Summary
Aqui descrevemos métodos para microfabricação de nanofibras de carbono verticalmente alinhadas (VACNFs), transferência de VACNFs para substratos flexíveis e aplicação de VACNFs em substratos rígidos e flexíveis para plantas para entrega de biomoléculas e corantes.
Abstract
A entrega de biomoléculas e corantes impermeáveis a plantas intactas é um grande desafio. Os nanomateriais são ferramentas promissoras para a entrega de DNA às plantas. Por mais empolgantes que essas novas ferramentas sejam, elas ainda não foram amplamente aplicadas. Os nanomateriais fabricados em substrato rígido (suporte) são particularmente difíceis de aplicar com sucesso em estruturas vegetais curvas. Este estudo descreve o processo de microfabricação de arranjos de nanofibras de carbono verticalmente alinhados e transferi-los de um substrato rígido para um substrato flexível. Detalhamos e demonstramos como essas fibras (em substratos rígidos ou flexíveis) podem ser usadas para transformação transitória ou entrega de corantes (por exemplo, fluoresceína) para plantas. Mostramos como os VACNFs podem ser transferidos de substrato rígido de silício para um substrato epóxi flexível SU-8 para formar matrizes flexíveis de VACNF. Para superar a natureza hidrofóbica do SU-8, as fibras do filme flexível foram revestidas com uma fina camada de óxido de silício (2-3 nm). Para usar essas fibras para entrega a órgãos curvos de plantas, depositamos uma gota de 1 μL de corante ou solução de DNA no lado da fibra dos filmes de VACNF, esperamos 10 min, colocamos os filmes no órgão da planta e empregamos um cotonete com um movimento de rolamento para conduzir as fibras para dentro das células vegetais. Com este método, conseguimos a liberação de corante e DNA em órgãos vegetais com superfícies curvas.
Introduction
A transformação vegetal (transitória e estável) ainda não se tornou amplamente alcançável em todos os tecidos e espécies vegetais. A transformação transitória de plantas é um processo pelo qual genes codificados em plasmídeos são temporariamente introduzidos nas plantas, mas não são incorporados de forma estável ao genoma. Métodos tradicionais que usam bombardeamento de partículas, agrobactérias, eletroporação ou tratamento de polietilenoglicol de protoplastos são lentos ou podem ser complicados. Além disso, não são aplicáveis a todas as espécies vegetais 1,2,3,4. O uso de nanomateriais para a entrega de DNA é um campo em expansão que ainda está em sua infância5. Nanomateriais, especificamente nanofibras de carbono, também têm sido usados com sucesso para entregar proteínas, dextrans e corantes às folhas das plantas sem causar resposta a feridas6. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para o uso de um tipo de nanomaterial, nanofibras de carbono, para a entrega de biomoléculas ou corantes às plantas. Aqui, focamos no DNA como a biomolécula de escolha, que permite a transformação transitória de células em vários órgãos vegetais.
Anteriormente, Morgan et al.7 demonstraram o uso de nanofibras de carbono afixadas em substrato rígido de silício para transformar transitoriamente folhas de alface, N. benthamiana e álamo, e folhas e raízes de Arabidopsis. Embora as transformações tenham sido bem-sucedidas em uma variedade de órgãos, as fibras foram mais difíceis de aplicar em tecidos vegetais com superfícies curvas, como raízes ou frutos. Nós raciocinamos que um suporte flexível para nanofibras poderia melhorar sua eficiência de entrega, conformando-se melhor à forma do órgão.
Aqui, detalhamos os métodos utilizados para fabricar e projetar nanofibras de carbono verticalmente alinhadas, transferir VACNFs para substratos flexíveis e aplicar VACNFs em substratos rígidos e flexíveis para plantas para fornecer biomoléculas e corantes. Nanofibras de carbono foram produzidas usando deposição química de vapor reforçada por plasma catalítico de corrente contínua (dc C-PECVD) com catalisador de Ni. A posição, diâmetro e altura dos pontos catalisadores de Ni foram controlados usando uma combinação de litografia por feixe de elétrons, evaporação de metais e processos de decolagem, conforme descrito por Melechko et al.8,9. Usando um resiste de feixe eletrônico de camada dupla, um catalisador de Ni mais espesso pode ser depositado sobre o substrato para dar fibras mais longas10. A transferência de fibras de um substrato rígido para um substrato flexível é baseada em uma modificação dos métodos descritos em Fletcher et al.11, com os métodos atuais prevendo o uso de uma camada amorfa de carbono ou uma camada de fotorresistência sacrificial. A decolagem do SU-8 com transferência de fibras é obtida utilizando-se a tensão de tração intrínseca resultante do subcozimento e subexposição do SU-812,13,14. O SU-8, um polímero complexo, é naturalmente hidrofóbico, o que dificulta seu uso para facilitar a entrega de DNA. Para neutralizar a natureza hidrofóbica do SU-8, aplicamos uma fina camada de óxido de silício via deposição de camada atômica15 depois que as fibras são embutidas no SU-8. A aplicação de fibras em substrato rígido para liberação de biomoléculas/corantes utiliza a força de impacto do macheamento da pinça descrita em Davern et al.6 e os métodos on-plant e on-chip descritos em Morgan et al.7. Filmes flexíveis de VACNF são aplicados em superfícies curvas de plantas por meio de primeiro semi-secagem de DNA ou gotículas de corante sobre o filme, como no método on-chip de Morgan et al.7e, em seguida, rolando os filmes em superfícies curvas de plantas usando um pequeno aplicador de maquiagem16,17. A Figura 1 apresenta várias abordagens para a aplicação de fibras em substratos rígidos e flexíveis às plantas.
Protocol
1. Produção de VACNFs (Figura 2 e Figura 3)
- Spincoat um wafer de silício com polimetilmetacrilato (PMMA) 495 A4 resiste a 4000 rpm e assar a 180 °C por 5 min.
NOTA: Deixe o wafer esfriar por 10 s antes de prosseguir para a próxima etapa. - Espinar uma segunda camada de resiste (PMMA 950 A2) e assar a 180 °C por 5 min.
