Summary
Qui descriviamo i metodi per la microfabbricazione di nanofibre di carbonio allineate verticalmente (VACNF), il trasferimento di VACNF su substrati flessibili e l'applicazione di VACNF su substrati rigidi e flessibili alle piante per la somministrazione di biomolecole e coloranti.
Abstract
La somministrazione di biomolecole e coloranti impermeabili alle piante intatte è una sfida importante. I nanomateriali sono strumenti emergenti per la consegna del DNA alle piante. Per quanto entusiasmanti siano questi nuovi strumenti, devono ancora essere ampiamente applicati. I nanomateriali fabbricati su substrato rigido (supporto) sono particolarmente difficili da applicare con successo a strutture vegetali curve. Questo studio descrive il processo per la microfabbricazione di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente e il loro trasferimento da un substrato rigido a uno flessibile. Descriviamo in dettaglio e dimostriamo come queste fibre (su substrati rigidi o flessibili) possono essere utilizzate per la trasformazione transitoria o per la somministrazione di coloranti (ad esempio, fluoresceina) alle piante. Mostriamo come i VACNF possono essere trasferiti da un substrato di silicio rigido a un substrato epossidico flessibile SU-8 per formare array VACNF flessibili. Per superare la natura idrofobica del SU-8, le fibre del film flessibile sono state rivestite con un sottile strato di ossido di silicio (2-3 nm). Per utilizzare queste fibre per la somministrazione agli organi vegetali curvi, depositiamo una gocciolina di 1 μL di colorante o soluzione di DNA sul lato della fibra delle pellicole VACNF, attendiamo 10 minuti, posizioniamo le pellicole sull'organo vegetale e impieghiamo un tampone con un movimento rotatorio per guidare le fibre nelle cellule vegetali. Con questo metodo, abbiamo ottenuto la somministrazione di coloranti e DNA in organi vegetali con superfici curve.
Introduction
La trasformazione delle piante (sia transitorie che stabili) deve ancora diventare ampiamente realizzabile in tutti i tessuti e le specie vegetali. La trasformazione transitoria delle piante è un processo mediante il quale i geni codificati nei plasmidi vengono temporaneamente introdotti nelle piante ma non vengono incorporati stabilmente nel genoma. I metodi tradizionali che utilizzano il bombardamento di particelle, gli agrobatteri, l'elettroporazione o il trattamento con glicole polietilenico dei protoplasti sono lenti o possono essere ingombranti. Inoltre, non sono applicabili a tutte le specie vegetali 1,2,3,4. L'uso di nanomateriali per la somministrazione del DNA è un campo fiorente che è ancora agli inizi5. Anche i nanomateriali, in particolare le nanofibre di carbonio, sono stati utilizzati con successo per fornire proteine, destrani e coloranti alle foglie delle piante senza causare la risposta della ferita6. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un tipo di nanomateriale, le nanofibre di carbonio, per la somministrazione di biomolecole o coloranti alle piante. Qui, ci concentriamo sul DNA come biomolecola di scelta, che consente la trasformazione transitoria delle cellule in vari organi vegetali.
In precedenza, Morgan et al.7 hanno dimostrato l'uso di nanofibre di carbonio fissate a substrati rigidi di silicio per trasformare transitoriamente foglie di lattuga, N. benthamiana e pioppo, e sia foglie che radici di Arabidopsis. Sebbene le trasformazioni abbiano avuto successo su una varietà di organi, le fibre sono risultate più difficili da applicare ai tessuti vegetali con superfici curve, come radici o frutti. Abbiamo ragionato sul fatto che un supporto flessibile per le nanofibre potrebbe migliorare la loro efficienza di rilascio conformandosi meglio alla forma dell'organo.
In questo articolo, descriviamo in dettaglio i metodi utilizzati per la fabbricazione e la progettazione di nanofibre di carbonio allineate verticalmente, il trasferimento di VACNF su substrati flessibili e l'applicazione di VACNF su substrati rigidi e flessibili alle piante per fornire biomolecole e coloranti. Le nanofibre di carbonio sono state prodotte utilizzando la deposizione chimica da vapore potenziata da plasma catalitico a corrente continua (dc C-PECVD) con catalizzatore di Ni. La posizione, il diametro e l'altezza dei punti del catalizzatore di Ni sono stati controllati utilizzando una combinazione di litografia a fascio di elettroni, evaporazione del metallo e processi di lift-off come descritto da Melechko et al.8,9. Utilizzando un e-beam resist a doppio strato, un catalizzatore di Ni più spesso può essere depositato sul substrato per ottenere fibre più lunghe10. Il trasferimento di fibre da un substrato rigido a uno flessibile si basa su una modifica dei metodi descritti in Fletcher et al.11, con i metodi attuali che rinunciano all'uso di uno strato di carbonio amorfo o di uno strato di fotoresist sacrificale. Il decollo di SU-8 con trasferimento di fibre si ottiene utilizzando la sollecitazione di trazione intrinseca derivante dalla sottocottura e dalla sottoesposizione del SU-812,13,14. SU-8, un polimero complesso, è naturalmente idrofobo, il che rende difficile il suo utilizzo per facilitare la consegna del DNA. Per contrastare la natura idrofobica del SU-8, applichiamo un sottile strato di ossido di silicio tramite la deposizione dello strato atomico15 dopo che le fibre sono state incorporate nel SU-8. L'applicazione di fibre su un substrato rigido per la somministrazione di biomolecole/coloranti utilizza la forza d'impatto della maschiatura con pinzette descritta in Davern et al.6 e i metodi on-plant e on-chip descritti in Morgan et al.7. I film VACNF flessibili vengono applicati su superfici vegetali curve mediante prima semiessiccazione di DNA o goccioline di colorante sul film come con il metodo on-chip di Morgan et al.7e poi arrotolando i film su superfici vegetali curve utilizzando un piccolo applicatore di trucco16,17. La Figura 1 illustra vari approcci per l'applicazione di fibre in substrati rigidi e flessibili alle piante.
Protocol
1. Produzione di VACNF (Figura 2 e Figura 3)
- Centrifugare un wafer di silicio con polimetilmetacrilato (PMMA) 495 A4 resist a 4000 giri/min e cuocerlo a 180 °C per 5 min.
NOTA: Lasciare raffreddare il wafer per 10 s prima di procedere al passaggio successivo. - Stendere un secondo strato di resist (PMMA 950 A2) e infornare a 180 °C per 5 min.
- Utilizzare la litografia a fascio di elettroni per definire i punti del catalizzatore con diametri di 300 nm a una spaziatura laterale specificata (passo: 10 μm o 35 μm) in array di 3 x 3 mm.
