 vierkant om het te helpen plakken aan de tape/siliconenrubber-PET; Dit is om te voorkomen dat vezels afbreken. Op dit punt zijn de VACNF-films klaar voor onmiddellijk gebruik.
- Om een siliconenrubber/PET-houder voor te bereiden, gaat u als volgt te werk: gebruik een 2-delige kit voor siliconenrubber om de twee delen (het elastomeer en de crosslinker) door elkaar te mengen. Knip vervolgens een vierkant PET uit en plak het vast in een doorzichtige plastic schaal. Giet een zeer dun laagje siliconenrubber op het PET en laat het 1-2 uur uitharden bij 80 °C.
3. On-plant-methode (waarbij een druppel af te geven oplossing op een plantoppervlak wordt geplaatst) met vezels in een stijf substraat (Figuur 1A)
- Verwijder de fotoresist met incrementele wasbeurten van aceton (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) en ddH2O (5 min) voor gebruik.
- Plaats het te spietsen plantenweefsel op een harde ondergrond ter ondersteuning.
- Breng een druppel kleurstof of DNA van 1 μL (200 ng) aan op het oppervlak van het plantenweefsel.
- Plaats een VACNF-chip met een stijf substraat op de bovenkant van de druppel, met de vezels zo georiënteerd dat ze in contact komen met de druppel.
OPMERKING: De oriëntatie van de chips kan worden bepaald door de "glans" van de wafer. De glanzende kant van de chip heeft vezels en de ondoorzichtige kant niet. - Tik met de platte kant van een pincet op de chip. Markeer het gebied van de plant waarmee de chip in contact is gekomen met een marker met zachte punt. Verwijder de VACNF-chips na levering.
NOTITIE: De hoeveelheid kracht die wordt uitgeoefend bij het tikken is afhankelijk van het type plantenweefsel dat wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om te oefenen met het tikken van chips voordat u vezels spietst. Voorkom schade aan plantenweefsels. Schade is duidelijk wanneer men de omtrek van de VACNF-chip in het plantenweefsel kan zien. - Herhaal stap 3.1-3.5 voor controles (+Kleurstof/DNA, -Vezels; -Kleurstof/DNA, +Vezels; en -Kleurstof/DNA, -Vezels). -Vezels is de vezelloze kant van een chip.
- Bewaar intacte planten of uitgesneden plantenorganen indien nodig in vochtige kamers gedurende lange dagen (16 uur licht, 8 uur donker). Gebruik voor weggesneden organen een plastic petrischaal met nat keukenpapier.
4. On-chip-methode (waarbij een druppel af te leveren oplossing op een VACNF-chip wordt geplaatst), stijf substraat (Figuur 1B)
- Verwijder de fotoresist met incrementele wasbeurten van aceton (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) en ddH2O (5 min) voor gebruik.
- Druppel 1 μL druppel kleurstof of plasmide-DNA (200 ng) op de vezelzijde van de VACNF-chip met stijf substraat. Zorg ervoor dat u de druppel in het midden van de chip plaatst en meerdere vezels bedekt. Laat de druppel 15 minuten drogen.
OPMERKING: De oriëntatie van de chips kan worden bepaald door de "glans" van de wafer. De glanzende kant van de chip heeft vezels en de ondoorzichtige kant niet. - Als u met bladeren of andere uitgesneden organen werkt, plaats ze dan op een hard oppervlak. Als u met intacte planten werkt, plaats dan een hard oppervlak onder het orgaan waarop VACNF's worden aangebracht.
- Na de droogstap van 15 minuten plaatst u de VACNF-chip zo dat de vezelzijde in contact komt met het plantenweefsel. Tik met de achterkant van een pincet op de chip.
NOTITIE: De hoeveelheid kracht die wordt uitgeoefend bij het tikken is afhankelijk van het type plantenweefsel dat wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om te oefenen met het tikken van chips. - Herhaal stap 3.6-3.7 van de plantmethode.
5. Aanbrengen van VACNF's in SU-8-films op plantenweefsel met behulp van de on-chip-methode (Figuur 1C)
- Plaats 1 μL druppel kleurstof of DNA (200 ng) op de vezelzijde van de SU-8 film en laat deze 10 minuten drogen. Zorg ervoor dat u de druppel in het midden van de chip plaatst.
OPMERKING: Er zijn verschillende droogtijden, afhankelijk van het gebruikte substraat. - Plaats de VACNF-film met een scherp pincet op het oppervlak van de plant.
OPMERKING: Hoe langer de SU-8-films in de lucht worden gelaten, hoe brozer de films worden. Om het risico op verlies van de SU-8-films te beperken, moet u ervoor zorgen dat alle planten/monsters en apparatuur in de buurt van de SU-8-films zijn. - Rol voorzichtig een kleine make-upapplicator over de VACNF-film. Markeer de gebieden waar de flexibele substraten worden geplaatst met een marker met zachte punt. Verwijder de flexibele substraten van het plantoppervlak met behulp van tape.