- Use a litografia por feixe de elétrons para definir os pontos catalisadores com diâmetros de 300 nm em um espaçamento lateral especificado (pitch: 10 μm ou 35 μm) em matrizes de 3 mm x 3 mm.
- Desenvolver o resiste em 30-40 mL de metil-isobutilcetona 1:3: álcool isopropílico (IPA) por 1,5 min, seguido de enxaguar com IPA e secá-lo com N2.
NOTA: Verifique a matriz de pontos usando um microscópio de campo brilhante (objetiva de 20x). - Limpe o wafer do resiste residual com uma exposição de 6 s em plasma de oxigênio (descum) em um condicionador de silício.
- Use a evaporação do feixe de elétrons para depositar primeiro uma camada adesiva de metal (Ti ou Cr, 10 nm) e depois depositar uma segunda camada, que é o catalisador de Ni (130 nm ou 150 nm). Durante a deposição de metal Ti ou Ni, mantenha a corrente abaixo de 0,2 A em 10 kV, a pressão abaixo de 5 x 10-6 Torr e a taxa de deposição em ~1 A/s para deposição de linha de visão.
- Use sonicação de banho sequencial para remover o metal (Ni) depositado na camada de resistência subjacente, deixando o Ni depositado diretamente sobre o wafer de silício. Esse processo é chamado de decolagem.
- Para isso, prepare 3 recipientes com acetona e banho sonicate o wafer em acetona por 1 min; repetir 3 vezes à temperatura ambiente (RT, 20 °C) a uma frequência de 35 kHz. Enxágue com IPA e seque com N2.
OBS: Nunca deixe a acetona secar na bolacha. Após a última sonicação da acetona, enxaguar imediatamente com IPA e secar com gás N2 . Se em algum momento o wafer ficar prematuro seco (antes do enxágue IPA) existe a possibilidade de que nem todo o excesso de metal e resistência seja removido e a acetona possa deixar um resíduo.
- Para isso, prepare 3 recipientes com acetona e banho sonicate o wafer em acetona por 1 min; repetir 3 vezes à temperatura ambiente (RT, 20 °C) a uma frequência de 35 kHz. Enxágue com IPA e seque com N2.
- Verifique a geometria da forma do catalisador usando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para capturar imagens SEM dos chips VACNF, incline o palco para um ângulo de 30° e use uma tensão de 1-3 kV, com uma corrente de feixe de ~100 pA e uma distância de trabalho de ~5 mm.
NOTA: O catalisador deve se parecer com um puck de hóquei (um cilindro compacto) (Figura 4). A altura do cilindro compacto deve refletir a espessura do Ni depositado no wafer de silício. Se o perfil do ponto Ni é alto e parece ser côncavo no topo, assemelhando-se a um vulcão (Figura 4), então o catalisador tem maior probabilidade de desmolhar em múltiplas gotículas de Ni, resultando na ramificação das nanofibras de carbono9 (Figura 4 e Figura 5). Tais problemas podem resultar da resistência à fusão durante a evaporação do metal devido a longos tempos de deposição ou problemas com o procedimento de decolagem (Figura 4 e Figura 5). - Triturar o wafer de silício e colocá-lo na câmara de deposição química de vapor reforçada por plasma de corrente contínua (dc-PECVD) com a mistura acetileno/amônia. Otimizar os parâmetros de crescimento para controlar o comprimento e a conicidade das nanofibras (pontas <200 nm).
- Use uma corrente de 1-1,5 A e uma faixa de tensão de 440-560 V. Ao cultivar as fibras, use uma fase de pré-tratamento com fluxo de amônia enquanto a máquina e o substrato aquecem até 620 °C. Certifique-se de ligar a fonte de carbono (acetileno) 10 s antes de iniciar o plasma.
NOTA: Os wafers quarto são usados caso os parâmetros de execução da máquina PECVD precisem ser otimizados. Para produzir fibras com comprimento superior a 40 μm e pontas inferiores a 200 nm de diâmetro, sugerem-se os seguintes parâmetros: com espessura de catalisador de Ni de 130 nm, utilizar corrente de 1,75 A, tempo de crescimento de 70 min e relação acetileno: amônia de 45 centímetros cúbicos padrão por minuto (sccm): 100 sccm. Com uma espessura de Ni de 150 nm, use uma corrente de 1,5 A, um tempo de crescimento de 80 min, e uma relação acetileno: amônia de 48 sccm: 100 sccm. Use os seguintes parâmetros para cultivar VACNFs, independentemente da espessura do catalisador: temperatura de crescimento de 620 °C, pressão de 10 torr durante o plasma e altura do chuveiro de 20 mm (Figura 6).
- Use uma corrente de 1-1,5 A e uma faixa de tensão de 440-560 V. Ao cultivar as fibras, use uma fase de pré-tratamento com fluxo de amônia enquanto a máquina e o substrato aquecem até 620 °C. Certifique-se de ligar a fonte de carbono (acetileno) 10 s antes de iniciar o plasma.
- Avaliar a geometria das fibras resultantes usando MEV a uma inclinação de 30° com um potencial de aceleração de 1 kV.
NOTA: As fibras ideais serão retas e não ramificadas. É impossível controlar a orientação cristalina do catalisador de Ni com o evaporador de feixe de elétrons. Como resultado, haverá algumas fibras que se ramificam por causa da desumectação do catalisador9. Além disso, a orientação do cristal faz com que os VACNFs cresçam a alturas diferentes, de modo que alturas uniformes em todos os VACNFs são difíceis. - Spincoat uma camada de fotorresiste (SPR955) sobre as fibras a 1000 rpm por 45 s. Em seguida, corte o wafer de 1/4 em matrizes de 3 mm x 3 mm usando uma serra de cubos. Armazene as fibras neste ponto para uso posterior.
NOTA: Não execute a etapa 1.11 se estiver planejando transferir fibras para um substrato flexível.
2. Ttransferindo VACNFs para um substrato flexível (Figura 7 e Figura 8)
- Depois que as fibras são sintetizadas, o spincoat SU-8 2015 fotorresiste nos wafers ou wafers a 4000 rpm por 45 s.
- Asse o wafer por 3 min a 95 °C.