- Sviluppare il resist in 30-40 mL di metil-isobutilchetone 1:3: alcool isopropilico (IPA) per 1,5 minuti, quindi risciacquare con IPA e asciugare con N2.
NOTA: Verificare la presenza della matrice di punti utilizzando un microscopio in campo chiaro (obiettivo 20x). - Pulire il wafer del resist residuo con un'esposizione di 6 s in plasma di ossigeno (descum) in un incisore di silicio.
- Utilizzare l'evaporazione a fascio di elettroni per depositare prima uno strato adesivo di metallo (Ti o Cr, 10 nm) e poi depositare un secondo strato, che è il catalizzatore Ni (130 nm o 150 nm). Durante la deposizione di metalli Ti o Ni, mantenere la corrente al di sotto di 0,2 A a 10 kV, la pressione al di sotto di 5 x 10-6 Torr e la velocità di deposizione a ~1 A/s per la deposizione in linea di vista.
- Utilizzare la sonicazione sequenziale a bagno per rimuovere il metallo (Ni) depositato sullo strato di resist sottostante, lasciando il Ni depositato direttamente sul wafer di silicio. Questo processo è chiamato lift-off.
- Per questo, preparare 3 contenitori con acetone e bagnomarica sonicare il wafer in acetone per 1 min; ripetere 3 volte a temperatura ambiente (RT, 20 °C) alla frequenza di 35 kHz. Risciacquare con alcool isopropilico e asciugare con N2.
NOTA: Non lasciare mai asciugare l'acetone sul wafer. Dopo l'ultima sonicazione con acetone, risciacquare immediatamente con alcool isopropilico e poi asciugare con gas N2 . Se in qualsiasi momento il wafer si asciuga prematuramente (prima del risciacquo con IPA) c'è la possibilità che non tutto il metallo in eccesso e il resist vengano rimossi e l'acetone possa lasciare un residuo.
- Per questo, preparare 3 contenitori con acetone e bagnomarica sonicare il wafer in acetone per 1 min; ripetere 3 volte a temperatura ambiente (RT, 20 °C) alla frequenza di 35 kHz. Risciacquare con alcool isopropilico e asciugare con N2.
- Controllare la geometria della forma del catalizzatore utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per acquisire immagini SEM dei chip VACNF, inclinare il tavolino a un angolo di 30° e utilizzare una tensione di 1-3 kV, con una corrente del fascio di ~100 pA e una distanza di lavoro di ~5 mm.
NOTA: Il catalizzatore dovrebbe assomigliare a un disco da hockey (un cilindro compatto) (Figura 4). L'altezza del cilindro compatto dovrebbe riflettere lo spessore di Ni depositato sul wafer di silicio. Se il profilo del punto di Ni è alto e sembra essere concavo nella parte superiore, simile a un vulcano (Figura 4), allora è più probabile che il catalizzatore si deumidichi in più goccioline di Ni con conseguente ramificazione delle nanofibre di carbonio9 (Figura 4 e Figura 5). Tali problemi possono derivare dalla fusione del resist durante l'evaporazione del metallo a causa dei lunghi tempi di deposizione o di problemi con la procedura di sollevamento (Figura 4 e Figura 5). - Tagliare il wafer di silicio in un quarto e posizionarlo nella camera di deposizione chimica da vapore potenziata al plasma a corrente continua (dc-PECVD) con la miscela acetilene/ammoniaca. Ottimizzare i parametri di crescita per controllare la lunghezza e la conicità delle nanofibre (punte <200 nm).
- Utilizzare una corrente di 1-1,5 A e un intervallo di tensione di 440-560 V. Durante la crescita delle fibre, utilizzare una fase di pretrattamento con flusso di ammoniaca mentre la macchina e il substrato si riscaldano fino a 620 °C. Assicurarsi di accendere la fonte di carbone (acetilene) 10 s prima di avviare il plasma.
NOTA: I quarti di wafer vengono utilizzati nel caso in cui sia necessario ottimizzare i parametri di funzionamento della macchina PECVD. Per produrre fibre con lunghezze superiori a 40 μm e punte di diametro inferiore a 200 nm, si consigliano i seguenti parametri: con uno spessore del catalizzatore Ni di 130 nm, utilizzare una corrente di 1,75 A, un tempo di crescita di 70 min e un rapporto acetilene / ammoniaca di 45 centimetri cubi standard al minuto (sccm) : 100 sccm. Con uno spessore di Ni di 150 nm, utilizzare una corrente di 1,5 A, un tempo di crescita di 80 min e un rapporto acetilene / ammoniaca di 48 sccm : 100 sccm. Utilizzare i seguenti parametri per far crescere i VACNF indipendentemente dallo spessore del catalizzatore: temperatura di crescita di 620 °C, pressione di 10 torr durante il plasma e altezza del soffione della doccia di 20 mm (Figura 6).
- Utilizzare una corrente di 1-1,5 A e un intervallo di tensione di 440-560 V. Durante la crescita delle fibre, utilizzare una fase di pretrattamento con flusso di ammoniaca mentre la macchina e il substrato si riscaldano fino a 620 °C. Assicurarsi di accendere la fonte di carbone (acetilene) 10 s prima di avviare il plasma.
- Valutare la geometria delle fibre risultanti utilizzando SEM con un'inclinazione di 30° con un potenziale di accelerazione di 1 kV.
NOTA: Le fibre ottimali saranno diritte e non ramificate. È impossibile controllare l'orientamento del cristallo del catalizzatore Ni con l'evaporatore a fascio di elettroni. Di conseguenza, ci saranno alcune fibre che si ramificano a causa della deumidificazione del catalizzatore9. Inoltre, l'orientamento dei cristalli fa sì che i VACNF crescano ad altezze diverse, quindi è difficile ottenere altezze uniformi su tutti i VACNF. - Applicare uno strato di fotoresist (SPR955) sulle fibre a 1000 giri/min per 45 secondi. Quindi tagliare a dadini il wafer da 1/4 in matrici di 3 mm x 3 mm usando una sega a cubetti. Conservare le fibre a questo punto per un uso successivo.
NOTA: Non eseguire il passaggio 1.11 se si prevede di trasferire le fibre su un substrato flessibile.
2. Trasferimentodi VACNF su un substrato flessibile (Figura 7 e Figura 8)
- Dopo che le fibre sono state sintetizzate, il fotoresist spincoat SU-8 2015 sui wafer o sui wafer a 4000 giri/min per 45 s.
- Cuocere il wafer per 3 minuti a 95 °C.
- Utilizzando un allineatore di contatto, esporre il wafer con una maschera di matrice da 3 mm e 3 mm che si allinea con il modello definito dalla litografia a fascio di elettroni a 95 mJ/cm2.