NOTITIE: De hoeveelheid kracht die wordt uitgeoefend bij het rollen van de make-upapplicator varieert tussen de gebruikte plantenweefsels. Oefen met het aanbrengen van de VACNF-films voordat u biomolecuul- of kleurstofafgifte uitvoert. Zichtbare schade aan plantenweefsels is duidelijk wanneer men de contouren van VACNF-film in het plantenweefsel kan zien. - Herhaal stap 5.1-5.3 voor controles en bewaar planten zoals vermeld in stap 3.7 van de plantmethode.
6. Microscopie en beeldanalyse voor alle toedieningsmethoden
- Beeld de monsters af met een confocale microscoop met behulp van emissie- en excitatiegolflengten die geschikt zijn voor de geleverde fluorescerende sonde/reporter.
OPMERKING: De tijd die nodig is voor de transiënte transformatie varieert afhankelijk van de plantensoort en de geleverde marker. Zo werd de expressie van fluorescerende markers na 48 uur gedetecteerd in Arabidopsis versus 96 uur in slablaadjes7. - Probeer bij het maken van beelden scherp te stellen op een gebied met losgemaakte vezels. Vezels hebben verschillende oriëntaties. Het succes van de levering is niet afhankelijk van het verschijnen van afgebroken vezels.
OPMERKING: Vezels zullen fluorescerend zijn met de meest voorkomende excitatie-/emissie-instellingen vanwege de vorming van een siliciumnitridelaag als gevolg van de vezelvorming in PECVD18. - Leg ten minste 5 afbeeldingen vast voor elk monster. Het resulterende signaal zal variëren.
- Meet de fluorescentiewaarden als totale fluorescentie (geïntegreerde dichtheid) in confocale beeldgebieden van 20 μm x 20 μm7 met behulp van ImageJ19.
Representative Results
Het duidelijke voordeel van VACNF-chips op stijve of flexibele substraten is de mogelijkheid om biomoleculen of kleurstoffen af te leveren op specifieke locaties op een plant (Figuur 1). Hier gebruikten we fluorescentie-uitlezingen om de levering te beoordelen. Met behulp van verschillende planten, substraten en toedieningsmethoden (op de chip of op de plant) kunnen er verschillen zijn in de timing van het verschijnen van kleurstof fluoresceïne. Om te bepalen of VACNF-chips/-folies werken voor levering, is een snelle aanpak het gebruik van vezels voor kleurstofafgifte (Figuur 9). Afbeeldingen die in afbeelding 9 met verschillende tijden zijn gelabeld, zijn verschillende gezichtsvelden van dezelfde monsters. Bij gebruik van de methode op de plant kan fluoresceïnekleurstof onmiddellijk na levering worden waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Bovendien, als hetzelfde gezichtsveld in de loop van de tijd wordt afgebeeld na het afleveren van fluoresceïnekleurstof aan een plant, wordt de signaalintensiteit na verloop van tijd minder helder (Figuur 10). De fluoresceïnekleurstof zou zich mogelijk van het gezichtsveld naar andere delen van het blad kunnen verplaatsen via plasmodesmata20,21. Vergeleken met de on-plant-methode, bij de on-chip-methode met vezels op het stijve substraat, beweegt de kleurstof langzamer door het gespietste gebied (Figuur 9). Dit kan het gevolg zijn van het loslaten van de kleurstof van vezels/rehydrateren in de cellen en dus meer tijd nodig heeft om te bewegen.
Vezels in het flexibele substraat waren geschikt voor kleurstofafgifte aan gebogen oppervlakken zoals aardbeien en appels (Figuur 11 en Figuur 12). Met behulp van een flexibel substraat met aardbeien werd meteen een sterk fluoresceïnesignaal waargenomen (Figuur 11), terwijl het 2 uur duurde om een sterk fluoresceïnesignaal te zien in appels (Figuur 12B,D). De succesvolle afgifte van plasmiden die coderen voor fluorescerende markers kan worden bepaald met behulp van fluorescentiemicroscopie om het resulterende signaal te vinden (Figuur 12F, Figuur 13 en Figuur 14). Controles zijn nodig om te bepalen of de plant van keuze geen autofluorescentie heeft die vergelijkbaar is met de fluorescerende marker die we door vezels willen leveren. Het gebruik van vezels alleen is nuttig om te bepalen of de impactkracht die met een pincet wordt uitgeoefend resulteert in schade aan het plantenweefsel of dat de waargenomen fluorescentie in het monster te wijten is aan de VACNR's, die inherent fluorescerend zijn vanwege hun siliciumnitridelaag18 (Figuur 13C-D). Vezels die in plantenweefsel worden gespietst, induceren geen wondrespons zoals beoordeeld door de productievan H 2 O2 6. Ten slotte is het gebruik van de controle van +DNA, -Vezels nodig om te bevestigen dat DNA niet alleen door tikken de plant binnenkomt en bevestigt dat de vezels nodig zijn voor levering aan plantencellen (Figuur 13E-F). Er zou geen duidelijk verschil moeten zijn bij het gebruik van de toedieningsmethoden op de plant of op de chip met behulp van de VACNF's op een stijf substraat, zoals blijkt uit het ontbreken van een significant verschil in fluorescentiewaarden (figuur 13I). Het gebruik van de flexibele VACNF-films met DNA-afgifte op de chip resulteerde in een succesvolle voorbijgaande transformatie van epidermale cellen in appels en uien die in de winkel werden gekocht (Figuur 12F en Figuur 14).