- Usando um alinhador de contato, exponha o wafer com uma máscara padronizada de matriz de 3 mm de 3 mm que se alinha com o padrão definido da litografia por feixe de elétrons a 95 mJ/cm2.
NOTA: Use um modo de contato de proximidade com um intervalo de exposição que é 20 μm maior do que a fibra mais alta. Existe a possibilidade de que as fibras possam ser derrubadas durante essa etapa do processo. - Levar ao forno pós-exposição durante 6 minutos a 95 °C.
- Desenvolva o wafer em revelador SU-8 por 15 s, enxágue-o com IPA e seque o wafer com N2, movendo-o de cima para baixo.
NOTA: Ao desenvolver o wafer, verifique se ele está completamente submerso. - Wafers estampados com spincoat com uma camada protetora de fotorresistência fina (SPR 955 CM 0,7) a 3000 rpm por 45 s e softbake por 30 s a 90 °C.
- Depositar uma fina camada de óxido de silício no wafer (2-3 nm) colocando-o numa deposição de camada atómica durante 22 ciclos a 100 °C.
- Use uma serra de cubos para cortar a bolacha em quadrados de 3 mm x 3 mm. Alinhe a serra de cubos ao padrão preexistente no wafer.
- Avaliar a geometria das fibras resultantes usando MEV a uma inclinação de 30° com um potencial de aceleração de 3 kV.
- Pare aqui se armazenar chips para uso a longo prazo (>1 semana). Guarde as fichas no escuro.
- Para separar substratos flexíveis de substratos rígidos, coloque cavacos individuais em acetona por 30 min ou até que o SU-8 comece a enrolar.
- Lavar os filmes de SU-8 (ligados ou destacados de substratos rígidos) com IPA por 5 min e depois com água por 5 min. Coloque os chips em uma caixa comercial com uma almofada adesiva ao transportá-los.
- OPCIONAL: Coloque o lado sem fibras do filme SU-8 em fita solúvel em água ou sobre borracha fina de silicone com um suporte fino de polietileno tereftalato (PET) (12,5 μm de espessura).
- Use uma pinça para transferir o filme SU-8. Pressione as bordas do quadrado SU-8 para ajudá-lo a grudar na fita/borracha de silicone-PET; Isso é para evitar o rompimento das fibras. Neste ponto, os filmes VACNF estão prontos para uso imediato.
- Para preparar um suporte de borracha de silicone/PET, faça o seguinte: usando um kit de 2 partes para borracha de silicone, misture as duas partes (o elastômero e o reticulante). Em seguida, recorte um quadrado de PET e tape-o em um prato de plástico transparente. Despeje uma camada muito fina de borracha de silicone sobre o PET e cure a 80 °C por 1-2 h.
3. Método na planta (onde uma gota de solução para entregar é colocada em uma superfície de planta) usando fibras em um substrato rígido (Figura 1A)
- Remova o fotorresiste com lavagens incrementais de acetona (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) antes do uso.
- Coloque o tecido vegetal a ser empalado em uma superfície dura para suporte.
- Coloque uma gota de 1 μL de corante ou DNA (200 ng) na superfície do tecido vegetal.
- Coloque um chip VACNF com um substrato rígido na parte superior da gota, com as fibras orientadas de tal forma que entrem em contato com a gota.
NOTA: A orientação dos chips pode ser determinada pelo "brilho" do wafer. O lado brilhante do chip tem fibras, e o lado opaco não. - Usando o lado plano de uma pinça, toque no chip. Marque a área da planta com a qual o chip entrou em contato usando um marcador de ponta macia. Remova os chips VACNF após a entrega.
NOTA: A quantidade de força aplicada ao bater irá variar dependendo do tipo de tecido vegetal utilizado. Recomenda-se praticar a batida de cavacos antes de realizar o empalamento das fibras. Evite danos aos tecidos vegetais. O dano é aparente quando se pode ver o contorno do chip VACNF no tecido vegetal. - Repita as etapas 3.1-3.5 para controles (+Corante/DNA, -Fibras; -Corante/DNA, +Fibras; e -Corante/DNA, -Fibras). -Fibras é o lado sem fibras de um chip.
- Armazenar plantas intactas ou órgãos vegetais excisados em câmaras úmidas em condições de dias longos (16 h claro, 8 h escuro), se necessário. Para órgãos excisados, use uma placa de Petri de plástico com toalhas de papel molhadas.
4. Método on-chip (onde uma gota de solução para entregar é colocada em um chip VACNF), substrato rígido (Figura 1B)
- Remova o fotorresiste com lavagens incrementais de acetona (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) antes do uso.
- Gota de gota de 1 μL de corante ou DNA plasmidial (200 ng) no lado da fibra do chip VACNF com substrato rígido. Certifique-se de colocar a gota no centro do cavaco e cubra várias fibras. Deixe a gota secar por 15 min.
NOTA: A orientação dos chips pode ser determinada pelo "brilho" do wafer. O lado brilhante do chip tem fibras, e o lado opaco não. - Ao trabalhar com folhas ou outros órgãos excisados, coloque-os em cima de uma superfície dura. Ao trabalhar com plantas intactas, coloque uma superfície dura sob o órgão ao qual os VACNFs são aplicados.
- Após a etapa de secagem de 15 min, posicione o chip VACNF de forma que o lado da fibra entre em contato com o tecido vegetal. Toque no chip com a extremidade traseira de uma pinça.
NOTA: A quantidade de força aplicada ao bater irá variar dependendo do tipo de tecido vegetal utilizado. Recomenda-se a prática de bater chips. - Repita as etapas 3.6-3.7 do método na planta.
5. Aplicação de VACNFs em filmes de SU-8 em tecidos vegetais usando o método on-chip (Figura 1C)
- Coloque 1 μL de gota de corante ou DNA (200 ng) no lado da fibra do filme SU-8 e deixe secar por 10 min. Certifique-se de colocar a gota no centro do chip.
OBS: Existem diferentes tempos de secagem dependendo do substrato utilizado. - Usando um par de pinças afiadas, coloque o filme VACNF na superfície da planta.
