Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Brug af vertikalt justerede kulstofnanofiberarrays på stive eller fleksible substrater til levering af biomolekyler og farvestoffer til planter

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65602
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 3, 3,5, 6, 5, 2
1Biophysical Sciences, The University of Chicago, 2Molecular Genetics and Cell Biology, The University of Chicago, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 4Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 5Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 6Department of Chemistry, East Tennessee State University

Summary

Her beskriver vi metoder til mikrofabrikation af vertikalt justerede kulstofnanofibre (VACNF'er), overførsel af VACNF'er til fleksible substrater og anvendelse af VACNF'er på både stive og fleksible substrater til planter til levering af biomolekyler og farvestoffer.

Abstract

Levering af biomolekyler og uigennemtrængelige farvestoffer til intakte planter er en stor udfordring. Nanomaterialer er kommende værktøjer til levering af DNA til planter. Så spændende som disse nye værktøjer er, er de endnu ikke blevet anvendt i vid udstrækning. Nanomaterialer, der er fremstillet på stift substrat (bagside), er særligt vanskelige at anvende med succes på buede plantestrukturer. Denne undersøgelse beskriver processen til mikrofabrikation af vertikalt justerede kulstofnanofiberarrays og overførsel af dem fra et stift til et fleksibelt substrat. Vi detaljerer og demonstrerer, hvordan disse fibre (på enten stive eller fleksible substrater) kan bruges til forbigående transformation eller farvestof (f.eks. Fluorescein) levering til planter. Vi viser, hvordan VACNF'er kan overføres fra stift siliciumsubstrat til et fleksibelt SU-8 epoxysubstrat for at danne fleksible VACNF-arrays. For at overvinde den hydrofobe karakter af SU-8 blev fibre i den fleksible film belagt med et tyndt siliciumoxidlag (2-3 nm). For at bruge disse fibre til levering til buede planteorganer deponerer vi en 1 μL dråbe farvestof eller DNA-opløsning på fibersiden af VACNF-film, venter 10 minutter, placerer filmene på planteorganet og anvender en vatpind med en rullende bevægelse til at drive fibre ind i planteceller. Med denne metode har vi opnået farvestof- og DNA-levering i planteorganer med buede overflader.

Introduction

Plantetransformation (både forbigående og stabil) er endnu ikke blevet bredt opnåelig i alle plantevæv og arter. Den forbigående transformation af planter er en proces, hvorved gener kodet i plasmider midlertidigt indføres i planter, men ikke stabilt inkorporeres i genomet. Traditionelle metoder, der bruger partikelbombardement, agrobakterier, elektroporation eller polyethylenglycolbehandling af protoplaster, er langsomme eller kan være besværlige. Desuden gælder de ikke for alle plantearter 1,2,3,4. Anvendelsen af nanomaterialer til DNA-levering er et spirende felt, der stadig er i sin vorden5. Nanomaterialer, især kulstofnanofibre, er også med succes blevet brugt til at levere proteiner, dextrans og farvestoffer til planteblade uden at forårsage sårrespons6. Målet med dette arbejde er at tilvejebringe en detaljeret protokol for anvendelse af en type nanomateriale, kulstofnanofibre, til levering af biomolekyler eller farvestoffer til planter. Her fokuserer vi på DNA som det foretrukne biomolekyle, der tillader forbigående transformation af celler i forskellige planteorganer.

Tidligere demonstrerede Morgan et al.7 brugen af kulstofnanofibre fastgjort til stift siliciumsubstrat til forbigående at omdanne blade af salat, N. benthamiana og poppel og både blade og rødder af Arabidopsis. Selvom transformationer var vellykkede på en række organer, var fibre vanskeligere at anvende på plantevæv med buede overflader, såsom rødder eller frugter. Vi ræsonnerede, at en fleksibel bagside til nanofibre kunne forbedre deres effektivitet ved at tilpasse sig bedre til organets form.

Heri beskriver vi metoder, der anvendes til fremstilling og design af vertikalt justerede kulstofnanofibre, overførsel af VACNF'er til fleksible substrater og anvendelse af VACNF'er på både stive og fleksible substrater til planter for at levere biomolekyler og farvestoffer. Kulstofnanofibre blev fremstillet ved hjælp af jævnstrømskatalytisk plasmaforstærket kemisk dampaflejring (dc C-PECVD) med Ni-katalysator. Positionen, diameteren og højden af Ni-katalysatorprikker blev kontrolleret ved hjælp af en kombination af elektronstrålelitografi, metalfordampning og løfteprocesser som beskrevet af Melechko et al.8,9. Ved hjælp af en dobbeltlags e-strålemodstand kan en tykkere Ni-katalysator deponeres på substratet for at give længere fibre10. Fiberoverførsel fra et stift til et fleksibelt substrat er baseret på en modifikation af metoder beskrevet i Fletcher et al.11, hvor de nuværende metoder går forud for brugen af et amorft kulstoflag eller et offerfotoresistlag. SU-8 lift-off med fiberoverførsel opnås ved at udnytte den iboende trækspænding som følge af underbagning og undereksponering af SU-812,13,14. SU-8, en kompleks polymer, er naturligt hydrofob, hvilket gør dens anvendelse til at lette DNA-levering vanskelig. For at modvirke den hydrofobe natur af SU-8 anvender vi et tyndt lag siliciumoxid via atomlagsaflejring15, efter at fibre er indlejret i SU-8. Anvendelse af fibre på et stift substrat til levering af biomolekyler / farvestof udnytter slagkraften fra pincettapning beskrevet i Davern et al.6 og on-plant og on-chip metoderne beskrevet i Morgan et al.7. Fleksible VACNF-film påføres buede planteoverflader ved først at halvtørre DNA- eller farvestofdråber på filmen som med on-chip-metoden fra Morgan et al.7og derefter rulle filmene på buede planteoverflader ved hjælp af en lille makeupapplikator16,17. Figur 1 viser forskellige tilgange til påføring af fibre i stive og fleksible substrater på planter.