NOTA: Utilizzare una modalità di contatto di prossimità con una distanza di esposizione di 20 μm maggiore della fibra più alta. C'è la possibilità che le fibre possano essere rovesciate durante questa fase del processo. - Eseguire una cottura post-esposizione per 6 minuti a 95 °C.
- Sviluppare il wafer nel rivelatore SU-8 per 15 s, sciacquarlo con alcool isopropilico e asciugare il wafer con N2, muovendosi dall'alto verso il basso.
NOTA: Quando si sviluppa il wafer, assicurarsi che sia completamente sommerso. - Wafer a fantasia spincoat con uno strato protettivo di fotoresist sottile (SPR 955 CM 0,7) a 3000 giri/min per 45 s e softbake per 30 s a 90 °C.
- Depositare un sottile strato di ossido di silicio sul wafer (2-3 nm) ponendolo in uno strato atomico di deposizione per 22 cicli a 100 °C.
- Usa una sega a cubetti per tagliare il wafer in quadrati di 3 mm x 3 mm. Allineare la sega a cubetti al motivo preesistente sul wafer.
- Valutare la geometria delle fibre risultanti utilizzando SEM con un'inclinazione di 30° con un potenziale di accelerazione di 3 kV.
- Fermati qui se conservi le patatine per un uso a lungo termine (>1 settimana). Conserva le patatine al buio.
- Per separare i substrati flessibili da quelli rigidi, posizionare i singoli trucioli in acetone per 30 minuti o fino a quando il SU-8 inizia ad arricciarsi.
- Lavare le pellicole SU-8 (attaccate o staccate da substrati rigidi) con alcool isopropilico per 5 minuti e poi con acqua per 5 minuti. Metti le patatine in una scatola commerciale con un tampone adesivo durante il trasporto.
- OPZIONALE: Posizionare il lato senza fibre del film SU-8 su nastro solubile in acqua o sopra una sottile gomma siliconica con un sottile supporto in polietilene tereftalato (PET) (12.5 μm di spessore).
- Usa un paio di pinzette per trasferire la pellicola SU-8. Premere sui bordi del quadrato SU-8 per aiutarlo ad aderire al nastro/gomma siliconica-PET; Questo per evitare di rompere le fibre. A questo punto, le pellicole VACNF sono pronte per l'uso immediato.
- Per preparare un supporto in gomma siliconica/PET, procedere come segue: utilizzando un kit di 2 parti per gomma siliconica, mescolare le due parti insieme (l'elastomero e il reticolante). Quindi, ritaglia un quadrato di PET e fissalo con del nastro adesivo in un piatto di plastica trasparente. Versare uno strato molto sottile di gomma siliconica sopra il PET e polimerizzarlo a 80 °C per 1-2 ore.
3. Metodo su pianta (in cui una goccia di soluzione da erogare viene posizionata su una superficie della pianta) utilizzando fibre in un substrato rigido (Figura 1A)
- Rimuovere il fotoresist con lavaggi incrementali di acetone (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) prima dell'uso.
- Posizionare il tessuto vegetale da impalare su una superficie dura per il supporto.
- Posizionare una gocciolina di 1 μL di colorante o DNA (200 ng) sulla superficie del tessuto vegetale.
- Posizionare un chip VACNF con un substrato rigido sulla parte superiore della gocciolina, con le fibre orientate in modo tale che entrino in contatto con la gocciolina.
NOTA: L'orientamento dei trucioli può essere determinato dalla "lucentezza" del wafer. Il lato lucido del chip ha fibre e il lato opaco no. - Usando il lato piatto di un paio di pinzette, tocca il chip. Segna l'area della pianta con cui il truciolo è entrato in contatto utilizzando un pennarello a punta morbida. Rimuovere i chip VACNF dopo la consegna.
NOTA: La quantità di forza applicata durante la picchiettatura varia a seconda del tipo di tessuto vegetale utilizzato. Si consiglia di esercitarsi a picchiettare i trucioli prima di eseguire l'impalamento delle fibre. Evitare danni ai tessuti vegetali. Il danno è evidente quando si può vedere il contorno del chip VACNF nel tessuto vegetale. - Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.5 per i controlli (+Colorante/DNA, -Fibre; -Colorante/DNA, +Fibre; e -Colorante/DNA, -Fibre). -Le fibre sono il lato senza fibre di un chip.
- Se necessario, conservare le piante intatte o gli organi vegetali asportati in camere umide in condizioni di lunga giornata (16 ore di luce, 8 ore di buio). Per gli organi asportati, utilizzare una capsula di Petri di plastica con carta assorbente bagnata.
4. Metodo su chip (in cui una goccia di soluzione da erogare viene posizionata su un chip VACNF), substrato rigido (Figura 1B)
- Rimuovere il fotoresist con lavaggi incrementali di acetone (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) prima dell'uso.
- Far cadere una goccia di 1 μL di colorante o DNA plasmidico (200 ng) sul lato della fibra del chip VACNF con substrato rigido. Assicurati di posizionare la gocciolina al centro del chip e di coprire diverse fibre. Lasciare asciugare la goccia per 15 min.
NOTA: L'orientamento dei trucioli può essere determinato dalla "lucentezza" del wafer. Il lato lucido del chip ha fibre e il lato opaco no. - Quando si lavora con foglie o altri organi asportati, posizionarli sopra una superficie dura. Quando si lavora con piante intatte, posizionare una superficie dura sotto l'organo su cui vengono applicati i VACNF.
- Dopo la fase di asciugatura di 15 minuti, posizionare il chip VACNF in modo che il lato della fibra entri in contatto con il tessuto vegetale. Picchietta il chip con l'estremità posteriore di un paio di pinzette.
NOTA: La quantità di forza applicata durante la picchiettatura varia a seconda del tipo di tessuto vegetale utilizzato. Si consiglia di esercitarsi a spillare i trucioli. - Ripetere i passaggi 3.6-3.7 del metodo in pianta.
5. Applicazione di VACNF in film SU-8 al tessuto vegetale utilizzando il metodo on-chip (Figura 1C)
- Posizionare 1 μL di gocciolina di colorante o DNA (200 ng) sul lato in fibra del film SU-8 e lasciarlo asciugare per 10 minuti. Assicurati di posizionare la goccia al centro del chip.
NOTA: Ci sono tempi di asciugatura diversi a seconda del substrato utilizzato. - Usando un paio di pinzette affilate, posiziona la pellicola VACNF sulla superficie della pianta.