Mislukte experimenten kunnen vezels hebben afgebroken in verschillende gezichtsvelden, maar er zal geen resulterend fluorescentiesignaal zijn van de poging om plasmide-DNA of kleurstof af te leveren. Als er te veel druk op de plant wordt uitgeoefend, zal er zichtbare weefselschade zijn (figuur 15). Deze mechanische schade kan eruitzien als kleine gaatjes of transparante gebieden in de plant, alsof er een laag cellen is verwijderd wanneer de plant onder een microscoop wordt bekeken. Soms zijn afdrukken van de chip zichtbaar. Een experiment waarbij fluorescerende eiwitexpressie niet wordt gedetecteerd na DNA-afgifte, kan ook te wijten zijn aan het gebruik van DNA van lage kwaliteit, dus het kan nuttig zijn om vers DNA te bereiden.
Figuur 1: Schema van de afgifte van kleurstof/DNA aan plantenweefsel met behulp van vezels op stijve en flexibele substraten . (A) On-plantaardige, vezelgemedieerde kleurstof/DNA-afgifte. Een druppel kleurstof/DNA-oplossing van 1 μL wordt op het oppervlak van een blad geplaatst en de VACNF-chip wordt bovenop de druppel geplaatst. Met behulp van een pincet wordt de chip voorzichtig in het weefsel getikt. Het stijve substraat wordt verwijderd, waardoor nanovezels in het weefsel achterblijven. (B) On-chip vezel-gemedieerde DNA-afgifte. Een druppel kleurstof of DNA-oplossing van 1 μl wordt op de VACNF-chip gegoten en gedurende 15 minuten gedroogd. De chip met halfgedroogd DNA wordt bovenop het bladoppervlak geplaatst en in het weefsel getapt zoals in paneel A. (C) DNA-afgifte op chip van SU-8-film. Vezels worden overgebracht van het stijve siliciumsubstraat naar de flexibele SU-8-rug. Een druppel kleurstof/DNA-oplossing van 1 μl wordt op de VACNF-film gegoten en gedurende 10 minuten gedroogd. De VACNF-film met de halfgedroogde kleurstof/DNA wordt vervolgens met behulp van een make-upapplicator op een gebogen plantoppervlak gerold. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow voor het maken van verticaal uitgelijnde koolstofnanovezelarrays. Om VACNF's te produceren, wordt een dubbele laag polymethylmethacrylaat (PMMA 495 A4 gevolgd door PMMA 950 A2) op een siliciumwafer gespind. Elektronenbundellithografie wordt gebruikt om een reeks punten met een diameter van 300 nm te definiëren. De resist wordt vervolgens ontwikkeld in methylisobutylketon/isopropanol (MIBK/IPA), 1:3 gedurende 1,5 min. Met behulp van een metaalverdamper wordt een kleeflaag Ti (10 nm) op de wafer aangebracht, gevolgd door een laag Ni (130 nm of 150 nm). De resterende weerstand wordt vervolgens verwijderd via lift-off (badsonicatie in aceton). De geometrie van katalysatorpunten wordt geïnspecteerd via SEM. Als de katalysatoren op hockeypucks lijken en plat zijn, worden ze in de plasma-verbeterde chemische dampafzettingsmachine (PECVD) geplaatst en worden vezels gekweekt. De vezels werden vervolgens geïnspecteerd met behulp van SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: SEM-beelden van ideale verticaal uitgelijnde koolstofnanovezels . (A) Elektronenmicrofoto van VACNF's met een pitch van ~35 μm en een hoogte van 10-15 μm, afgebeeld onder een hoek van 30°. Deze afbeelding is gedupliceerd in figuur 7C. (B) Elektronenmicrofoto van VANCF's met een pitch van ~20 μm en een hoogte van 20-30 μm, en afgebeeld onder een hoek van 30°. (C) Elektronenmicrofoto van VANCF's met een pitch van ~35 μm, een hoogte van 50-60 μm en afgebeeld onder een hoek van 30°. (D) Elektronenmicrofoto van de VACNF-tip met een diameter <200 nm. Er is variatie in de diameters van de vezeltip (150-300 nm). Omdat de vezels onder een hoek van 30° zijn afgebeeld, lijken de hoogten een factor kleiner te zijn dan de werkelijke hoogte (30°)=1/2. Panelen A en B zijn herdrukt met toestemming van Morgan et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: SEM-beelden van de katalysatorgeometrie voorafgaand aan de groei van VACNF's. (A) SEM-beeld van de katalysator na het opstijgen. Merk op dat fotoresist aanwezig is rond de rand van de katalysator, wat resulteert in een vulkaanvorm. (B,C) SEM-beelden tonen de vulkaanvormen van de katalysator na gebruik van een enkellaagse PMMA-resist. (D) Gewenste hockeypuckkatalysatorvorm gemaakt van dubbele lagen PMMA. Omdat de vezels in panelen A, B en D onder een hoek van 30° zijn afgebeeld, lijken de hoogten een factor van sin(30°) = 1/2 kleiner te zijn dan de werkelijke hoogte. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effect van de grootte van de katalysatorpunt op de vezelgroei: Om de optimale diameter van het katalysatormateriaal vast te stellen, werden vezels gekweekt uit puntgroottes variërend van 200-600 nm. Puntgroottes variërend van 400-600 nm leidden tot ontvochtiging van de katalysator en de groei van meerdere vezels. De beste vezelgeometrie werd geproduceerd door een diameter van 300 nm. Kleinere stippen leidden tot onvoldoende vezelhoogte. Vanwege het feit dat de vezels onder een hoek van 30° werden afgebeeld, lijken de hoogten kleiner te zijn dan de werkelijke hoogte met een factor van sin(30°) = 1/2. De beelden werden gemaakt met behulp van scanning-elektronenmicrofoto's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Schematische illustratie van het gelijkstroom-plasma enhanced chemical vapor deposition (dc-PECVD) systeem dat wordt gebruikt in het Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Het douanesysteem bij ORNL heeft een grote douchekop die als reactor voor voedingsgassen en output voor plasma dient. De douchekop werd op een gelijkstroompotentiaal van 300 V gehouden ten opzichte van de verwarmde trap voor de ondergrond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Workflow voor het overbrengen van vezels van een stijf substraat naar een flexibel substraat. Na nanovezelsynthese en inspectie wordt elke wafer gespind met SU-8 2015 bij 4000 tpm gedurende 45 s. De wafel wordt vervolgens 3 minuten zacht gebakken op 95 °C. Vervolgens wordt de wafer blootgesteld aan UV-licht en gevormd in een maskeruitlijner met een snelheid van 95 mJ/cm2. Na 6 minuten nabakken op 95 °C wordt de wafer gedurende 15 s in de SU-8-ontwikkelaar ontwikkeld, gespoeld met IPA en gedroogd metN2-gas . Een beschermende weerstandslaag van SPR 955 CM 0,7 wordt bij 3000 rpm op de wafer gecentrifugeerd en gedurende 30 s op 90 °C gesoftbakken. Vervolgens wordt een siliciumoxidelaag (2-3 nm) aan de wafer toegevoegd via atomaire laagafzetting (ALD) (22 cycli bij 100 °C) om het flexibele substraat hydrofiel15 te maken. De wafer wordt vervolgens met een snijzaag in vierkanten van 3 mm x 3 mm gesneden. Op het moment van gebruik worden individuele chips in aceton geplaatst totdat SU-8 begint te krullen en concaaf wordt (>30 min). Op dit moment kan de SU-8-laag op de meeste chips aan de rand worden vastgepakt met een scherp pincet en van het onderliggende siliciumsubstraat worden gepeld als een intacte vierkante film van 3 mm. De film wordt vervolgens achtereenvolgens gedurende 5 minuten in IPA en water gewassen en onmiddellijk gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: SEM-beelden van vezeloverdracht van een stijf substraat naar een flexibel substraat. De getoonde afbeeldingen zijn representatief, maar komen uit verschillende steekproeven. (A) Lange vezels na PECVD-groei (zelfde afbeelding als in figuur 2C). (B,C) Vezels na toepassing van SU-8. De epoxy welt op rond de basis van vezels. De blootgestelde vezellengte varieerde van 5 μm tot 30 μm. (D) Vezels die na het opstijgen in Su-8 waren ingebed, behielden hun geometrie. Vanwege het feit dat de vezels onder een hoek van 30° zijn afgebeeld, lijken de hoogten een factor van sin(30°)=1/2 kleiner te zijn dan de werkelijke hoogte. Paneel A is herdrukt met toestemming van Morgan et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Kleurstofafgifte aan Arabidopsis-bladeren met behulp van on-chip en on-plant-methoden met vezels op stijve substraten. (A-P) Beelden werden verkregen met behulp van confocale microscopie. On-chip methode (A-H): 1 μL van 10 μM fluoresceïnekleurstof werd gedurende 15 minuten gedroogd op VACNF-chips en vervolgens werden de chips met een pincet in de abaxiale zijde van Arabidopsis-bladeren getikt. (A-D) Bladeren afgebeeld binnen 5-15 minuten na levering. (E-H) Bladeren afgebeeld 1 uur na levering. (A,E) +kleurstof, +vezels. Controles: (B,F) -kleurstof, -vezels; (C,G) -kleurstof, +vezels; (D,H) +kleurstof, -vezels. (I-P) Methode op de plant: 1 μL 10 μM fluoresceïnekleurstof werd op het plantoppervlak geplaatst, chips werden zo geplaatst dat ze in contact kwamen met de druppel en een pincet werd gebruikt om de chip in de abaxiale kant van Arabidopsis-bladeren te