Protocol

1. Produktion af VACNF'er (figur 2 og figur 3)

  1. Spincoat en siliciumskive med polymethylmethacrylat (PMMA) 495 A4 modstår ved 4000 o/min og bages ved 180 °C i 5 min.
    BEMÆRK: Lad waferen køle af i 10 sekunder, før du fortsætter til næste trin.
  2. Spincoat et andet lag resist (PMMA 950 A2) og bag det ved 180 °C i 5 min.
  3. Brug elektronstrålelitografi til at definere katalysatorprikkerne med diametre på 300 nm ved en specificeret lateral afstand (stigning: 10 μm eller 35 μm) i 3 mm x 3 mm arrays.
  4. Modstanden udvikles i 30-40 ml 1:3 methyl-isobutylketon: isopropylalkohol (IPA) i 1,5 min, hvorefter den skylles med IPA og tørres medN2.
    BEMÆRK: Kontroller for rækken af prikker ved hjælp af et brightfield-mikroskop (20x mål).
  5. Rengør skiven for restmodstanden med en 6 s eksponering i iltplasma (descum) i en siliciumætser.
  6. Brug elektronstrålefordampning til først at deponere et klæbende lag af metal (Ti eller Cr, 10 nm) og derefter deponere et andet lag, som er Ni-katalysatoren (130 nm eller 150 nm). Under Ti- eller Ni-metalaflejring skal strømmen holdes under 0,2 A ved 10 kV, trykket under 5 x 10-6 Torr og aflejringshastigheden ved ~ 1 A / s for synslinjeaflejring.
  7. Brug sekventiel bad sonikering til at fjerne metallet (Ni) deponeret på det underliggende modstandslag, forlader Ni deponeret direkte på silicium wafer. Denne proces kaldes lift-off.
    1. Til dette skal du forberede 3 beholdere med acetone og badesonikere waferen i acetone i 1 min; Gentag 3 gange ved stuetemperatur (RT, 20 °C) med en frekvens på 35 kHz. Skyl med IPA og tør med N2.
      BEMÆRK: Lad aldrig acetone tørre på waferen. Efter den sidste acetone sonikering skylles straks med IPA og tørres derefter medN2 gas. Hvis waferen på noget tidspunkt bliver for tidlig tør (før IPA-skylning), er der mulighed for, at ikke alt overskydende metal og modstand fjernes, og acetonen kan efterlade en rest.
  8. Kontroller geometrien af katalysatorformen ved hjælp af scanningelektronmikroskopi (SEM). For at tage SEM-billeder af VACNF-chipsene skal du vippe scenen til en vinkel på 30 ° og bruge en spænding på 1-3 kV med en strålestrøm på ~ 100 pA og en ~ 5 mm arbejdsafstand.
    BEMÆRK: Katalysatoren skal ligne en hockeypuck (en kompakt cylinder) (figur 4). Højden på den kompakte cylinder skal afspejle tykkelsen af Ni, der er deponeret på siliciumskiven. Hvis profilen af Ni-prikken er høj og ser ud til at være konkav øverst, der ligner en vulkan (figur 4), er katalysatoren mere tilbøjelig til at devådere i flere Ni-dråber, hvilket resulterer i forgrening af kulstofnanofibrene9 (figur 4 og figur 5). Sådanne problemer kan skyldes modstand mod smeltning under metalfordampning på grund af lange aflejringstider eller problemer med lift-off-proceduren (figur 4 og figur 5).
  9. Kvart siliciumskiven og anbring den i jævnstrømsplasmaforstærket kemisk dampaflejringskammer (dc-PECVD) med acetylen / ammoniakblandingen. Optimer vækstparametrene for at kontrollere længden og tilspidsningen af nanofibre (tip <200 nm).
    1. Brug en strøm på 1-1,5 A og et spændingsområde på 440-560 V. Når du dyrker fibrene, skal du bruge en forbehandlingsfase med ammoniakflow, mens maskinen og substratet opvarmes til 620 °C. Sørg for at tænde kulstofkilden (acetylen) 10 s, før plasmaet startes.
      BEMÆRK: Kvartskiver bruges, hvis PECVD-maskinens kørselsparametre skal optimeres. For at producere fibre med længder større end 40 μm og spidser mindre end 200 nm i diameter foreslås følgende parametre: med en Ni-katalysatortykkelse på 130 nm skal du bruge en strøm på 1,75 A, væksttid på 70 minutter og en acetylen: ammoniakforhold på 45 standard kubikcentimeter pr. Minut (sccm): 100 sccm. Med en Ni-tykkelse på 150 nm skal du bruge en strøm på 1,5 A, en væksttid på 80 min og et acetylen: ammoniakforhold på 48 sccm: 100 sccm. Brug følgende parametre til at dyrke VACNF'er uanset katalysatortykkelse: væksttemperatur på 620 °C, tryk på 10 torr under plasma og en brusehovedhøjde på 20 mm (figur 6).
  10. Vurder geometrien af de resulterende fibre ved hjælp af SEM ved en 30 ° hældning med et accelerationspotentiale på 1 kV.
    BEMÆRK: Optimale fibre vil være lige og ikke-forgrenede. Det er umuligt at kontrollere Ni-katalysatorens krystalorientering med elektronstrålefordamperen. Som et resultat vil der være nogle fibre, der forgrener sig på grund af katalysator dewetting9. Krystalorienteringen får også VACNF'erne til at vokse til forskellige højder, så ensartede højder på alle VACNF'er er vanskelige.
  11. Spincoat et lag fotoresist (SPR955) på fibrene ved 1000 o / min i 45 s. Skær derefter 1/4 skiven i 3 mm x 3 mm arrays ved hjælp af en terningsav. Opbevar fibrene på dette tidspunkt til senere brug.
    BEMÆRK: Udfør ikke trin 1.11, hvis du planlægger at overføre fibre til et fleksibelt substrat.