NOTA: Quanto mais tempo os filmes SU-8 são deixados no ar, mais frágeis os filmes se tornam. Para limitar o risco de perda dos filmes SU-8, certifique-se de ter todas as plantas/amostras e equipamentos perto dos filmes SU-8. - Enrole suavemente um pequeno aplicador de maquiagem sobre a película VACNF. Marque as áreas onde os substratos flexíveis são colocados com um marcador de ponta macia. Remova os substratos flexíveis da superfície da planta usando fita adesiva.
OBS: A quantidade de força aplicada ao enrolar o aplicador de maquiagem irá variar entre os tecidos vegetais utilizados. Pratique a aplicação dos filmes VACNF antes da realização da entrega de biomoléculas ou corantes. Danos visíveis aos tecidos vegetais são aparentes quando se pode ver os contornos do filme VACNF no tecido vegetal. - Repita as etapas 5.1-5.3 para controles e plantas de armazenamento, conforme mencionado na etapa 3.7 do método na planta.
6. Microscopia e análise de imagens para todos os métodos de entrega
- Imageie as amostras usando um microscópio confocal usando comprimentos de onda de emissão e excitação adequados para a sonda/repórter fluorescente entregue.
NOTA: O tempo necessário para a transformação transitória varia de acordo com a espécie vegetal e o marcador entregue. Por exemplo, a expressão de marcadores fluorescentes foi detectada após 48 h em Arabidopsis versus 96 h em folhas de alface7. - Ao fazer imagens, tente focar em uma região com fibras descoladas. As fibras terão diferentes orientações. O sucesso da entrega não depende do aparecimento de fibras quebradas.
NOTA: As fibras serão fluorescentes com os ajustes de excitação/emissão mais comuns devido à formação da camada de nitreto de silício resultante da formação de fibras no PECVD18. - Capture pelo menos 5 imagens para cada amostra. O sinal resultante irá variar.
- Meça os valores de fluorescência como fluorescência total (densidade integrada) em áreas de imagem confocalde 20 μm x 20 μm 7 usando o ImageJ19.
Representative Results
A vantagem distinta dos chips VACNF em substratos rígidos ou flexíveis é a capacidade de entregar biomoléculas ou corantes a locais específicos de uma planta (Figura 1). Aqui, usamos leituras de fluorescência para avaliar a entrega. Usando diferentes plantas, substratos e métodos de entrega (on-chip ou on-plant), pode haver diferenças no tempo do aparecimento do corante fluoresceína. Para determinar se os chips/filmes VACNF funcionam para entrega, uma abordagem rápida é usar fibras para a entrega de corantes (Figura 9). As imagens rotuladas com tempos diferentes na Figura 9 são campos de visão diferentes das mesmas amostras. Ao usar o método na planta, o corante fluoresceína pode ser observado imediatamente após o parto usando microscopia de fluorescência. Além disso, se o mesmo campo de visão é fotografado ao longo do tempo após a entrega de corante fluoresceína a uma planta, a intensidade do sinal torna-se menos brilhante ao longo do tempo (Figura 10). O corante fluoresceína poderia potencialmente estar se movendo do campo de visão para outras áreas da folha através de plasmodesmas20,21. Em comparação com o método on-plant, no método on-chip com fibras sobre o substrato rígido, o corante move-se mais lentamente em toda a área empalada (Figura 9). Isso pode ser resultado do corante se desprender das fibras/reidratar nas células e, assim, levar mais tempo para se mover.
As fibras do substrato flexível foram adequadas para a entrega de corantes em superfícies curvas, como morangos e maçãs (Figura 11 e Figura 12). Usando um substrato flexível com morangos, um forte sinal de fluoresceína foi observado imediatamente (Figura 11), enquanto que levou 2 h para ver um forte sinal de fluoresceína em maçãs (Figura 12B,D). A liberação bem-sucedida de plasmídeos que codificam marcadores fluorescentes pode ser determinada usando microscopia de fluorescência para encontrar o sinal resultante (Figura 12F, Figura 13 e Figura 14). Controles são necessários para determinar se a planta de escolha não tem autofluorescência semelhante ao marcador fluorescente que queremos entregar pelas fibras. O uso isolado de fibras é útil para determinar se a força de impacto aplicada com a pinça resulta em danos ao tecido vegetal ou se a fluorescência observada dentro da amostra é devida aos VACNFs, que são inerentemente fluorescentes por causa de sua camada de nitreto de silício18 (Figura 13C-D). Fibras empaladas no tecido vegetal não induzem resposta à ferida avaliada pela produção de H 2O2 6. Por fim, usando o controle de +DNA, -Fibers é necessário para confirmar que o DNA não está entrando na planta através de toque sozinho e confirma que as fibras são necessárias para a entrega nas células vegetais (Figura 13E-F). Não deve haver diferença distinta ao usar os métodos de entrega on-plant ou on-chip usando os VACNFs em um substrato rígido, como indicado pela ausência de diferença significativa nos valores de fluorescência (Figura 13I). O uso dos filmes flexíveis de VACNF com entrega de DNA on-chip resultou em uma transformação transitória bem-sucedida de células epidérmicas em maçãs e cebolas compradas em lojas (Figura 12F e Figura 14).
Experimentos fracassados podem ter fibras quebradas em diferentes campos de visão, mas não haverá sinal de fluorescência resultante da tentativa de entregar DNA plasmidial ou corante. Se muita pressão for aplicada à planta, haverá dano tecidual aparente (Figura 15). Este dano mecânico pode parecer pequenos buracos ou áreas transparentes na planta, como se uma camada de células tivesse sido removida ao olhar para a planta sob um microscópio. Às vezes, as impressões do chip serão visíveis. Um experimento em que a expressão de proteínas fluorescentes não é detectada após a entrega de DNA também pode ser devido ao uso de DNA de baixa qualidade, por isso pode ser útil para preparar DNA fresco.