tikken. (I-L) afgebeeld binnen 5-15 minuten na levering en (MP) 1 uur na levering. (I,M) +kleurstof, +vezels. Controles: (J,N) -kleurstof, -vezels; (K,O) -kleurstof, +vezels; (L,P) +kleurstof, -vezels. Panelen A-P zijn enkelvoudige vlakke afbeeldingen van z-stacks. Schaalbalken zijn 20 μm. Vezels hebben een pitch van 35 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Tijdsverloop van kleurstofafgifte in Arabidopsis via de on-plant-methode met stijf substraat. Beelden werden verkregen met behulp van confocale microscopie. Met behulp van de on-plant-methode werd 1 μL druppel fluoresceïne-kleurstofoplossing (10 μM) op het oppervlak van een blad geplaatst en werd de VACNF-chip bovenop de druppel geplaatst. Met behulp van een pincet werd de chip voorzichtig in het weefsel getikt. +Dye, +Fibers-afbeeldingen van hetzelfde gebied werden elke 5 minuten gemaakt. Schaalbalken zijn 20 μm. Vezels hebben een pitch van 35 μm. Panelen zijn enkelvoudige vlakke afbeeldingen van z-stacks. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Kleurstofafgifte aan aardbeifruit met behulp van VACNF-films. (A-H) Beelden werden verkregen met behulp van confocale microscopie. Met behulp van de on-chip-methode werden kleurstofdruppels gedroogd op VACNF-films, die vervolgens met een make-upapplicator op fruitoppervlakken werden gerold. Fluoresceïnekleurstof (10 μM) werd aan aardbeicellen toegediend en in beeld gebracht na (A) 10 minuten en (B) 1 uur. (C,D) Geen behandelingscontroles (-kleurstof, -vezels). (E,F) -Kleurstof, +Vezels controles na respectievelijk 10 min en 1 uur. (G,H) +Kleurstof, -Vezels controles na respectievelijk 10 min en 1 uur. De schaalbalken zijn 40 μm. Panelen A-H zijn maximale projecties van 188 μm z-stacks. Vezels hebben een pitch van 35 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Kleurstofafgifte en transiënte transformatie van appels via VACNF-films. (A-F) Beelden werden gegenereerd met behulp van confocale microscopie. Met behulp van de on-chip-methode werden druppeltjes fluoresceïnekleurstof van 1 μL (10 μM, B en D) of 1 μL plasmide dat codeert voor pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) gedroogd op VACNF-films, die vervolgens met behulp van een make-upapplicator op fruitoppervlakken werden gerold. Fluoresceïnekleurstof werd afgeleverd op de epidermis van de appel en in beeld gebracht na (B) 10 minuten en (D) 2 uur. (D) Het duurde enige tijd voordat de kleurstof na de bevalling in de cellen was gediffundeerd. DNA-YFP-afgifte en expressie via VACNF-films na (F) 48 uur. (A,C,E) geen behandelingscontroles (-kleurstof/DNA-YFP, -vezels). De schaalbalken zijn 40 μm. Panelen A-D zijn enkelvoudige vlakke afbeeldingen van z-stacks. Panelen E en F zijn de maximale projectie van 53 μm z-stacks. De vezelsteek is 35 μm. Pijlen duiden fluoresceïne- of YFP-signalen aan. * geeft vezels aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Voorbijgaande transformatie van Arabidopsis-bladeren met behulp van on-plant of on-chip VACNFs-methoden. (EEN-H) Beelden werden verkregen met behulp van confocale microscopie 48 uur na DNA-afgifte. (A,C,E,G) Methode op de plant: 1 μL plasmide dat codeert voor pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) werd op de abaxiale zijde van Arabidopsis-bladeren geplaatst. Chips werden zo geplaatst dat ze in contact kwamen met de druppel en een pincet werd gebruikt om de chip in bladweefsel te tikken. (B,D,F,H) On-chip methode: 1 μL DNA−YFP (200 ng) werd gedurende 15 minuten gedroogd op VACNF-chips en vervolgens werden de chips met een pincet in de abaxiale zijde van Arabidopsis-bladeren getikt. +DNA-YFP, +Vezels voor (A) on-plant en (B) on-chip. Controles: (C,D) -DNA-YFP, + vezels; (E,F) +DNA-YFP, -vezels; en (G,H) -DNA, −Vezels. (I) Grafiek van de relatieve gemiddelde fluorescentiesignaalintensiteit van 25 20 × 20 μm gebieden van beelden van 5 biologische replicaten gecombineerd uit 2-3 experimenten met fluorescentie van het YFP-kanaal. Regio's met huidmondjes (*) werden uitgesloten vanwege autofluorescentie. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de -DNA-YFP, -Fibers-conditie werd afgetrokken van elk gemiddelde. 