NOTA: Più a lungo le pellicole SU-8 vengono lasciate in aria, più fragili diventano le pellicole. Per limitare il rischio di perdere le pellicole SU-8, assicurarsi di avere tutti gli impianti/campioni e le attrezzature vicino alle pellicole SU-8. - Stendere delicatamente un piccolo applicatore per il trucco sulla pellicola VACNF. Contrassegnare le aree in cui sono posizionati i substrati flessibili con un pennarello a punta morbida. Rimuovere i substrati flessibili dalla superficie della pianta utilizzando del nastro adesivo.
NOTA: La quantità di forza applicata quando si arrotola l'applicatore per il trucco varia a seconda dei tessuti vegetali utilizzati. Esercitarsi ad applicare i film VACNF prima di eseguire la somministrazione di biomolecole o coloranti. Il danno visibile ai tessuti vegetali è evidente quando si possono vedere i contorni del film VACNF nel tessuto vegetale. - Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.3 per i controlli e conservare le piante come indicato al punto 3.7 del metodo in loco.
6. Microscopia e analisi delle immagini per tutti i metodi di somministrazione
- Visualizzare i campioni utilizzando un microscopio confocale utilizzando lunghezze d'onda di emissione ed eccitazione adatte alla sonda/reporter fluorescente fornita.
NOTA: Il tempo necessario per la trasformazione transitoria varia a seconda della specie vegetale e del marcatore erogato. Ad esempio, l'espressione di marcatori fluorescenti è stata rilevata dopo 48 ore in Arabidopsis rispetto a 96 ore nelle foglie di lattuga7. - Durante l'imaging, cerca di concentrarti su una regione con fibre staccate. Le fibre avranno orientamenti diversi. Il successo della consegna non dipende dalla comparsa di fibre spezzate.
NOTA: Le fibre saranno fluorescenti con le impostazioni di eccitazione/emissione più comuni a causa della formazione di uno strato di nitruro di silicio derivante dalla formazione di fibre in PECVD18. - Cattura almeno 5 immagini per ogni campione. Il segnale risultante varierà.
- Misurare i valori di fluorescenza come fluorescenza totale (densità integrata) in aree di immagine confocali20 μm x 20 μm 7 utilizzando ImageJ19.
Representative Results
Il netto vantaggio dei chip VACNF su substrati rigidi o flessibili è la capacità di fornire biomolecole o coloranti in punti specifici di una pianta (Figura 1). In questo caso, abbiamo utilizzato le letture della fluorescenza per valutare l'erogazione. Utilizzando diverse piante, substrati e metodi di somministrazione (su chip o su pianta), possono esserci differenze nei tempi di comparsa della fluoresceina colorante. Per determinare se i chip/film VACNF funzionano per la consegna, un approccio rapido consiste nell'utilizzare le fibre per la somministrazione del colorante (Figura 9). Le immagini etichettate con tempi diversi nella Figura 9 sono campi visivi diversi dagli stessi campioni. Quando si utilizza il metodo su pianta, il colorante fluoresceina può essere osservato immediatamente dopo il parto utilizzando la microscopia a fluorescenza. Inoltre, se lo stesso campo visivo viene ripreso nel tempo dopo aver somministrato il colorante fluoresceina a una pianta, l'intensità del segnale diventa meno luminosa nel tempo (Figura 10). Il colorante fluoresceina potrebbe potenzialmente spostarsi dal campo visivo ad altre aree della foglia attraverso i plasmodesmi20,21. Rispetto al metodo on-plant, nel metodo on-chip con fibre sul substrato rigido, il colorante si muove più lentamente in tutta l'area impalata (Figura 9). Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che il colorante si stacca dalle fibre/si reidrata nelle cellule e quindi impiega più tempo per muoversi.
Le fibre nel substrato flessibile erano adatte per la somministrazione di colorante a superfici curve come fragole e mele (Figura 11 e Figura 12). Utilizzando un substrato flessibile con fragole, è stato osservato subito un forte segnale di fluoresceina (Figura 11), mentre ci sono volute 2 ore per vedere un forte segnale di fluoresceina nelle mele (Figura 12B,D). Il successo della somministrazione di plasmidi che codificano marcatori fluorescenti può essere determinato utilizzando la microscopia a fluorescenza per trovare il segnale risultante (Figura 12F, Figura 13 e Figura 14). I controlli sono necessari per determinare se la pianta scelta non ha un'autofluorescenza simile al marcatore fluorescente che vogliamo fornire dalle fibre. L'uso delle sole fibre è utile per determinare se la forza d'impatto applicata con le pinzette provoca danni al tessuto vegetale o se la fluorescenza osservata all'interno del campione è dovuta ai VACNF, che sono intrinsecamente fluorescenti a causa del loro strato di nitruro di silicio18 (Figura 13C-D). Le fibre impalate nel tessuto vegetale non inducono la risposta della ferita come valutato dalla produzione diH 2 O2 6. Infine, utilizzando il controllo di +DNA, -Fibers è necessario per confermare che il DNA non sta entrando nella pianta attraverso il solo tapping e conferma che le fibre sono necessarie per la consegna nelle cellule vegetali (Figura 13E-F). Non dovrebbero esserci differenze distinte quando si utilizzano i metodi di somministrazione on-plant o on-chip utilizzando i VACNF su un substrato rigido, come indicato dalla mancanza di differenze significative nei valori di fluorescenza (Figura 13I). L'utilizzo di pellicole flessibili VACNF con rilascio di DNA su chip ha portato a una trasformazione transitoria di successo delle cellule epidermiche in mele e cipolle acquistate in negozio (Figura 12F e Figura 14).
Gli esperimenti falliti possono avere fibre rotte in diversi campi visivi, ma non ci sarà alcun segnale di fluorescenza risultante dal tentativo di fornire DNA plasmidico o colorante. Se viene applicata troppa pressione alla pianta, ci sarà un evidente danno tissutale (Figura 15). Questo danno meccanico può apparire come piccoli fori o aree trasparenti nella pianta, come se uno strato di cellule fosse stato rimosso quando si guarda la pianta al microscopio. A volte saranno visibili le impronte del chip. Un esperimento in cui l'espressione di proteine fluorescenti non viene rilevata dopo la consegna del DNA può anche essere dovuto all'uso di DNA di bassa qualità, quindi può essere utile preparare DNA fresco.