2. Transferring af VACNF'er til et fleksibelt substrat (figur 7 og figur 8)

  1. Efter at fibrene er syntetiseret, spincoat SU-8 2015 fotoresist på skiverne eller kvartskiverne ved 4000 o / min i 45 s.
  2. Softbake vaflen i 3 min ved 95 °C.
  3. Brug en kontaktjustering til at eksponere waferen med en 3 mm 3 mm matrixmønstret maske, der flugter med det definerede mønster fra elektronstrålelitografi ved 95 mJ/cm2.
    BEMÆRK: Brug en nærhedskontakttilstand med et eksponeringsgab, der er 20 μm større end den højeste fiber. Der er mulighed for, at fibre kan væltes under dette trin i processen.
  4. Udfør en eftereksponeringsbagning i 6 minutter ved 95 °C.
  5. Udvikl waferen i SU-8 developer i 15 sekunder, skyl den med IPA, og tør waferen med N2, bevæg dig fra top til bund.
    BEMÆRK: Når du udvikler waferen, skal du sikre dig, at den er helt nedsænket.
  6. Spincoatmønstrede vafler med et beskyttende lag tynd fotoresist (SPR 955 CM 0,7) ved 3000 o/min i 45 sek. og softbake i 30 sek. ved 90 °C.
  7. Et tyndt siliciumoxidlag afsættes til waferen (2-3 nm) ved at anbringe det i en atomlagsaflejring i 22 cyklusser ved 100 °C.
  8. Brug en terningsav til at skære skiven i firkanter på 3 mm x 3 mm. Juster terningsaven til det allerede eksisterende mønster på waferen.
  9. Vurder geometrien af de resulterende fibre ved hjælp af SEM ved en 30 ° hældning med et accelerationspotentiale på 3 kV.
  10. Stop her, hvis du opbevarer chips til langvarig brug (>1 uge). Opbevar chips i mørket.
  11. For at adskille fleksible underlag fra stive underlag skal du placere individuelle chips i acetone i 30 minutter, eller indtil SU-8 begynder at krølle.
  12. Vask SU-8 film (enten fastgjort til eller løsnet fra stive underlag) med IPA i 5 min og derefter med vand i 5 min. Placer chipsene i en kommerciel kasse med en klæbrig pude, når du transporterer dem.
  13. VALGFRIT: Placer den fiberløse side af SU-8-filmen på vandopløseligt tape eller oven på tynd silikonegummi med en tynd polyethylenterephthalat (PET) (12,5 μm tyk) bagside.
    1. Brug en pincet til at overføre SU-8-filmen. Tryk på kanterne af SU-8-firkanten for at hjælpe den med at klæbe til båndet/silikonegummi-PET; Dette er for at undgå at afbryde fibre. På dette tidspunkt er VACNF-filmene klar til øjeblikkelig brug.
    2. For at forberede en silikonegummi / PET-holder skal du gøre følgende: Brug et 2-delt sæt til silikonegummi til at blande de to dele sammen (elastomeren og tværbinderen). Skær derefter en firkant PET ud og tape den ned i en klar plastskål. Hæld et meget tyndt lag silikonegummi oven på PET'en og hærd det ved 80 °C i 1-2 timer.

3. On-plant metode (hvor en dråbe opløsning, der skal leveres, placeres på en planteoverflade) ved anvendelse af fibre i et stift substrat (figur 1A)

  1. Fjern fotoresisten med trinvise vaske af acetone (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) og ddH2O (5 min) før brug.
  2. Placer plantevævet, der skal spiddes, på en hård overflade til støtte.
  3. Anbring en 1 μL dråbe farvestof eller DNA (200 ng) på overfladen af plantevævet.
  4. Placer en VACNF-chip med et stift substrat på toppen af dråben, med fibrene orienteret således, at de kommer i kontakt med dråben.
    BEMÆRK: Chipsens orientering kan bestemmes af waferens "skinnende". Den skinnende side af chippen har fibre, og den uigennemsigtige side gør det ikke.
  5. Brug den flade side af en pincet til at trykke på chippen. Marker det område af planten, som chippen kom i kontakt med, ved hjælp af en markør med blød spids. Fjern VACNF-chipsene efter levering.
    BEMÆRK: Mængden af kraft, der påføres ved tapning, varierer afhængigt af den anvendte type plantevæv. Det anbefales at øve tappechips inden udførelse af impalement af fibre. Undgå skader på plantevæv. Skader er tydelige, når man kan se omridset af VACNF-chippen i plantevævet.
  6. Gentag trin 3.1-3.5 for kontroller (+farvestof/DNA, -fibre; -farvestof/DNA, +fibre; og -farvestof/DNA, -fibre). -Fibre er den fiberløse side af en chip.
  7. Opbevar intakte planter eller udskårne planteorganer i fugtige kamre under langvarige forhold (16 timers lys, 8 timer mørk), hvis det er nødvendigt. Til udskårne organer skal du bruge en plastik petriskål med våde papirhåndklæder.

4. On-chip-metode (hvor en dråbe opløsning, der skal leveres, placeres på en VACNF-chip), stift substrat (figur 1B)

  1. Fjern fotoresisten med trinvise vaske af acetone (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) og ddH2O (5 min) før brug.
  2. Drop cast 1 μL dråbe farvestof eller plasmid-DNA (200 ng) på fibersiden af VACNF-chip med stift substrat. Sørg for at placere dråben i midten af chippen og dække flere fibre. Lad dråben tørre i 15 min.
    BEMÆRK: Chipsens orientering kan bestemmes af waferens "skinnende". Den skinnende side af chippen har fibre, og den uigennemsigtige side gør det ikke.
  3. Når du arbejder med blade eller andre udskårne organer, skal du placere dem oven på en hård overflade. Når du arbejder med intakte planter, skal du placere en hård overflade under det organ, hvorpå VACNF'er påføres.
  4. Efter tørringstrinnet på 15 minutter skal du placere VACNF-chippen, så fibersiden kommer i kontakt med plantevævet. Tryk på chippen med bagenden af en pincet.
    BEMÆRK: Mængden af kraft, der påføres ved tapning, varierer afhængigt af den anvendte type plantevæv. Det anbefales at øve tappechips.
  5. Gentag trin 3.6-3.7 i metoden på anlægget.

5. Anvendelse af VACNF'er i SU-8-film på plantevæv ved hjælp af on-chip-metoden (figur 1C)

  1. Placer 1 μL dråbe farvestof eller DNA (200 ng) på fibersiden af SU-8-filmen og lad den tørre i 10 minutter. Sørg for at placere dråben i midten af chippen.
    BEMÆRK: Der er forskellige tørretider afhængigt af det anvendte substrat.
  2. Brug en skarp pincet til at placere VACNF-filmen på planteoverfladen.
    OBS: Jo længere tid SU-8-filmene er udeladt i luften, jo mere sprøde bliver filmene. For at begrænse risikoen for at miste SU-8 filmene, skal du sørge for at have alle planter/prøver og udstyr i nærheden af SU-8 filmene.
  3. Rul forsigtigt en lille makeupapplikator over VACNF-filmen. Marker de områder, hvor de fleksible underlag er placeret, med en markør med blød spids. Fjern de fleksible substrater fra planteoverfladen ved hjælp af tape.
    BEMÆRK: Mængden af kraft, der påføres ved rullning af makeupapplikatoren, varierer mellem det anvendte plantevæv. Øv dig på at anvende VACNF-filmene, inden du udfører levering af biomolekyler eller farvestoffer. Synlige skader på plantevæv er tydelige, når man kan se konturerne af VACNF-film i plantevævet.
  4. Gentag trin 5.1-5.3 for kontroller og lageranlæg som nævnt i trin 3.7 i metoden på anlægget.