2-weg ANOVA (en Tukey-test) werd gebruikt voor significantietests, en foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Verschillende letters laten significante verschillen zien tussen behandelingen (P < 0,0001). Alle getoonde beelden zijn maximale projecties van 40 μm z−stacks. Schaalbalken zijn 20 μm. Witte pijlen geven vezels aan in de afbeeldingen. De vezelsteek is 35 μm. Deze figuur is overgenomen met toestemming van Morgan et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 14: Tijdelijke transformatie van uien met behulp van VACNF-folies. Beelden werden verkregen met behulp van confocale microscopie 48 uur na DNA-afgifte. Met behulp van de on-chip-methode werden 1 μL plasmide-DNA dat codeert voor pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) druppeltjes gedurende10 minuten gedroogd op VACNF-films, die vervolgens op het oppervlak van plantenorganen werden gerold. (A) DNA-YFP werd afgeleverd aan, en YFP werd tot expressie gebracht in de epidermis van de ui. (B) Geen controle op de behandeling; (C) controle (+DNA-YFP, -Vezels) en (D) controle (-DNA-YFP, +Vezels). De schaalbalken zijn 40 μm. Vezels hebben een pitch van 35 μm. Beelden zijn maximale projecties van 115 μm z-stacks. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 15: Weefselschade in sla door toepassing van VACNF-film . (A-D) Beelden werden gegenereerd met behulp van confocale microscopie. (A) De on-chip-methode werd gebruikt om DNA via VACNF-films aan slabladeren af te leveren. pUBQ 10:YFP DNA-druppeltjes (200 ng) werden gedurende10 minuten gedroogd op VACNF-films, die vervolgens op de abaxiale zijde van losgemaakte slabladeren werden gerold en gedurende 4 dagen in een vochtigheidskamer werden bewaard. (B) controle (-DNA-YFP, +Vezels). (C) controle (+DNA-YFP, -Vezels), en (D) geen behandeling (-DNA-YFP, -Vezels). Schaalbalken zijn 40 μm. VACNF's hebben een toonhoogte van 35 μm. Pijlen wijzen op plantschade als gevolg van het rollen van het flexibele substraat met te veel kracht. Merk op dat succesvolle VACNF-gemedieerde DNA-afgifte in sla werd bereikt in andere experimenten7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 16: Workflow van VACNF-gemedieerde toediening in fabrieken. Controleer in fase I de geometrie van de vezels met behulp van SEM. Voor een goede afgifte hebben vezels een punt nodig met een diameter <200 nm. Als vezels op flexibel substraat worden gebruikt, zou de volgende stap zijn om te bevestigen dat vezels worden overgebracht naar SU-8 en om de hoogte van de blootgestelde vezels via SEM te controleren. In fase II testten we de bruikbaarheid van de vezels door te proberen kleurstof af te geven aan de plant/het orgaan van keuze met behulp van een stijf of flexibel substraat. Gebruik een druppel van 1 μL en plaats deze op het oppervlak van de plant of droog deze kort op de chip/film. Bij deze stap en alle andere stappen is het absoluut noodzakelijk om de juiste controles te gebruiken (-Kleurstof,-Vezels; -Kleurstof, +Vezels; en +Kleurstof,-Vezels) om er zeker van te zijn dat het signaal afkomstig is van bonafide kleurstofafgifte. Bevestig in stadium III dat het betreffende gen aanwezig is in het plasmide, bepaal de concentratie van DNA dat moet worden afgeleverd en test de optimale hoeveelheid tijd na levering om de expressie te controleren. In stadium IV werd de uitkomst geëvalueerd met behulp van confocale microscopie om de expressie van de afgeleverde marker te controleren. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Morgan et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
In dit artikel presenteerden we methoden voor het construeren van verticaal uitgelijnde koolstofnanovezelarrays, het overbrengen van de vezels naar een flexibel substraat en het aanbrengen van vezels in een stijf of flexibel substraat op planten voor gebruik bij de levering van biomoleculen of kleurstoffen aan planten. We beschreven twee algemene benaderingen, de on-chip en de on-plant methode, voor de afzetting van de geïntroduceerde materialen en toonden succesvolle resultaten in vezels op een stijf substraat en de on-chip methode met behulp van VACNF films. De toepassing van deze vezels is in de praktijk en theorie eenvoudiger dan traditionele planttransformatiemethoden (deeltjesbombardement, protoplasttransformatie via PEG of elektroporatie) en kan worden gebruikt voor planten die recalcitrant zijn tegen Agrobacterium-gemedieerde transformatie. Er worden echter maar een paar cellen getransformeerd.