Figura 1: Schema della somministrazione di coloranti/DNA ai tessuti vegetali utilizzando fibre su substrati rigidi e flessibili. (A) Somministrazione di coloranti/DNA mediati da fibre su piante. Una gocciolina da 1 μL di soluzione colorante/DNA viene posizionata sulla superficie di una foglia e il chip VACNF viene posizionato sopra la gocciolina. Usando un paio di pinzette, il chip viene delicatamente picchiettato nel tessuto. Il substrato rigido viene rimosso lasciando nanofibre all'interno del tessuto. (B) Rilascio di DNA mediato da fibre su chip. Una goccia di 1 μL di colorante o soluzione di DNA viene colata a goccia sul chip VACNF ed essiccata per 15 minuti. Il chip con il DNA semiessiccato viene posizionato sopra la superficie fogliare e picchiettato nel tessuto come nel pannello A. (C) Consegna del DNA su pellicola SU-8 su chip. Le fibre vengono trasferite dal substrato di silicio rigido al supporto flessibile SU-8. Una gocciolina da 1 μL di soluzione di colorante/DNA viene gettata a goccia sul film VACNF ed essiccata per 10 minuti. La pellicola VACNF con il colorante/DNA semiessiccato viene quindi arrotolata su una superficie vegetale curva utilizzando un applicatore per il trucco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro per la realizzazione di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente. Per produrre VACNF, un doppio strato di polimetilmetacrilato (PMMA 495 A4 seguito da PMMA 950 A2) viene rivestito in spin su un wafer di silicio. La litografia a fascio di elettroni viene utilizzata per definire una matrice di punti di 300 nm di diametro. Il resist viene quindi sviluppato in metilisobutilico-chetone/isopropanolo (MIBK/IPA), 1:3 per 1,5 min. Utilizzando un evaporatore metallico, uno strato adesivo di Ti (10 nm) viene applicato al wafer, seguito da uno strato di Ni (130 nm o 150 nm). Il resist rimanente viene quindi rimosso tramite lift-off (sonicazione del bagno in acetone). La geometria dei punti catalizzatori viene ispezionata tramite SEM. Se i catalizzatori assomigliano a dischi da hockey e sono piatti, vengono inseriti nella macchina per la deposizione chimica da vapore potenziata al plasma (PECVD) e le fibre vengono coltivate. Le fibre sono state quindi ispezionate con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini SEM di nanofibre di carbonio ideali allineate verticalmente . (A) Micrografia elettronica di VACNF con un passo di ~35 μm e un'altezza di 10-15 μm, ripresa con un angolo di 30°. Questa immagine è duplicata nella Figura 7C. (B) Micrografia elettronica di VNCF con passo di ~20 μm e altezza di 20-30 μm, e ripresa con un angolo di 30°. (C) Micrografia elettronica di VANCF con passo di ~35 μm, altezza 50-60 μm e ripresa con un angolo di 30°. (D) Micrografia elettronica della punta VACNF con diametro <200 nm. C'è una variazione nei diametri della punta della fibra (150-300 nm). Poiché le fibre sono state visualizzate con un angolo di 30°, le altezze sembrano essere inferiori all'altezza effettiva di un fattore di sin(30°)=1/2. I pannelli A e B sono stati ristampati con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini SEM della geometria del catalizzatore prima della crescita dei VACNF. (A) Immagine SEM del catalizzatore dopo il decollo. Si noti che il fotoresist è presente intorno al bordo del catalizzatore, risultando in una forma vulcanica. (B,C) Le immagini SEM mostrano le forme del vulcano del catalizzatore dopo l'utilizzo di un PMMA a strato singolo. (D) Forma desiderata del catalizzatore del disco da hockey realizzato con doppi strati di PMMA. Poiché le fibre sono state visualizzate con un angolo di 30° nei pannelli A, B e D, le altezze sembrano essere inferiori all'altezza effettiva di un fattore di sin(30°) = 1/2. Le barre della scala rappresentano 100 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetto della dimensione del punto del catalizzatore sulla crescita delle fibre: per stabilire il diametro ottimale del materiale del catalizzatore, le fibre sono state coltivate da dimensioni del punto comprese tra 200 e 600 nm. Le dimensioni dei punti che vanno da 400 a 600 nm hanno portato alla deumidificazione del catalizzatore e alla crescita di più fibre. La migliore geometria della fibra è stata prodotta da un diametro di 300 nm. I punti più piccoli portavano a un'altezza della fibra insufficiente. A causa del fatto che le fibre sono state fotografate con un angolo di 30°, le altezze sembrano essere inferiori all'altezza effettiva di un fattore di sin(30°) = 1/2. Le immagini sono state scattate utilizzando la micrografia elettronica a scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Illustrazione schematica del sistema di deposizione chimica da vapore potenziato da corrente continua - plasma (dc-PECVD) utilizzato presso l'Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Il sistema personalizzato all'ORNL ha un grande soffione che funge da reattore per i gas di alimentazione e l'uscita per il plasma. Il soffione è stato mantenuto a un potenziale CC di 300 V rispetto alla fase riscaldata per il substrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Flusso di lavoro per il trasferimento di fibre da un substrato rigido a un substrato flessibile. Dopo la sintesi e l'ispezione delle nanofibre, ogni wafer viene rivestito in spin con SU-8 2015 a 4000 giri/min per 45 secondi. Il wafer viene poi cotto per 3 minuti a 95 °C. Quindi il wafer viene esposto alla luce UV e modellato in un allineatore di maschere a 95 mJ/cm2. Dopo la postcottura per 6 minuti a 95 °C, il wafer viene sviluppato nel rivelatore SU-8 per 15 secondi, risciacquato con alcool isopropilico e asciugato con gas N2 . Uno strato protettivo di SPR 955 CM 0,7 viene rivestito in centrifuga sul wafer a 3000 giri/min e cotto a 90 °C per 30 secondi. Uno strato di ossido di silicio (2-3 nm) viene quindi aggiunto al wafer tramite deposizione di strato atomico (ALD) (22 cicli a 100 °C) per rendere il substrato flessibile idrofilo15. Il wafer viene quindi tagliato a cubetti in quadrati di 3 mm x 3 mm con una sega per cubetti. Al momento dell'uso, i singoli trucioli vengono posti nell'acetone fino a quando SU-8 inizia ad arricciarsi e diventa concavo (>30 min). A questo punto, lo strato SU-8 sulla maggior parte dei chip può essere afferrato sul bordo con pinzette affilate e staccato dal substrato di silicio sottostante come una pellicola quadrata intatta di 3 mm. Il film viene quindi lavato successivamente in alcool isopropilico e acqua per 5 minuti ciascuno e utilizzato immediatamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini SEM del trasferimento di fibre da un substrato rigido a un substrato flessibile. Le immagini mostrate sono rappresentative ma provengono da campioni diversi. (A) Fibre lunghe dopo la crescita di PECVD (stessa immagine della Figura 2C). (B,C) Fibre dopo l'applicazione di SU-8. La resina epossidica sgorga intorno alla base delle fibre. La lunghezza della fibra esposta variava da 5 μm a 30 μm. (D) Le fibre incorporate nel Su-8 dopo il decollo hanno mantenuto la loro geometria. A causa del fatto che le fibre sono state visualizzate con un angolo di 