6. Mikroskopi og billedanalyse for alle leveringsmetoder

  1. Billede prøverne ved hjælp af et konfokalmikroskop ved hjælp af emissions- og excitationsbølgelængder, der er egnede til den leverede fluorescerende sonde / reporter.
    BEMÆRK: Den tid, der kræves til den forbigående transformation, varierer med plantearten og den leverede markør. For eksempel blev ekspressionen af fluorescerende markører påvist efter 48 timer i Arabidopsis versus 96 timer i salatblade7.
  2. Når du billeddanner, skal du prøve at fokusere på en region med løsrevne fibre. Fibre vil have forskellige orienteringer. Leveringssuccesen er ikke afhængig af udseendet af brudte fibre.
    BEMÆRK: Fibre vil være fluorescerende med de mest almindelige excitations-/emissionsindstillinger på grund af dannelsen af siliciumnitridlag som følge af fiberdannelsen i PECVD18.
  3. Tag mindst 5 billeder for hver prøve. Det resulterende signal vil variere.
  4. Mål fluorescensværdierne som total fluorescens (integreret densitet) i 20 μm x 20 μm konfokale billedområder7 ved hjælp af ImageJ19.

Representative Results

Den klare fordel ved VACNF-chips på stive eller fleksible substrater er evnen til at levere biomolekyler eller farvestoffer til bestemte steder på en plante (figur 1). Her brugte vi fluorescensaflæsninger til at vurdere leveringen. Ved hjælp af forskellige planter, substrater og leveringsmetoder (on-chip eller on-plant) kan der være forskelle i tidspunktet for udseendet af farvestof fluorescein. For at afgøre, om VACNF-chips / film fungerer til levering, er en hurtig tilgang at bruge fibre til farvestoflevering (figur 9). Billeder mærket med forskellige tidspunkter i figur 9 er forskellige synsfelter fra de samme eksempler. Ved anvendelse af on-plant metode kan fluoresceinfarvestof observeres umiddelbart efter levering ved anvendelse af fluorescensmikroskopi. Derudover, hvis det samme synsfelt afbildes over tid efter levering af fluoresceinfarvestof til en plante, bliver signalintensiteten mindre lys over tid (figur 10). Fluoresceinfarvestoffet kan potentielt bevæge sig fra synsfeltet til andre områder af bladet gennem plasmodesmata20,21. Sammenlignet med on-plant-metoden, i on-chip-metoden med fibre på det stive substrat, bevæger farvestoffet sig langsommere gennem det spiddede område (figur 9). Dette kan være et resultat af, at farvestoffet løsner sig fra fibre / rehydrerer i cellerne og dermed tager mere tid at bevæge sig.

Fibre i det fleksible substrat var egnede til farvestoflevering til buede overflader som jordbær og æbler (figur 11 og figur 12). Ved hjælp af et fleksibelt substrat med jordbær blev der observeret et stærkt fluoresceinsignal med det samme (figur 11), mens det tog 2 timer at se et stærkt fluoresceinsignal i æbler (figur 12B, D). Den vellykkede levering af plasmider, der koder for fluorescerende markører, kan bestemmes ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at finde det resulterende signal (figur 12F, figur 13 og figur 14). Kontrol er nødvendig for at afgøre, om den valgte plante ikke har nogen autofluorescens svarende til den fluorescerende markør, vi ønsker at levere med fibre. Brug af fibre alene er nyttigt at bestemme, om slagkraften, der påføres med pincet, resulterer i skade på plantevævet, eller om den observerede fluorescens i prøven skyldes VACNF'erne, som i sagens natur er fluorescerende på grund af deres siliciumnitridlag18 (figur 13C-D). Fibre spiddet i plantevæv inducerer ikke sårrespons som vurderet vedH2O2-produktion6. Endelig er det nødvendigt at bruge kontrollen af +DNA -Fibre til at bekræfte, at DNA ikke kommer ind i planten ved at tappe alene og bekræfter, at fibrene er nødvendige for levering til planteceller (figur 13E-F). Der bør ikke være nogen tydelig forskel, når der anvendes udbringningsmetoder på anlægget eller på chippen ved hjælp af VACNF'erne på et stift substrat, hvilket fremgår af manglen på signifikant forskel i fluorescensværdier (figur 13I). Brug af de fleksible VACNF-film med on-chip DNA-levering resulterede i en vellykket forbigående transformation af epidermale celler i købte æbler og løg (figur 12F og figur 14).

Mislykkede eksperimenter kan have fibre brudt af i forskellige synsfelter, men der vil ikke være noget resulterende fluorescenssignal fra forsøget på at levere plasmid-DNA eller farvestof. Hvis der påføres for meget pres på planten, vil der være tilsyneladende vævsskade (figur 15). Denne mekaniske skade kan se ud som små huller eller gennemsigtige områder i planten, som om et lag af celler er blevet fjernet, når man ser på planten under et mikroskop. Nogle gange vil aftryk af chippen være synlige. Et eksperiment, hvor fluorescerende proteinekspression ikke påvises efter DNA-levering, kan også skyldes brugen af DNA af lav kvalitet, så det kan være nyttigt at fremstille frisk DNA.