Verticaal uitgelijnde koolstofnanofibers werden geproduceerd bij het Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences via hun gebruikersprogramma. Gebruikers kunnen een aanvraag indienen om deze faciliteit te gebruiken voor de productie van VACNF's. Als alternatief kunnen VACNF-chips worden geproduceerd in cleanrooms met gelijkstroomplasma-versterkte chemische dampafzettingsmachines met een koolstofbron22,23. Met de beschreven methoden zijn er een paar stappen die cruciaal zijn voor de productie van de vezels, vezeloverdracht en toepassing van de VACNF-chips/films. Om vezeltoepassing te laten werken, moeten vezels recht zijn en een taps toelopende diameter hebben van <200 nm aan de punt om afgifte in plantencellen succesvol te laten zijn 6,7 (Figuur 3). Om koolstofnanovezels van een bepaalde grootte en toonhoogte te maken, zijn er verschillende parameters die kunnen worden gewijzigd, waaronder puntgrootte, laterale toonhoogte en de hoeveelheid katalysator die wordt afgezet. Om de optimale puntgrootte te selecteren die moet worden gebruikt voor de productie van koolstofnanovezels, werden vezels gekweekt uit verschillende puntgroottes (zoals weergegeven in figuur 5). We ontdekten dat diameters van 300 nm de beste vezels produceerden, vandaar dat deze puntgrootte werd geselecteerd (Figuur 5). Nadat we de juiste parameters hadden gevonden, hebben we gekeken naar chips met >50% vezels met de ideale geometrie (recht en een tipdiameter <200 nm). Om de geometrie van de vezels te controleren, gebruikten we scanning-elektronenmicroscopie om willekeurige gezichtsvelden op een monster van VACNF-chips/films in beeld te brengen.
Bovendien moeten de vezels een bepaalde minimumlengte hebben om in plantencellen te worden afgeleverd. Het belang van het produceren van vezels van verschillende lengte is dat langere vezels kunnen worden gebruikt om diepere weefsellagen binnen te dringen. Langere vezels (>40 μm lang) zijn essentieel voor flexibele films, omdat de vezeloverdracht werkt door de vezels van hun basis te breken en SU-8 bovenop de vezels moet worden aangebracht. De werkdikte van de SU-8-laag die voor dit protocol wordt gebruikt, is 20-35 μm. De minimale hoogte die nodig is om de afgifte in de epidermis van verschillende planten (gebogen of plat) te bereiken, is 10-15 μm 6,7. Als gevolg hiervan zijn vezels met een lengte >40 μm nodig voor VACNF-films. Er zijn verschillende parameters waarmee rekening moet worden gehouden bij het produceren van koolstofnanovezels: katalysatormateriaal, katalysatorgeometrie, dikte van katalysatormateriaal en omstandigheden in de PECVD-kamer (gasverhouding, druk, temperatuur, stroom, douchekophoogte en groeitijd)8,9,24,25. Om koolstofnanovezels te produceren die langer zijn dan 25 μm die worden gebruikt door Morgan et al.7 en Davern et al.6, hebben we de hoeveelheid Ni-katalysator verhoogd, de acetyleen: ammoniakverhouding gewijzigd en de stroom- en groeitijd verlengd. Daarnaast hebben we meer aandacht besteed aan de geometrie van het katalysatormateriaal. Om hoge rechte vezels te produceren, moest de afgezette katalysator de vorm van een hockeypuck hebben in plaats van een vorm die op een vulkaan lijkt (Figuur 4). Vulkaanstructuren ontstaan uit restanten van fotoresist na het opstijgen. Om de vorming van vulkanen te voorkomen, werd een dubbele laag PMMA gebruikt om een ondersnijding te creëren tijdens elektronenbundellithografie26. De ondersnijding helpt bij het optillen van de afgezette metaalkatalysator (figuur 2). De dikke laag van de katalysator is belangrijk voor de groei van hoge VACNF's. De morfologie van de VACNF's is onderzocht door Merkulova et al.24. De verticale uitlijning van VACNF's is te wijten aan zowel de groei van het Ni-katalysatortiptype als de uitlijning van de DC-potentiaal loodrecht op het substraat (Figuur 6). De douchekop beschrijft de geometrie van de PECVD-reactor (figuur 6) en dient als bron voor de potentiaal van het elektrische veld27.
Om de reeks katalysatorstippen te definiëren met elektronenbundellithografie, pasten we een elektronenbundelweerstand (polymethylmethacrylaat) toe en gebruikten we vervolgens de e-straal om kleine gaatjes in de weerstand te maken met een specifieke vorm en op specifieke locaties op de wafer. Gaten met de gewenste diameter werden op een regelmatig raster geplaatst met de gedefinieerde afstand (pitch) en een bestand met het gewenste patroon werd in de elektronenbundellithografietool geladen voordat het substraat in de machine werd geladen. Naast de vezelhoogte is een andere kritische parameter voor een succesvolle vezeloverdracht de hoeveelheid tijd die in het acetonbad wordt doorgebracht. De VACNF-films moeten lang genoeg in het acetonbad worden gelaten zodat hun randen beginnen te krullen; Als ze te kort in het acetonbad worden gelaten, zijn ze moeilijker van de spanen te tillen en kunnen ze breken. Hoe ouder de chips zijn, hoe langer ze in het acetonbad moeten blijven. Na het acetonbad werden de films/chips in isopropanol en water geplaatst om de toegang tot aceton te verwijderen en om de beschermende fotoresist op de vezels te verwijderen.