Figura 1: Esquema da entrega de corante/DNA ao tecido vegetal utilizando fibras em substratos rígidos e flexíveis . (A) On−plant, corante/entrega de DNA mediado por fibras. Uma gota de 1 μL de corante/solução de DNA é colocada na superfície de uma folha e o chip VACNF é colocado sobre a gota. Usando um par de pinças, o chip é suavemente tocado no tecido. O substrato rígido é removido deixando nanofibras dentro do tecido. (B) Entrega de DNA mediada por fibra on-chip. Uma gota de 1 μL de corante ou solução de DNA é lançada no chip VACNF e seca por 15 min. O chip com DNA semiseco é colocado sobre a superfície da folha e aproveitado no tecido como no painel A. (C) Entrega de DNA de filme SU-8 no chip. As fibras são transferidas do substrato rígido de silício para o suporte flexível SU-8. Uma gota de 1 μL de corante/solução de DNA é lançada no filme VACNF e seca por 10 min. O filme VACNF com o corante/DNA semiseco é então enrolado em uma superfície curva da planta usando um aplicador de maquiagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho para fazer arranjos de nanofibras de carbono verticalmente alinhados. Para produzir VACNFs, uma camada dupla de polimetilmetacrilato (PMMA 495 A4 seguido de PMMA 950 A2) é revestida por spin em um wafer de silício. A litografia por feixe de elétrons é usada para definir uma matriz de pontos de 300 nm de diâmetro. O resiste é então desenvolvido em metil isobutilcetona/isopropanol (MIBK/IPA), 1:3 por 1,5 min. Usando um evaporador metálico, uma camada adesiva de Ti (10 nm) é aplicada ao wafer, seguida por uma camada de Ni (130 nm ou 150 nm). O resiste restante é então removido via lift-off (sonicação do banho em acetona). A geometria dos pontos catalisadores é inspecionada via MEV. Se os catalisadores se assemelham a pucks de hóquei e são planos, eles são colocados na máquina de deposição química de vapor reforçada por plasma (PECVD) e as fibras são cultivadas. As fibras foram então inspecionadas por MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de nanofibras de carbono ideais alinhadas verticalmente . (A) Micrografia eletrônica de VACNFs com passo de ~35 μm e altura de 10-15 μm, fotografada em um ângulo de 30°. Essa imagem está duplicada na Figura 7C. (B) Micrografia eletrônica de VANCFs com pitch de ~20 μm e altura de 20-30 μm, e imageada em um ângulo de 30°. (C) Micrografia eletrônica de VANCFs com ~35 μm de pitch, altura de 50-60 μm e imageada em um ângulo de 30°. (D) Micrografia eletrônica da ponta do VACNF com diâmetro <200 nm. Há variação nos diâmetros das pontas das fibras (150-300 nm). Como as fibras foram fotografadas em ângulo de 30°, as alturas parecem ser menores do que a altura real por um fator de pecado(30°)=1/2. Os painéis A e B foram reimpressos com permissão de Morgan et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens de MEV da geometria do catalisador antes do crescimento dos VACNFs. (A) Imagem de MEV do catalisador após a decolagem. Note que o fotorresiste está presente ao redor da borda do catalisador, resultando em uma forma de vulcão. (B,C) Imagens de MEV mostram as formas vulcânicas do catalisador após o uso de uma resistência de PMMA de camada única. (D) Forma desejada de catalisador de hóquei feito de camadas duplas de PMMA. Como as fibras foram fotografadas em ângulo de 30° nos painéis A, B e D, as alturas parecem ser menores do que a altura real por um fator de pecado(30°) = 1/2. As barras de escala representam 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeito do tamanho do ponto catalisador no crescimento da fibra: Para estabelecer o diâmetro ótimo do material catalisador, as fibras foram cultivadas a partir de tamanhos de pontos que variavam de 200-600 nm. Tamanhos de pontos variando de 400-600 nm levaram à desidratação do catalisador e ao crescimento de múltiplas fibras. A melhor geometria das fibras foi produzida pelo diâmetro de 300 nm. Pontos menores levaram à altura insuficiente da fibra. Devido ao fato de que as fibras foram fotografadas em ângulo de 30°, as alturas parecem ser menores do que a altura real por um fator de pecado(30°) = 1/2. As imagens foram obtidas por meio de micrografia eletrônica de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Ilustração esquemática do sistema de deposição química de vapor intensificado por corrente contínua - plasma (dc-PECVD) usado no Oak Ridge National Laboratory (ORNL). O sistema personalizado na ORNL tem um grande chuveiro que serve como reator para gases de alimentação e saída para plasma. O chuveiro foi mantido em um potencial DC de 300 V em relação ao estádio aquecido para o substrato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Fluxo de trabalho para transferência de fibras de um substrato rígido para um substrato flexível. Após a síntese e inspeção de nanofibras, cada wafer é revestido com spin-coated com SU-8 2015 a 4000 rpm por 45 s. O wafer é então cozido suavemente por 3 min a 95 °C. Em seguida, o wafer é exposto à luz UV e padronizado em um alinhador de máscara a 95 mJ/cm2. Após o pós-cozimento por 6 min a 95 °C, o wafer é desenvolvido no revelador SU-8 por 15 s, enxaguado com IPA e seco com gás N2 . Uma camada protetora de resistência de SPR 955 CM 0,7 é revestida por spin no wafer a 3000 rpm e cozida a 90 °C por 30 s. Uma camada de óxido de silício (2-3 nm) é então adicionada ao wafer via deposição de camada atômica (ALD) (22 ciclos a 100 °C) para tornar o substrato flexível hidrofílico15. O wafer é então cortado em quadrados de 3 mm x 3 mm com uma serra de cubos. No momento do uso, chips individuais são colocados em acetona até que o SU-8 comece a enrolar e se torne côncavo (>30 min). Neste momento, a camada SU-8 na maioria dos chips pode ser agarrada na borda com pinças afiadas e descascada do substrato de silício subjacente como um filme quadrado intacto de 3 mm. O filme é então lavado sucessivamente em IPA e água por 5 min cada e usado imediatamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da transferência de fibras de um substrato rígido para um substrato flexível. As imagens mostradas são representativas, mas provêm de amostras diferentes. (A) Fibras longas após crescimento de PECVD (mesma imagem da Figura 2C). (B,C) Fibras após aplicação de SU-8. O epóxi brota em torno da base das fibras. O comprimento da fibra exposta variou de 5 μm a 30 μm. (D) As fibras embutidas em Su-8 após a decolagem mantiveram sua geometria. Devido ao fato de que as fibras foram fotografadas em ângulo de 30°, as alturas parecem ser menores do