Figure 1
Figur 1: Skematisk over farvestof/DNA-tilførsel til plantevæv ved hjælp af fibre på stive og fleksible substrater . (A) On-plante, fibermedieret farvestof / DNA-levering. En 1-μL dråbe farvestof / DNA-opløsning placeres på overfladen af et blad, og VACNF-chippen placeres oven på dråben. Ved hjælp af en pincet tappes chippen forsigtigt ind i vævet. Det stive substrat fjernes og efterlader nanofibre i vævet. (B) On-chip fibermedieret DNA-levering. En 1 μL dråbe farvestof eller DNA-opløsning dråbestøbes på VACNF-chippen og tørres i 15 min. Chippen med halvtørret DNA placeres oven på bladoverfladen og tappes ind i vævet som i panel A. (C) On-chip SU-8 film DNA-levering. Fibre overføres fra det stive siliciumsubstrat til fleksibel SU-8-bagside. En dråbe farvestof/DNA-opløsning på 1 μL dråbestøbes på VACNF-filmen og tørres i 10 min. VACNF-filmen med det halvtørrede farvestof / DNA rulles derefter på en buet planteoverflade ved hjælp af en makeupapplikator. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsproces til fremstilling af lodret justerede kulstofnanofiberarrays. For at fremstille VACNF'er spinbelægges et dobbeltlag polymethylmethacrylat (PMMA 495 A4 efterfulgt af PMMA 950 A2) på en siliciumskive. Elektronstrålelitografi bruges til at definere en række prikker 300 nm i diameter. Modstanden udvikles derefter i methylisobutylketon/isopropanol (MIBK/IPA), 1:3 i 1,5 min. Ved hjælp af en metalfordamper påføres et klæbende lag af Ti (10 nm) på waferen efterfulgt af et lag Ni (130 nm eller 150 nm). Den resterende modstand fjernes derefter via lift-off (bad sonikering i acetone). Geometrien af katalysatorprikker inspiceres via SEM. Hvis katalysatorerne ligner hockeypucke og er flade, placeres de i plasmaforstærket kemisk dampaflejringsmaskine (PECVD), og fibre dyrkes. Fibrene blev derefter inspiceret ved hjælp af SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: SEM-billeder af ideelle vertikalt justerede kulstofnanofibre . (A) Elektronmikrografi af VACNF'er med en ~ 35 μm stigning og en højde på 10-15 μm, afbildet i en vinkel på 30 °. Dette billede er duplikeret i figur 7C. (B) Elektronmikrografi af VANCF'er med ~ 20 μm stigning og 20-30 μm højde og afbildet i en 30 ° vinkel. (C) Elektronmikrografi af VANCF'er med ~35 μm stigning, 50-60 μm højde og afbildet i en vinkel på 30°. D) Elektronmikrografi af VACNF-spids med en diameter <200 nm. Der er variation i fiberspidsdiametrene (150-300 nm). Fordi fibrene blev afbildet i en vinkel på 30°, ser højderne ud til at være mindre end den faktiske højde med en faktor for synd (30°) = 1/2. Panelerne A og B er blevet genoptrykt med tilladelse fra Morgan et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SEM-billeder af katalysatorgeometri før dyrkning af VACNF'er. (A) SEM-billede af katalysatoren efter lift-off. Bemærk, at fotoresist er til stede omkring katalysatorens kant, hvilket resulterer i en vulkanform. (B,C) SEM-billeder viser katalysatorens vulkanformer efter brug af en enkeltlags PMMA-modstand. (D) Ønsket hockeypuck katalysatorform lavet af dobbelte lag PMMA. Fordi fibrene blev afbildet i 30 ° vinkel i panelerne A, B og D, ser højderne ud til at være mindre end den faktiske højde med en faktor for synd (30 °) = 1/2. Skalastænger repræsenterer 100 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Effekt af katalysatorprikstørrelse på fibervækst: For at fastslå katalysatormaterialets optimale diameter blev fibre dyrket fra prikstørrelser fra 200-600 nm. Punktstørrelser fra 400-600 nm førte til affugtning af katalysatoren og væksten af flere fibre. Den bedste fibergeometri blev produceret med en diameter på 300 nm. Mindre prikker førte til utilstrækkelig fiberhøjde. På grund af det faktum, at fibrene blev afbildet i 30 ° vinkel, synes højderne at være mindre end den faktiske højde med en faktor for synd (30 °) = 1/2. Billeder blev taget ved hjælp af scanningelektronmikrografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Skematisk illustration af jævnstrømssystemet - plasmaforstærket kemisk dampaflejring (dc-PECVD), der anvendes på Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Specialsystemet hos ORNL har et stort brusehoved, der fungerer som reaktor for fødegasser og output for plasma. Brusehovedet blev opretholdt ved et DC-potentiale på 300 V i forhold til det opvarmede trin for underlaget. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Arbejdsproces til overførsel af fibre fra et stift substrat til et fleksibelt substrat. Efter nanofibersyntese og inspektion spinbelægges hver wafer med SU-8 2015 ved 4000 o / min i 45 s. Vaflen blødbages derefter i 3 minutter ved 95 °C. Derefter udsættes waferen for UV-lys og mønstres i en maskejustering ved 95 mJ/cm2. Efter efterbagning i 6 min ved 95 °C udvikles waferen i SU-8 udvikleren i 15 sekunder, skylles med IPA og tørres medN2 gas. Et beskyttende modstandslag på SPR 955 CM 0,7 centrifugeres på skiven ved 3000 o/min og blødbages ved 90 °C i 30 sekunder. Et siliciumoxidlag (2-3 nm) tilsættes derefter til waferen via atomlagsaflejring (ALD) (22 cyklusser ved 100 °C) for at gøre det fleksible substrat hydrofilt15. Waferen skæres derefter i 3 mm x 3 mm firkanter med en terningsav. På brugstidspunktet placeres individuelle chips i acetone, indtil SU-8 begynder at krølle og bliver konkav (>30 min). På dette tidspunkt kan SU-8-laget på de fleste chips gribes i kanten med skarpe pincet og skrælles fra det underliggende siliciumsubstrat som en intakt 3 mm firkantet film. Filmen vaskes derefter successivt i IPA og vand i 5 min hver og bruges straks. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: SEM-billeder af fiberoverførsel fra et stift substrat til et fleksibelt substrat. De viste billeder er repræsentative, men kommer fra forskellige eksempler. (A) Lange fibre efter PECVD-vækst (samme billede som i figur 2C). (B,C) Fibre efter påføring af SU-8. Epoxybrøndene op omkring bunden af fibre. Den eksponerede fiberlængde varierede fra 5 μm til 30 μm. (D) Fibre indlejret i Su-8 efter lift-off bevarede deres geometri. På grund af det faktum, at fibrene blev afbildet i 30 ° vinkel, synes højderne at være mindre end den faktiske højde med en faktor for sin (30 °) = 1/2. Panel A er blevet genoptrykt med tilladelse fra Morgan et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Farvestoflevering til Arabidopsis-blade ved hjælp af on-chip og on-plant metoder med fibre på stive substrater. (A-P) Billeder blev erhvervet ved hjælp af konfokal mikroskopi. On-chip-metode (A-H): 1 μL 10 μM fluoresceinfarvestof blev tørret i 15 minutter på VACNF-chips, og derefter blev chipsene tappet ind i den abaxiale side af Arabidopsis-blade med pincet. (A-D) Blade afbildet inden for 5-15 minutter efter levering. (E-H) Blade afbildet 1 time efter levering. (A, E) + farvestof, + fibre. Kontrol: (B, F) -farvestof, -fibre; (C,G) -farvestof, +fibre; (D,H) +farvestof, -fibre. (I-P) On-plant metode: 1 μL 10 μM fluorescein farvestof blev anbragt på planteoverfladen, chips blev placeret således, at de kom i kontakt med dråben, og pincet blev brugt til at tappe chippen ind i den abaxiale side af Arabidopsis blade. (I-L) afbildet inden for 5-15 minutter efter levering og (M-P) afbildet 1 time efter levering. (I,M) +farvestof, +fibre. Kontrol: (J,N) -farvestof, -fibre; (K,O) -farvestof, +fibre; (L,P) +farvestof, -fibre. Paneler A-P er enkeltplane billeder fra z-stakke. Skalastænger er 20 μm. Fibre har en 35 μm tonehøjde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Tidsforløb for farvestofafgivelse i Arabidopsis via on-plant metode med stift substrat. Billeder blev erhvervet ved hjælp af konfokal mikroskopi. Ved hjælp af on-plant-metoden blev 1 μL dråbe fluoresceinfarvestofopløsning (10 μM) anbragt på overfladen af et blad, og VACNF-chippen blev anbragt oven på dråben. Ved hjælp af en pincet blev chippen forsigtigt tappet ind i vævet. +Farvestof, +Fibre billeder af det samme område blev erhvervet hvert 5. minut. Skalastænger er 20 μm. Fibre har en 35 μm tonehøjde. Paneler er enkeltplane billeder fra z-stakke. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Farvestoflevering til jordbærfrugt ved hjælp af VACNF-film. (A-H) Billeder blev erhvervet ved hjælp af konfokal mikroskopi. Ved hjælp af on-chip-metoden blev farvestofdråber tørret på VACNF-film, som derefter blev rullet på frugtoverflader ved hjælp af en makeupapplikator. Fluoresceinfarvestof (10 μM) blev leveret til jordbærceller og afbildet efter (A) 10 minutter og (B) 1 time. (C, D) Ingen behandlingskontrol (-farvestof, -fibre). (E,F) -Farvestof, +Fibre kontrollerer efter henholdsvis 10 min og 1 time. (G,H) +Farvestof, -Fibre styrer efter henholdsvis 10 min og 1 time. Skalabjælkerne er 40 μm. Panelerne A-H er maksimale fremspring på 188 μm z-stakke. Fibre har en 35 μm tonehøjde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 12
Figur 12: Farvestofafgivelse og forbigående transformation af æbler via VACNF-film. (A-F) Billeder blev genereret ved hjælp af konfokal mikroskopi. Ved hjælp af on-chip-metoden blev 1 μL dråber fluoresceinfarvestof (10 μM, B og D) eller 1 μL plasmid, der koder for pUBQ10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) tørret på VACNF-film, som derefter blev rullet på frugtoverflader ved hjælp af en makeupapplikator. Fluoresceinfarvestof blev leveret til æbleepidermis og afbildet efter (B) 10 minutter og (D) 2 timer. (D) Farvestoffet tog lidt tid at diffundere ind i cellerne efter levering. DNA-YFP levering og ekspression via VACNF film efter (F) 48 timer. (A, C, E) ingen behandlingskontrol (-Dye / DNA-YFP, -Fibre). Skalabjælkerne er 40 μm. Panelerne A-D er enkeltplane billeder fra z-stakke. Panelerne E og F er den maksimale projektion på 53 μm z-stakke. Fiberhøjden er 35 μm. Pile angiver fluorescein- eller YFP-signaler. * angiver fibre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 13
Figur 13: Transient transformation af Arabidopsis-blade ved hjælp af on-plant eller on-chip VACNFs metoder. (A-H) Billeder blev erhvervet ved hjælp af konfokal mikroskopi 48 timer efter DNA-levering. (A, C, E, G) On-plant metode: 1 μL plasmid, der koder for pUBQ10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) blev anbragt på den abaxiale side af Arabidopsis-blade. Chips blev placeret således, at de kom i kontakt med dråben, og pincet ware bruges til at tappe chippen i bladvæv. (B, D, F, H) On-chip metode: 1 μL DNA-YFP (200 ng) blev tørret i 15 minutter på VACNF-chips, og derefter bankede chipsvarerne ind i den abaxiale side af Arabidopsis-blade med pincet. +DNA-YFP, +Fibre til (A) on-plant og (B) on-chip. Kontrol: (C, D) -DNA-YFP, + fibre; (E,F) +DNA-YFP, -fibre; og (G,H) -DNA, −Fibre. (I) Graf af relativ gennemsnitlig fluorescenssignalintensitet på 25, 20 × 20 μm områder fra billeder af 5 biologiske replikater kombineret fra 2-3 eksperimenter med fluorescens fra YFP-kanalen. Regioner, der indeholder stomata (*), blev ekskluderet på grund af autofluorescens. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet fra -DNA-YFP, -Fibers tilstand blev trukket fra hvert gennemsnit. 2-vejs ANOVA (og Tukey-test) blev brugt til signifikanstest, og fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Forskellige bogstaver viser signifikante forskelle mellem behandlingerne (P < 0,0001). Alle viste billeder er maksimale projektioner på 40 μm z-stakke. Skalastænger er 20 μm. Hvide pile angiver fibre i billederne. Fiberhøjden er 35 μm. Denne figur er blevet genoptrykt med tilladelse fra Morgan et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 14
Figur 14: Forbigående transformation af løg ved hjælp af VACNF-film. Billeder blev erhvervet ved hjælp af konfokal mikroskopi 48 timer efter DNA-levering. Ved hjælp af on-chip-metoden blev 1 μL plasmid-DNA, der koder for pUBQ 10: YFP (DNA-YFP) (200 ng) dråber, tørret på VACNF-film i10 minutter, som derefter blev rullet på planteorganoverflader. (A) DNA-YFP blev leveret til, og YFP blev udtrykt i løgepidermis. (B) Ingen behandlingskontrol; (C) kontrol (+DNA-YFP, -fibre) og (D) kontrol (-DNA-YFP, +fibre). Skalabjælkerne er 40 μm. Fibre har en 35 μm tonehøjde. Billeder er maksimale projektioner på 115 μm z-stakke. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 15
Figur 15: Vævsskade i salat fra VACNF-filmapplikation . (A-D) Billeder blev genereret ved hjælp af konfokal mikroskopi. (A) On-chip-metoden blev brugt til at levere DNA til salatblade via VACNF-film. pUBQ 10: YFP DNA (200 ng) dråber blev tørret i10 minutter på VACNF-film, som derefter blev rullet på den abaxiale side af løsrevne salatblade og opbevaret i et fugtighedskammer i 4 dage. (B) kontrol (-DNA-YFP, +fibre). (C) kontrol (+DNA-YFP, -fibre) og (D) ingen behandling (-DNA-YFP, -fibre). Skalastænger er 40 μm. VACNF'er har en 35 μm stigning. Pile peger på planteskader som følge af rulning af det fleksible substrat med for meget kraft. Bemærk, at vellykket VACNF-medieret DNA-levering i salat blev opnået i andre eksperimenter7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 16
Figur 16: Arbejdsgang for VACNF-medieret levering i anlæg. I trin I skal du kontrollere fibrenes geometri ved hjælp af SEM. For korrekt levering har fibre brug for et tip med en diameter <200 nm. Hvis der anvendes fibre på fleksibelt substrat, ville det næste skridt være at bekræfte, at fibre overføres til SU-8 og kontrollere højden af de udsatte fibre via SEM. I fase II testede vi fibrenes anvendelighed ved at forsøge at levere farvestof til den valgte plante / organ ved hjælp af et stift eller fleksibelt substrat. Brug 1 μL dråbe, enten ved at placere den på plantens overflade eller kortvarigt tørre den på spånen/filmen. Med dette trin og alle andre trin er det bydende nødvendigt at bruge de korrekte kontroller (-farvestof, -fibre; -farvestof, +fibre; og +farvestof, -fibre) for at være sikker på, at signalet kommer fra bona fide farvestoflevering. I trin III skal du bekræfte, at genet af interesse er til stede i plasmidet, bestemme koncentrationen af DNA, der skal levere, og teste den optimale tid efter fødslen for at kontrollere ekspression. I fase IV blev resultatet evalueret ved hjælp af konfokal mikroskopi for at kontrollere ekspressionen af den leverede markør. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Morgan et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