Om spincoating uit te voeren, worden wafers of wafer pieces op een vacuümboorkop in de spincoater geplaatst en wordt de centrale positie van de wafer geverifieerd met behulp van de testfunctie van de spincoater. Een kleine plas (~2,5 cm in diameter) resist wordt op het midden van de wafer aangebracht en rondgedraaid (3000 tpm gedurende 45 s) Afbeeldingen van de vezels voor en na het centrifugeren van coating zijn opgenomen in figuur 8 die het behoud van de vezelgeometrie (hoogte, oriëntatie en spoed) laten zien. De aanwezigheid van vezels zorgt ervoor dat weerstand opwelt aan de basis van de vezels en resulteert in dikker dan verwachte lagen. Spin-coating na VACNF-groei is onderzocht door andere groepen11,18.
Een andere stap binnen het proces die van vitaal belang is, is ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid kracht wordt uitgeoefend op VACNF-chips/films. Het afgiftemechanisme is afhankelijk van vezels die kleine gaatjes in de celwanden maken via de impulskracht van het pincet dat op stijve substraten 6,7 tikt of met de mini-make-upapplicator op flexibele substraten rolt. Vezels kunnen al dan niet afbreken en ingebed blijven in plantencellen6,7 zonder invloed op de uitkomst, maar oefening in combinatie met onderzoek naar kleurstofopname en weefselbeschadiging is noodzakelijk om de druk goed te krijgen. Daarnaast is het belangrijk om geschikte beeldvormingstijdstippen te kiezen na DNA-afgifte met VACNF-chips/-films, aangezien de tijd tot detecteerbare expressie varieert tussen plantensoorten en de soorten vectoren die worden afgeleverd7 (Figuur 16).
Hoe breed deze methode ook toepasbaar is op planten, het heeft een paar beperkingen. Het toevoegen van een dunne laag siliciumoxide aan de VACNF-films leidt er bijvoorbeeld niet altijd toe dat films volledig hydrofiel zijn vanwege de beschermende laag fotoresist die bovenop de SU-8 is toegevoegd. Als dit probleem zich voordoet, kunnen dikkere lagen siliciumoxide op VACNF's worden aangebracht. Om te testen of de films hydrofoob of hydrofiel zijn, kunnen ze in water worden geplaatst. Als de films zinken, zijn ze hydrofiel en als ze drijven, zijn ze hydrofoob. Bovendien kan er variatie zijn tussen de geproduceerde batches vezels. Er zijn verschillende parameters die kunnen worden gewijzigd bij het kweken van de vezels in de dc-PECVD-machine; wat in dit protocol wordt beschreven, is een reeks parameters voor twee verschillende hoeveelheden Ni-katalysator. Bovendien kan de kristaloriëntatie van de Ni-katalysator niet worden gecontroleerd28 en zal enige vertakking onvermijdelijk resulteren in de vezels.
Hoewel we voor dit artikel de afgifte van fluoresceïnekleurstof en DNA aan plantencellen hebben aangetoond met behulp van zowel stijve als flexibele substraten, zou de methode breed toepasbaar moeten zijn voor andere biomoleculen en genetische modificatiebenaderingen, bijvoorbeeld RNAi-uitschakeling voor plantensystemen zoals appels of ander fruit waar het jaren zou duren om stabiele transgene lijnen te produceren. Bovendien kunnen deze vezels ook worden gebruikt om genetisch bewerkingsmateriaal te leveren of voor stabiele transformaties in planten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Nanofiber-arrays werden vervaardigd bij het Centrum voor Nanophase Materials Sciences, dat een Department of Energy Office of Science User Facility is (Proposal ID: CNMS2019-103 en CNMS2022-A-1182). Ondersteuning van CNMS wordt toegekend via een collegiaal getoetst voorstelsysteem en wordt gratis verstrekt aan succesvolle aanvragers die van plan zijn hun resultaten te publiceren (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). We danken Kevin Lester en CNMS voor hun hulp bij de productie van nanovezelarrays. We danken Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs en Travis Bee voor kritische discussies over experimenteel ontwerp. Wij danken Dr. Adam Rondinone voor het schema van de PECVD-machine. Met dank aan Leslie Carol voor de wetenschappelijke illustraties. Dit werk werd gefinancierd door het Bioimaging Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104, en United States Department of Agriculture, 2021-67013-34835. JMM werd ondersteund door het Amerikaanse ministerie van landbouw: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
References
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
- Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
- Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).
- Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
- Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).
- Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).
- Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).
- Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).
- Nelson-Fitzpatrick, N. Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).
- Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
- Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A.
- Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).
- Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527 (2011).
- Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
- Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008 (2019).
- Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
- Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crafts, A. S.
- Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
- Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
- Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).
- Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
- Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
- Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
- Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
- Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).