30°, le altezze sembrano essere inferiori all'altezza effettiva di un fattore di sin(30°)=1/2. Il pannello A è stato ristampato con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Somministrazione di colorante alle foglie di Arabidopsis utilizzando metodi on-chip e on-plant con fibre su substrati rigidi. (A-P) Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale. Metodo su chip (A-H): 1 μL di colorante fluoresceina da 10 μM è stato essiccato per 15 minuti su chip VACNF, quindi i chip sono stati picchiettati sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis con una pinzetta. (A-D) Foglie fotografate entro 5-15 minuti dalla consegna. (E-H) Lascia l'immagine 1 ora dopo il parto. (A, E) + Tintura, + Fibre. Controlli: (B,F) -Colorante, -Fibre; (C,G) -Colorante, + Fibre; (D,H) + Tintura, -Fibre. (I-P) Metodo sulla pianta: 1 μL di colorante fluoresceina da 10 μM è stato posizionato sulla superficie della pianta, i trucioli sono stati posizionati in modo tale che entrassero in contatto con la gocciolina e sono state utilizzate pinzette per picchiettare il chip sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis. (I-L) ripreso entro 5-15 minuti dopo il parto e (M-P) ripreso 1 ora dopo il parto. (I,M) +Colorante, +Fibre. Controlli: (J,N) -Colorante, -Fibre; (K,O) -Colorante, +Fibre; (L,P) + Tintura, -Fibre. I pannelli A-P sono immagini planari singole da z-stack. Le barre della scala sono di 20 μm. Le fibre hanno un passo di 35 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Andamento temporale della somministrazione del colorante in Arabidopsis tramite metodo on-plant con substrato rigido. Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale. Utilizzando il metodo on-plant, una gocciolina da 1 μL di soluzione colorante fluoresceina (10 μM) è stata posizionata sulla superficie di una foglia e il chip VACNF è stato posizionato sopra la gocciolina. Usando un paio di pinzette, il chip è stato delicatamente picchiettato sul tessuto. +Dye, +Fibers immagini della stessa area sono state acquisite ogni 5 minuti. Le barre della scala sono di 20 μm. Le fibre hanno un passo di 35 μm. I pannelli sono immagini planari singole da z-stack. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Somministrazione del colorante alla frutta fragola utilizzando pellicole VACNF. (A-H) Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale. Utilizzando il metodo on-chip, le goccioline di colorante sono state essiccate su pellicole VACNF, che sono state poi fatte rotolare sulle superfici dei frutti utilizzando un applicatore per il trucco. Il colorante fluoresceina (10 μM) è stato somministrato alle cellule di fragola e sottoposto a imaging dopo (A) 10 minuti e (B) 1 ora. (C,D) Nessun controllo del trattamento (-Colorante, -Fibre). (E,F) -Controlli coloranti, +fibre dopo 10 minuti e 1 ora, rispettivamente. (G,H) +Colorante, -Fibre controlla rispettivamente dopo 10 minuti e 1 ora. Le barre della scala sono di 40 μm. I pannelli A-H sono proiezioni massime di 188 μm z-stack. Le fibre hanno un passo di 35 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: Rilascio del colorante e trasformazione transitoria delle mele tramite pellicole VACNF. (A-F) Le immagini sono state generate utilizzando la microscopia confocale. Utilizzando il metodo on-chip, goccioline da 1 μL di colorante fluoresceina (10 μM, B e D) o 1 μL di plasmide codificante pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) sono state essiccate su pellicole VACNF, che sono state poi arrotolate sulle superfici dei frutti utilizzando un applicatore per il trucco. Il colorante fluoresceina è stato somministrato all'epidermide della mela e visualizzato dopo (B) 10 minuti e (D) 2 ore. (D) Il colorante ha impiegato un po' di tempo per diffondersi nelle cellule dopo il parto. Rilascio ed espressione di DNA-YFP tramite film VACNF dopo (F) 48 h. (A,C,E) nessun controllo del trattamento (-Dye/DNA-YFP, -Fibres). Le barre della scala sono di 40 μm. I pannelli A-D sono immagini planari singole da z-stack. I pannelli E e F sono la proiezione massima degli z-stack da 53 μm. Il passo della fibra è di 35 μm. Le frecce indicano i segnali di fluoresceina o YFP. * indica le fibre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13: Trasformazione transitoria delle foglie di Arabidopsis utilizzando metodi VACNF su pianta o su chip. (A-H) Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale 48 ore dopo la consegna del DNA. (A,C,E,G) Metodo su pianta: 1 μL di plasmide codificante pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) è stato posizionato sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis. I trucioli sono stati posizionati in modo tale da entrare in contatto con la gocciolina e le pinzette sono state utilizzate per picchiettare il chip nel tessuto fogliare. (B, D, F, H) Metodo su chip: 1 μL di DNA−YFP (200 ng) è stato essiccato per 15 minuti su chip VACNF e poi i trucioli sono stati picchiettati sul lato abassiale delle foglie di Arabidopsis con una pinzetta. +DNA-YFP, +Fibre per (A) on-plant e (B) on-chip. Controlli: (C,D) -DNA-YFP, + fibre; (E,F) +DNA-YFP, -Fibre; e (G,H) -DNA, −Fibre. (I) Grafico dell'intensità media relativa del segnale di fluorescenza di 25, 20 × 20 μm da immagini di 5 repliche biologiche combinate da 2-3 esperimenti utilizzando la fluorescenza dal canale YFP. Le regioni contenenti stomi (*) sono state escluse a causa dell'autofluorescenza. L'intensità media della fluorescenza dalla condizione -DNA-YFP, -Fibre è stata sottratta da ciascuna media. L'ANOVA a 2 vie (e il test di Tukey) è stata utilizzata per il test di significatività e le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Lettere diverse mostrano differenze significative tra i trattamenti (P < 0,0001). Tutte le immagini mostrate sono proiezioni massime di 40 μm z−stacks. Le barre della scala sono di 20 μm. Le frecce bianche indicano le fibre nelle immagini. Il passo della fibra è di 35 μm. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14: Trasformazione transitoria delle cipolle mediante pellicole VACNF. Le immagini sono state acquisite utilizzando la microscopia confocale 48 ore dopo la consegna del DNA. Utilizzando il metodo on-chip, 1 μL di DNA plasmidico codificante pUBQ 10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) goccioline sono state essiccate su pellicole VACNF per10 minuti, che sono state poi arrotolate sulle superfici degli organi vegetali. (A) Il DNA-YFP è stato somministrato e YFP è stato espresso nell'epidermide della cipolla. (B) Nessun controllo del trattamento; (C) controllo (+DNA-YFP, -Fibre) e (D) controllo (-DNA-YFP, +Fibre). Le barre della scala sono di 40 μm. Le fibre hanno un passo di 35 μm. Le immagini sono proiezioni massime di z-stack da 115 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15: Danno tissutale nella lattuga dovuto all'applicazione di pellicola VACNF . (A-D) Le immagini sono state generate utilizzando la microscopia confocale. (A) Il metodo on-chip è stato utilizzato per fornire DNA alle foglie di lattuga tramite pellicole VACNF. Le goccioline di DNA pUBQ 10:YFP (200 ng) sono state essiccate