que a altura real por um fator de pecado(30°)=1/2. O painel A foi reimpresso com permissão de Morgan et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Entrega de corantes às folhas de Arabidopsis pelos métodos on-chip e on-plant com fibras em substratos rígidos. (A-P) As imagens foram adquiridas por microscopia confocal. Método on-chip (A-H): 1 μL de corante fluoresceína 10 μM foi seco por 15 min em chips VACNF e, em seguida, os chips foram aproveitados no lado abaxial das folhas de Arabidopsis com uma pinça. (A-D) Folhas fotografadas dentro de 5-15 min pós-parto. (E-H) Folhas fotografadas 1 h após o parto. (A,E) +Corante, +Fibras. Controles: (B,F) -Corante, -Fibras; (C,G) -Corante, +Fibras; (D,H) +Corante, -Fibras. (I-P) Método na planta: 1 μL de corante fluoresceína 10 μM foi colocado na superfície da planta, os cavacos foram posicionados de forma que entrassem em contato com a gota e pinças foram usadas para tocar o chip no lado abaxial das folhas de Arabidopsis. (I-L) com imagens dentro de 5-15 min após o parto e (M-P) com imagens 1 h após o parto. (I,M) +Corante, +Fibras. Controles: (J,N) -Corante, -Fibras; (K,O) -Corante, +Fibras; (L,P) +Corante, -Fibras. Os painéis A-P são imagens planares únicas de z-stacks. As barras de escala são de 20 μm. As fibras têm um passo de 35 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Tempo de entrega do corante em Arabidopsis pelo método on-plant com substrato rígido. As imagens foram adquiridas por microscopia confocal. Usando o método na planta, 1 μL de gota de solução corante fluoresceína (10 μM) foi colocada na superfície de uma folha, e o chip VACNF foi colocado sobre a gota. Usando uma pinça, o chip foi suavemente tocado no tecido. Imagens de +Corante, +Fibras da mesma área foram adquiridas a cada 5 min. As barras de escala são de 20 μm. As fibras têm um passo de 35 μm. Os painéis são imagens planares únicas de z-stacks. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Entrega de corante ao fruto do morango utilizando filmes de VACNF. (A-H) As imagens foram adquiridas por microscopia confocal. Usando o método on-chip, gotículas de corante foram secas em filmes de VACNF, que foram então enroladas sobre as superfícies dos frutos usando um aplicador de maquiagem. Corante fluoresceína (10 μM) foi entregue às células de morango e obtido imagens após (A) 10 min e (B) 1 h. (C,D) Nenhum controle de tratamento (-Corante, -Fibras). (E,F) -Corante, +Fibras controles após 10 min e 1 h, respectivamente. (G,H) +Corante, -Controles de fibras após 10 min e 1 h, respectivamente. As barras de escala são de 40 μm. Os painéis A-H são projeções máximas de 188 μm z-stacks. As fibras têm um passo de 35 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Liberação de corantes e transformação transitória de maçãs via filmes de VACNF. (A-F) As imagens foram geradas por microscopia confocal. Usando o método on-chip, gotículas de 1 μL de corante fluoresceína (10 μM, B e D) ou 1 μL de plasmídeo que codifica pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) foram secas em filmes de VACNF, que foram então enrolados sobre as superfícies dos frutos usando um aplicador de maquiagem. O corante fluoresceína foi entregue à epiderme da maçã e obtido após (B) 10 min e (D) 2 h. (D) O corante levou algum tempo para se difundir para as células após o parto. Liberação e expressão de DNA-YFP via filmes de VACNF após (F) 48 h. (A,C,E) sem controles de tratamento (-Corante/DNA-YFP, -Fibras). As barras de escala são de 40 μm. Os painéis A-D são imagens planares únicas de z-stacks. Os painéis E e F são a projeção máxima de 53 μm z-stacks. O passo da fibra é de 35 μm. As setas denotam sinais fluoresceína ou YFP. * indica fibras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: Transformação transitória de folhas de Arabidopsis usando métodos de VACNFs on−plant ou on-chip. (A-H) As imagens foram adquiridas por microscopia confocal 48 h após a entrega do DNA. (A,C,E,G) Método na planta: 1 μL de plasmídeo codificando pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) foi colocado no lado abaxial das folhas de Arabidopsis. Os cavacos foram posicionados de tal forma que entraram em contato com a gotícula, e as pinças usadas para tocar o chip no tecido da folha. (B,D,F,H) Método on-chip: 1 μL de DNA−YFP (200 ng) foi seco por 15 min em chips VACNF e, em seguida, os chips foram batidos no lado abaxial das folhas de Arabidopsis com uma pinça. +DNA-YFP, +Fibras para (A) na planta e (B) no chip. Controles: (C,D) -DNA-YFP, + Fibras; (E,F) +DNA-YFP, -Fibras; e (G,H) -DNA, −Fibras. (I) Gráfico da intensidade de sinal de fluorescência média relativa de áreas de 25 20 × 20 μm a partir de imagens de 5 réplicas biológicas combinadas de 2-3 experimentos usando fluorescência do canal YFP. Regiões contendo estômatos (*) foram excluídas devido à autofluorescência. A intensidade média de fluorescência da condição -DNA-YFP, -Fibras foi subtraída de cada média. ANOVA de 2−way (e teste de Tukey) foi usado para o teste de significância, e barras de erro representam o erro padrão da média. Letras diferentes mostram diferenças significativas entre os tratamentos (P < 0,0001). Todas as imagens mostradas são projeções máximas de 40 μm z−stacks. As barras de escala são de 20 μm. Setas brancas indicam fibras nas imagens. O passo da fibra é de 35 μm. Essa figura foi reimpressa com permissão de Morgan et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14: Transformação transitória de cebola utilizando filmes de VACNF. As imagens foram adquiridas por microscopia confocal 48 h após a entrega do DNA. Usando o método on-chip, gotículas de 1 μL de DNA plasmidial que codifica pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) foram secas em filmes de VACNF por10 min, que foram então enrolados em superfícies de órgãos vegetais. (A) DNA-YFP foi liberado e YFP foi expresso na epiderme da cebola. (B) Nenhum controle de tratamento; (C) controle (+DNA-YFP, -Fibras) e (D) controle (-DNA-YFP, +Fibras). As barras de escala são de 40 μm. As fibras têm um passo de 35 μm. As imagens são projeções máximas de 115 μm z-stacks. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 15: Dano tecidual em alface a partir da aplicação do filme VACNF . (A-D) As imagens foram geradas por microscopia confocal. (A) O método on-chip foi utilizado para entregar DNA às folhas de alface via filmes de VACNF. Gotículas de DNA pUBQ 10:YFP (200 ng) foram secas por10 min em filmes de VACNF, que foram então enrolados na face abaxial das folhas de alface destacadas e armazenados em câmara de umidade por 4 dias. (B) controle (-DNA-YFP, +Fibras). (C) controle (+DNA-YFP, -Fibras) e (D) nenhum tratamento (-DNA-YFP, -Fibras). As barras de escala são de 40 μm. Os VACNFs têm um passo de 35 μm. As setas apontam para danos às plantas resultantes do rolamento do substrato flexível com muita força. Nota-se que a liberação bem-sucedida de DNA mediada por VACNF em alface foi alcançada em outros experimentos7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 16: Fluxo de trabalho da entrega mediada por VACNF nas plantas. Na Etapa I, verificar a geometria das fibras utilizando MEV. Para a entrega adequada, as fibras precisam de uma ponta com diâmetro <200 nm. Se utilizarmos fibras em substrato flexível, o próximo passo seria confirmar que as fibras estão sendo transferidas para o SU-8 e verificar a altura das fibras expostas via MEV. No Estágio II, testamos a utilidade das fibras tentando entregar corante na planta/órgão de escolha usando um substrato rígido ou flexível. Use gota de 1 μL, colocando-a na superfície da planta ou secando-a brevemente no chip/filme. Com esta etapa e todas as outras etapas, é imperativo usar os controles adequados (-Corante,-Fibras; -Corante, +Fibras; e +Corante,-Fibras) para ter certeza de que o sinal vem da entrega de corante de boa-fé . No estágio III, confirme se o gene de interesse está presente no plasmídeo, determine a concentração de DNA a ser entregue e teste a quantidade ideal de tempo após o parto para verificar a expressão. Na etapa IV, o desfecho foi avaliado por microscopia confocal para verificar a expressão do marcador liberado. Esse valor foi modificado com permissão de Morgan et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Neste artigo, apresentamos métodos para construir arranjos de nanofibras de carbono verticalmente alinhados, transferir as fibras para um substrato flexível e aplicar fibras em substrato rígido ou flexível em plantas para uso na entrega de biomoléculas ou corantes às plantas. Nós descrevemos duas abordagens gerais, o método on-chip e o método on-plant, para deposição dos materiais introduzidos e mostramos resultados bem sucedidos em fibras sobre substrato rígido, bem como o método on-chip usando filmes VACNF. A aplicação dessas fibras é mais simples na prática e na teoria do que os métodos tradicionais de transformação vegetal (bombardeio de partículas, transformação de protoplastos via PEG ou eletroporação) e podem ser usadas para plantas recalcitrantes à transformação mediada por Agrobacterium. No entanto, apenas algumas células são transformadas.
Nanofibras de carbono alinhadas verticalmente foram produzidas no Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences por meio de seu programa de usuário. Os usuários podem solicitar o uso dessa facilidade para a produção de VACNFs. Alternativamente, os cavacos VACNF podem ser produzidos em salas limpas com máquinas de deposição de vapor químico reforçadas por plasma de corrente contínua com uma fonte de carbono22,23. Com os métodos descritos, existem algumas etapas que são críticas para a produção das fibras, transferência de fibras e aplicação dos chips/filmes VACNF. Para que a aplicação das fibras funcione, as fibras devem ser retas e ter um diâmetro de afilamento de <200 nm na ponta para que a entrega em células vegetais seja bem-sucedida 6,7 (Figura 3). Para criar nanofibras de carbono de tamanho e passo específicos, há uma variedade de parâmetros que podem ser alterados, incluindo o tamanho do ponto, o passo lateral e a quantidade de catalisador depositado. Para selecionar o tamanho ideal de ponto a ser usado para a produção de nanofibras de carbono, as fibras foram cultivadas a partir de vários tamanhos de pontos (como mostrado na Figura 5). Verificamos que os diâmetros de 300 nm produziram as melhores fibras, por isso este tamanho de ponto foi selecionado (Figura 5). Depois de encontrar os parâmetros corretos, procuramos usar cavacos que tivessem >50% de fibras com geometria ideal (reta e diâmetro de ponta <200 nm). Para verificar a geometria das fibras, utilizou-se microscopia eletrônica de varredura para obter imagens aleatórias de campos de visão em uma amostra de chips/filmes VACNF.
Além disso, as fibras devem ter um certo comprimento mínimo para atingir a entrega dentro das células vegetais. A importância da produção de fibras de diferentes comprimentos é que fibras mais longas poderiam ser usadas para penetrar camadas mais profundas do tecido. Fibras mais longas (>40 μm de comprimento) são essenciais para filmes flexíveis, pois a transferência de fibras funciona quebrando as fibras de sua base e requer camadas de SU-8 sobre as fibras. A espessura de trabalho da camada SU-8 usada para este protocolo é de 20-35 μm. A altura mínima necessária para realizar o parto dentro da epiderme de várias plantas (curvas ou planas) é de 10-15 μm 6,7. Como resultado, fibras com comprimentos >40 μm são necessárias para filmes de VACNF. Existem vários parâmetros diferentes a serem considerados na produção de nanofibras de carbono: material catalisador, geometria do catalisador, espessura do material catalisador, bem como condições dentro da câmara PECVD (relação gás, pressão, temperatura, corrente, altura do chuveiro e tempo de crescimento)8,9,24,25. Para produzir nanofibras de carbono com mais de 25 μm utilizadas por Morgan et al.7 e Davern et al.6, aumentamos a quantidade de catalisador de Ni, alteramos a relação acetileno:amônia e aumentamos a corrente e o tempo de crescimento. Além disso, demos mais atenção à geometria do material catalisador. Para produzir fibras retas altas, o catalisador depositado precisava ter uma forma de puck de hóquei em vez de uma forma que se assemelhasse a um vulcão (Figura 4). Estruturas vulcânicas surgem de restos de fotorresistência após a decolagem. Para evitar a formação de vulcões, uma dupla camada de PMMA foi usada para criar um undercut durante a litografia por feixe de elétrons26. O undercut auxilia na decolagem do catalisador metálico depositado (Figura 2). A camada espessa do catalisador é importante para o crescimento de VACNFs altos. A morfologia dos VACNFs foi examinada por Merkulova et al.24. O alinhamento vertical dos VACNFs é devido tanto ao crescimento da ponta do catalisador de Ni quanto aos alinhamentos do potencial DC perpendicular ao substrato (Figura 6). O chuveiro descreve a geometria do reator PECVD (Figura 6) e serve como fonte para o potencial do campo elétrico27.