I dette papir præsenterede vi metoder til konstruktion af vertikalt justerede kulstofnanofiberarrays, overførsel af fibrene til et fleksibelt substrat og påføring af fibre i enten et stift eller fleksibelt substrat til planter til brug ved levering af biomolekyler eller farvestoffer til planter. Vi beskrev to generelle tilgange, on-chip og on-plant metoderne, til deponering af de introducerede materialer og viste vellykkede resultater i fibre på et stift substrat samt on-chip-metoden ved hjælp af VACNF-film. Anvendelsen af disse fibre er enklere i praksis og teori end traditionelle plantetransformationsmetoder (partikelbombardement, protoplasttransformation via PEG eller elektroporation) og kan anvendes til planter, der er genstridige over for Agrobacterium-medieret transformation. Imidlertid transformeres kun få celler.

Vertikalt justerede kulstofnanofibre blev produceret på Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences gennem deres brugerprogram. Brugere kan ansøge om at bruge denne facilitet til produktion af VACNF'er. Alternativt kan VACNF-chips fremstilles i renrum med jævnstrømsplasmaforstærkede kemiske dampaflejringsmaskiner med en kulstofkilde22,23. Med de beskrevne metoder er der et par trin, der er kritiske for produktionen af fibrene, fiberoverførsel og anvendelse af VACNF-chips / film. For at fiberapplikation skal fungere, skal fibre være lige og have en tilspidset diameter på <200 nm ved spidsen for levering i planteceller for at være vellykket 6,7 (figur 3). For at skabe kulstofnanofibre af særlig størrelse og tonehøjde er der en række parametre, der kan ændres, herunder prikstørrelse, lateral tonehøjde og mængden af katalysator, der er deponeret. For at vælge den optimale prikstørrelse, der skal bruges til kulstofnanofiberproduktion, blev fibre dyrket fra forskellige prikstørrelser (som vist i figur 5). Vi fandt ud af, at 300 nm diametre producerede de bedste fibre, derfor blev denne prikstørrelse valgt (figur 5). Efter at have fundet de rigtige parametre søgte vi at bruge chips, der har >50% fibre med den ideelle geometri (lige og en spidsdiameter <200 nm). For at kontrollere fibrenes geometri brugte vi scanningelektronmikroskopi til at afbilde tilfældige synsfelter på en prøve af VACNF-chips / film.