per10 minuti su pellicole VACNF, che sono state poi arrotolate sul lato abassiale delle foglie di lattuga staccate e conservate in una camera di umidità per 4 giorni. (B) controllo (-DNA-YFP, +Fibre). (C) controllo (+DNA-YFP, -Fibre) e (D) nessun trattamento (-DNA-YFP, -Fibre). Le barre della scala sono di 40 μm. I VACNF hanno un passo di 35 μm. Le frecce indicano i danni alle piante derivanti dal rotolamento del substrato flessibile con troppa forza. Si noti che la somministrazione di DNA mediata da VACNF nella lattuga è stata ottenuta con successo in altri esperimenti7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 16: Flusso di lavoro della consegna mediata da VACNF negli impianti. Nella fase I, controllare la geometria delle fibre utilizzando il SEM. Per una corretta erogazione, le fibre hanno bisogno di una punta con un diametro di <200 nm. Se si utilizzano fibre su substrato flessibile, il passo successivo sarebbe quello di confermare che le fibre vengono trasferite a SU-8 e di controllare l'altezza delle fibre esposte tramite SEM. Nella fase II, abbiamo testato l'utilità delle fibre cercando di fornire il colorante nella pianta/organo di scelta utilizzando un substrato rigido o flessibile. Utilizzare una goccia da 1 μL, posizionandola sulla superficie della pianta o asciugandola brevemente sul chip/pellicola. Con questo passaggio e tutti gli altri passaggi, è imperativo utilizzare i controlli appropriati (-Tintura,-Fibre; -Colorante, +Fibre; e +Colorante,-Fibre) per essere sicuri che il segnale provenga da un'erogazione del colorante in buona fede . Nella fase III, confermare che il gene di interesse è presente nel plasmide, determinare la concentrazione di DNA da somministrare e testare la quantità ottimale di tempo dopo il parto per verificare l'espressione. Nella fase IV, l'esito è stato valutato utilizzando la microscopia confocale per verificare l'espressione del marcatore consegnato. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Morgan et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
In questo documento, abbiamo presentato metodi per la costruzione di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente, trasferendo le fibre su un substrato flessibile e applicando fibre in un substrato rigido o flessibile alle piante per l'uso nella consegna di biomolecole o coloranti alle piante. Sono stati descritti due approcci generali, il metodo on-chip e il metodo on-plant, per la deposizione dei materiali introdotti e abbiamo mostrato risultati positivi nelle fibre su un substrato rigido, nonché il metodo on-chip utilizzando film VACNF. L'applicazione di queste fibre è più semplice nella pratica e nella teoria rispetto ai metodi tradizionali di trasformazione delle piante (bombardamento di particelle, trasformazione dei protoplasti tramite PEG o elettroporazione) e può essere utilizzata per piante recalcitranti alla trasformazione mediata da Agrobacterium. Tuttavia, solo poche cellule vengono trasformate.
Le nanofibre di carbonio allineate verticalmente sono state prodotte presso l'Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences attraverso il loro programma utente. Gli utenti possono richiedere l'utilizzo di questa struttura per la produzione di VACNF. In alternativa, i chip VACNF possono essere prodotti in camere bianche con macchine per la deposizione chimica da vapore potenziate al plasma a corrente continua con una fonte di carbonio22,23. Con i metodi descritti, ci sono alcuni passaggi che sono fondamentali per la produzione delle fibre, il trasferimento delle fibre e l'applicazione dei chip/film VACNF. Affinché l'applicazione delle fibre funzioni, le fibre devono essere diritte e avere un diametro di rastremazione di <200 nm sulla punta affinché la somministrazione nelle cellule vegetali abbia successo 6,7 (Figura 3). Per creare nanofibre di carbonio di dimensioni e passo particolari, ci sono una varietà di parametri che possono essere modificati, tra cui la dimensione del punto, il passo laterale e la quantità di catalizzatore depositato. Per selezionare la dimensione ottimale del punto da utilizzare per la produzione di nanofibre di carbonio, le fibre sono state coltivate da varie dimensioni del punto (come mostrato nella Figura 5). Abbiamo scoperto che diametri di 300 nm producevano le fibre migliori, quindi è stata selezionata questa dimensione del punto (Figura 5). Dopo aver trovato i parametri giusti, abbiamo cercato di utilizzare chip che avessero il >50% di fibre con la geometria ideale (dritta e un diametro della punta <200 nm). Per verificare la geometria delle fibre, abbiamo utilizzato la microscopia elettronica a scansione per visualizzare campi visivi casuali su un campione di chip/pellicole VACNF.
Inoltre, le fibre devono avere una certa lunghezza minima per ottenere la consegna all'interno delle cellule vegetali. L'importanza di produrre fibre di diversa lunghezza è che le fibre più lunghe potrebbero essere utilizzate per penetrare negli strati di tessuto più profondi. Le fibre più lunghe (>40 μm di lunghezza) sono essenziali per i film flessibili poiché il trasferimento di fibre funziona rompendo le fibre dalla loro base e richiede la stratificazione di SU-8 sopra le fibre. Lo spessore di lavoro dello strato di SU-8 utilizzato per questo protocollo è di 20-35 μm. L'altezza minima necessaria per realizzare il parto all'interno dell'epidermide di varie piante (curva o piatta) è di 10-15 μm 6,7. Di conseguenza, per i film VACNF sono necessarie fibre con lunghezze >40 μm. Ci sono diversi parametri da considerare quando si producono nanofibre di carbonio: materiale del catalizzatore, geometria del catalizzatore, spessore del materiale del catalizzatore e condizioni all'interno della camera PECVD (rapporto del gas, pressione, temperatura, corrente, altezza del soffione e tempo di crescita)8,9,24,25. Per produrre nanofibre di carbonio più lunghe di 25 μm utilizzate da Morgan et al.7 e Davern et al.6, abbiamo aumentato la quantità di catalizzatore Ni, alterato il rapporto acetilene / ammoniaca e aumentato la corrente e il tempo di crescita. Inoltre, abbiamo prestato maggiore attenzione alla geometria del materiale del catalizzatore. Per produrre fibre alte e diritte, il catalizzatore depositato doveva avere la forma di un disco da hockey piuttosto che una forma che assomigliasse a un vulcano (Figura 4). Le strutture vulcaniche sorgono dai resti di fotoresist dopo il decollo. Per prevenire la formazione di vulcani, è stato utilizzato un doppio strato di PMMA per creare un sottosquadro durante la litografia a fascio di elettroni26. Il sottosquadro facilita il sollevamento del catalizzatore metallico depositato (Figura 2). Lo spesso strato del catalizzatore è importante per la crescita di VACNF alti. La morfologia dei VACNF è stata esaminata da Merkulova et al.24. L'allineamento verticale dei VACNF è dovuto sia alla crescita della punta del catalizzatore di Ni che agli allineamenti del potenziale CC perpendicolare al substrato (Figura 6). Il soffione descrive la geometria del reattore PECVD (Figura 6) e funge da sorgente per il potenziale del campo elettrico27.