Para definir a matriz de pontos catalisadores com litografia por feixe de elétrons, aplicamos um resist de feixe de elétrons (polimetilmetacrilato), em seguida, usamos o feixe eletrônico para fazer pequenos furos no resiste com uma forma específica e em locais específicos no wafer. Os orifícios do diâmetro desejado foram colocados em uma grade regular com o espaçamento definido (pitch) e um arquivo especificando o padrão desejado foi carregado na ferramenta de litografia por feixe de elétrons antes de carregar o substrato na máquina. Além da altura da fibra, outro parâmetro crítico para o sucesso da transferência da fibra é a quantidade de tempo gasto no banho de acetona. Os filmes VACNF precisam ser deixados no banho de acetona por tempo suficiente para que suas bordas comecem a se enrolar; Se forem deixados no banho de acetona por muito pouco tempo, são mais difíceis de retirar as lascas e podem quebrar. Quanto mais velhos forem os chips, mais tempo eles terão que permanecer no banho de acetona. Após o banho de acetona, os filmes/chips foram colocados em isopropanol e água para remover a acetona de acesso, bem como remover o fotorresistente protetor sobre as fibras.
Para realizar o revestimento de spin, wafers ou peças de wafer são colocados em um mandril a vácuo no revestidor de spin, e a posição central do wafer é verificada usando a função de teste do revestidor de spin. Uma pequena poça (~2,5 cm de diâmetro) de resistência é aplicada ao centro do wafer e girada (3000 rpm por 45 s) Imagens das fibras antes e depois do revestimento de spin estão incluídas na Figura 8 mostrando a preservação da geometria das fibras (altura, orientação e pitch). A presença de fibras faz com que a resistência se aflore na base das fibras e resulta em camadas mais espessas do que o esperado. O spin-coating após o crescimento de VACNF tem sido explorado por outros grupos11,18.
Outra etapa dentro do processo que é de vital importância é garantir que a quantidade certa de força seja aplicada aos chips/filmes VACNF. O mecanismo de liberação é dependente de fibras fazendo pequenas perfurações nas paredes celulares através da força de impulso da pinça batendo em substratos rígidos 6,7 ou rolando com o mini-aplicador de maquiagem em substratos flexíveis. As fibras podem ou não se romper e permanecer embutidas nas células vegetais6,7 sem impacto no resultado, mas a prática em conjunto com o exame de captação de corante e dano tecidual é necessária para obter a pressão correta. Além disso, é importante escolher pontos de tempo de imagem apropriados após a entrega do DNA com chips/filmes VACNF, pois o tempo para a expressão detectável varia entre as espécies vegetais e os tipos de vetores que estão sendo liberados7 (Figura 16).
Por mais amplamente aplicável que este método seja às plantas, ele tem algumas limitações. Por exemplo, adicionar uma fina camada de óxido de silício aos filmes VACNF nem sempre resulta em filmes completamente hidrofílicos devido à camada protetora de fotorresistência adicionada sobre o SU-8. Se esse problema se materializar, camadas mais espessas de óxido de silício podem ser aplicadas aos VACNFs. Para testar se os filmes são hidrofóbicos ou hidrofílicos, eles podem ser colocados em água. Se os filmes afundam, são hidrofílicos e, se flutuam, são hidrofóbicos. Além disso, pode haver variação entre os lotes de fibras produzidas. Existem vários parâmetros que podem ser alterados ao crescer as fibras na máquina dc-PECVD; o que é descrito neste protocolo é um conjunto de parâmetros para duas quantidades diferentes de catalisador de Ni. Além disso, a orientação cristalina do catalisador de Ni não pode ser controlada28 e algumas ramificações inevitavelmente resultarão nas fibras.
Embora tenhamos demonstrado a entrega de corante fluoresceína e DNA para células vegetais usando substratos rígidos e flexíveis para este artigo, o método deve ser amplamente aplicável para outras abordagens de biomoléculas e modificação genética, por exemplo, silenciamento de RNAi para sistemas vegetais como maçãs ou outras frutas, onde levaria anos para produzir linhagens transgênicas estáveis. Além disso, essas fibras também podem ser usadas para entregar materiais de edição genética ou para transformações estáveis em plantas.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os arranjos de nanofibras foram fabricados no Center for Nanophase Materials Sciences, que é um Centro de Instalações do Usuário do Departamento de Energia (ID da Proposta: CNMS2019-103 e CNMS2022-A-1182). O apoio da CNMS é concedido por meio de um sistema de propostas revisadas por pares e é fornecido gratuitamente aos candidatos aprovados que pretendem publicar seus resultados (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Agradecemos a Kevin Lester e à CNMS pela assistência na produção de matrizes de nanofibras. Agradecemos ao Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs e Travis Bee pelas discussões críticas sobre design experimental. Agradecemos ao Dr. Adam Rondinone pelo esquema da máquina PECVD. Agradecemos a Leslie Carol pelas ilustrações científicas. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Ciência de Bioimagem, Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Pesquisa Biológica e Ambiental, DE-SC0019104, e Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, 2021-67013-34835. A JMM foi apoiada pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
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