Per definire l'array di punti catalizzatori con la litografia a fascio di elettroni, abbiamo applicato un resist a fascio di elettroni (polimetilmetacrilato), quindi abbiamo utilizzato l'e-beam per fare piccoli fori nel resist con una forma specifica e in punti specifici sul wafer. I fori del diametro desiderato sono stati posizionati su una griglia regolare con la spaziatura definita (passo) e un file che specifica il modello desiderato è stato caricato nello strumento di litografia a fascio di elettroni prima di caricare il substrato nella macchina. Oltre all'altezza della fibra, un altro parametro critico per il successo del trasferimento delle fibre è la quantità di tempo trascorso nel bagno di acetone. I film VACNF devono essere lasciati nel bagno di acetone abbastanza a lungo da far sì che i loro bordi inizino ad arricciarsi; Se vengono lasciati nel bagno di acetone per troppo poco tempo, è più difficile sollevare i trucioli e possono rompersi. Più vecchi sono i trucioli, più a lungo dovranno rimanere nel bagno di acetone. Dopo il bagno di acetone, i film/chip sono stati posti in isopropanolo e acqua per rimuovere l'acetone di accesso e per rimuovere il fotoresist protettivo sulle fibre.
Per eseguire lo spin coating, i wafer o i pezzi di wafer vengono posizionati su un mandrino a vuoto nella spin coater e la posizione centrale del wafer viene verificata utilizzando la funzione di test della spin coater. Una piccola pozzanghera (~2,5 cm di diametro) di resist viene applicata al centro del wafer e filata (3000 giri/min per 45 s) Le immagini delle fibre prima e dopo il rivestimento di rotazione sono incluse nella Figura 8 che mostra la conservazione della geometria delle fibre (altezza, orientamento e passo). La presenza di fibre fa sì che la resistenza si accumuli alla base delle fibre e si traduce in strati più spessi del previsto. Lo spin-coating dopo la crescita di VACNF è stato esplorato da altri gruppi11,18.
Un altro passo all'interno del processo che è di vitale importanza è garantire che venga applicata la giusta quantità di forza ai chip/film VACNF. Il meccanismo di rilascio dipende dal fatto che le fibre effettuino piccole perforazioni nelle pareti cellulari tramite la forza d'impulso della pinzetta che picchietta su substrati rigidi 6,7 o che rotola con il mini-applicatore di trucco su substrati flessibili. Le fibre possono o meno rompersi e rimanere incorporate nelle cellule vegetali6,7 senza alcun impatto sul risultato, ma la pratica in combinazione con l'esame per l'assorbimento del colorante e il danno tissutale è necessaria per ottenere la giusta pressione. Inoltre, è importante scegliere i punti temporali di imaging appropriati dopo la somministrazione del DNA con chip/pellicole VACNF, poiché il tempo di espressione rilevabile varia a seconda delle specie vegetali e dei tipi di vettori che vengono rilasciati7 (Figura 16).
Per quanto questo metodo sia ampiamente applicabile alle piante, presenta alcune limitazioni. Ad esempio, l'aggiunta di un sottile strato di ossido di silicio alle pellicole VACNF non sempre comporta che le pellicole siano completamente idrofile a causa dello strato protettivo di fotoresist aggiunto sulla parte superiore del SU-8. Se questo problema si materializza, strati più spessi di ossido di silicio potrebbero essere applicati ai VACNF. Per verificare se le pellicole sono idrofobiche o idrofile, possono essere messe in acqua. Se le pellicole affondano, sono idrofile, e se galleggiano, sono idrofobiche. Inoltre, ci possono essere variazioni tra i lotti di fibre prodotte. Ci sono diversi parametri che possono essere alterati quando si coltivano le fibre nella macchina dc-PECVD; ciò che viene descritto in questo protocollo è un insieme di parametri per due diverse quantità di catalizzatore Ni. Inoltre, l'orientamento del cristallo del catalizzatore Ni non può essere controllato28 e alcune ramificazioni si tradurranno inevitabilmente nelle fibre.
Mentre abbiamo dimostrato la somministrazione di colorante fluoresceina e DNA alle cellule vegetali utilizzando substrati sia rigidi che flessibili, il metodo dovrebbe essere ampiamente applicabile ad altre biomolecole e approcci di modificazione genetica, ad esempio, il silenziamento dell'RNAi per sistemi vegetali come mele o altri frutti in cui ci vorrebbero anni per produrre linee transgeniche stabili. Inoltre, queste fibre potrebbero anche essere utilizzate per fornire materiali di editing genetico o per trasformazioni stabili nelle piante.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli array di nanofibre sono stati fabbricati presso il Centro per le scienze dei materiali di Nanophase, che è un Dipartimento di Energia Office of Science User Facility (ID proposta: CNMS2019-103 e CNMS2022-A-1182). Il supporto del CNMS viene assegnato attraverso un sistema di proposte sottoposto a revisione paritaria ed è fornito gratuitamente ai candidati selezionati che intendono pubblicare i loro risultati (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Ringraziamo Kevin Lester e CNMS per l'assistenza nella produzione di array di nanofibre. Ringraziamo il Dr. John Caughmen, il Dr. Timothy McKnight, la Dr. Amber Webb, Daryl Briggs e Travis Bee per le discussioni critiche sul disegno sperimentale. Ringraziamo il Dr. Adam Rondinone per lo schema della macchina PECVD. Ringraziamo Leslie Carol per le illustrazioni scientifiche. Questo lavoro è stato finanziato dal Bioimaging Science Program, dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, dall'Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 e dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, 2021-67013-34835. JMM è stato supportato dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
References
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