Derudover skal fibrene have en vis minimumslængde for at opnå levering inden for planteceller. Betydningen af at producere fibre af forskellig længde er, at længere fibre kan bruges til at trænge ind i dybere vævslag. Længere fibre (>40 μm lange) er afgørende for fleksible film, da fiberoverførslen fungerer ved at bryde fibrene fra deres base og kræver lagdeling af SU-8 oven på fibrene. Arbejdstykkelsen af SU-8-laget, der anvendes til denne protokol, er 20-35 μm. Den mindste højde, der er nødvendig for at opnå levering inden for epidermis af forskellige planter (buet eller flad) er 10-15 μm 6,7. Som et resultat er fibre med længder >40 μm nødvendige for VACNF-film. Der er flere forskellige parametre, der skal overvejes, når der produceres kulstofnanofibre: katalysatormateriale, katalysatorgeometri, tykkelse af katalysatormateriale samt forhold i PECVD-kammeret (gasforhold, tryk, temperatur, strøm, brusehovedhøjde og væksttid)8,9,24,25. For at producere kulstofnanofibre længere end 25 μm anvendt af Morgan et al.7 og Davern et al.6 øgede vi mængden af Ni-katalysator, ændrede acetylen: ammoniakforholdet og øgede strømmen og væksttiden. Derudover var vi mere opmærksomme på katalysatormaterialets geometri. For at producere høje lige fibre skulle den deponerede katalysator have en hockeypuckform snarere end en form, der ligner en vulkan (figur 4). Vulkanstrukturer stammer fra rester af fotoresist efter lift-off. For at forhindre dannelse af vulkaner blev et dobbeltlag PMMA brugt til at skabe en underskæring under elektronstrålelitografi26. Underskæringen hjælper med at løfte den aflejrede metalkatalysator (figur 2). Det tykke lag af katalysatoren er vigtigt for væksten af høje VACNF'er. Morfologien af VACNF'erne er blevet undersøgt af Merkulova et al.24. Den lodrette justering af VACNF'er skyldes både væksten af Ni-katalysatorspidstypen og justeringerne af DC-potentialet vinkelret på substratet (figur 6). Brusehovedet beskriver geometrien af PECVD-reaktoren (figur 6) og tjener som kilde til potentialet for det elektriske felt27.

For at definere rækken af katalysatorprikker med elektronstrålelitografi anvendte vi en elektronstrålemodstand (polymethylmethacrylat) og brugte derefter e-strålen til at lave små huller i modstanden med en bestemt form og på bestemte steder på waferen. Huller med den ønskede diameter blev anbragt på et regelmæssigt gitter med den definerede afstand (stigning), og en fil, der specificerede det ønskede mønster, blev indlæst i elektronstrålelitografiværktøjet, inden substratet blev lagt i maskinen. Ud over fiberhøjde er en anden kritisk parameter for vellykket fiberoverførsel mængden af tid brugt i acetonebadet. VACNF-filmene skal efterlades i acetonebadet længe nok til, at deres kanter begynder at krølle; Hvis de efterlades i acetonebadet i for lidt tid, er de sværere at løfte af chipsene og kan gå i stykker. Jo ældre chipsene er, jo længere bliver de nødt til at forblive i acetonebadet. Efter acetonebadet blev filmene / chipsene anbragt i isopropanol og vand for at fjerne adgangsacetone samt for at fjerne den beskyttende fotoresist på fibrene.

For at udføre spinbelægning placeres wafers eller waferstykker på en vakuumchuck i spincoateren, og waferens centrale position verificeres ved hjælp af spincoaterens testfunktion. En lille vandpyt (~ 2,5 cm i diameter) af modstand påføres midten af waferen og spundet (3000 o / min i 45 s) Billeder af fibrene før og efter spinbelægning er inkluderet i figur 8, der viser bevarelsen af fibergeometri (højde, orientering og stigning). Tilstedeværelsen af fibre får modstanden til at stige godt op i bunden af fibrene og resulterer i tykkere end forventede lag. Spin-coating efter VACNF vækst er blevet undersøgt af andre grupper11,18.

Et andet trin i processen, der er af afgørende betydning, er at sikre, at den rigtige mængde kraft påføres VACNF-chips / film. Leveringsmekanismen er afhængig af, at fibre foretager små punkteringer i cellevægge via pincettens impulskraft, banker på stive underlag 6,7 eller ruller med mini-makeup-applikatoren på fleksible underlag. Fibre kan måske eller måske ikke bryde af og forblive indlejret i planteceller6,7 uden indflydelse på resultatet, men praksis i forbindelse med undersøgelse for farvestofoptagelse og vævsskade er nødvendig for at få trykket rigtigt. Derudover er det vigtigt at vælge passende billeddannelsestidspunkter efter DNA-levering med VACNF-chips/film, da tiden til detekterbar ekspression varierer mellem plantearter og de typer vektorer, der leveres7 (figur 16).

Så bredt anvendelig som denne metode er til planter, har den nogle få begrænsninger. For eksempel resulterer tilsætning af et tyndt lag siliciumoxid til VACNF-filmene ikke altid i, at film er helt hydrofile på grund af det beskyttende lag af fotoresist, der er tilsat oven på SU-8. Hvis dette problem opstår, kan tykkere lag siliciumoxid påføres VACNF'er. For at teste, om filmene er hydrofobe eller hydrofile, kan de placeres i vand. Hvis filmene synker, er de hydrofile, og hvis de flyder, er de hydrofobe. Derudover kan der være variation mellem partier af producerede fibre. Der er flere parametre, der kan ændres, når fibrene dyrkes i dc-PECVD-maskinen; hvad der er beskrevet i denne protokol er et sæt parametre for to forskellige mængder Ni-katalysator. Derudover kan krystalorienteringen af Ni-katalysatoren ikke styres28 , og en vis forgrening vil uundgåeligt resultere i fibrene.

Mens vi demonstrerede leveringen af fluoresceinfarvestof og DNA til planteceller ved hjælp af både stive og fleksible substrater til dette papir, bør metoden være bredt anvendelig til andre biomolekyler og genetiske modifikationsmetoder, for eksempel RNAi-hæmning til plantesystemer som æbler eller andre frugter, hvor det ville tage år at producere stabile transgene linjer. Desuden kan disse fibre også bruges til at levere genetiske redigeringsmaterialer eller til stabile transformationer i planter.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Nanofiberarrays blev fremstillet på Center for Nanophase Materials Sciences, som er en Department of Energy Office of Science User Facility (forslags-id: CNMS2019-103 og CNMS2022-A-1182). Støtte fra CNMS tildeles gennem et peer-reviewed forslagssystem og ydes uden omkostninger til succesrige ansøgere, der har til hensigt at offentliggøre deres resultater (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Vi takker Kevin Lester og CNMS for hjælp med produktion af nanofiber arrays. Vi takker Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs og Travis Bee for kritiske diskussioner om eksperimentelt design. Vi takker Dr. Adam Rondinone for skemaet over PECVD-maskinen. Vi takker Leslie Carol for de videnskabelige illustrationer. Dette arbejde blev finansieret af Bioimaging Science Program, US Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 og United States Department of Agriculture, 2021-67013-34835. JMM blev støttet af United States Department of Agriculture: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct Fastenal  690535
2-Propanol (IPA)  Fischer Scientific A451-4
4" Lid Entegris H22-401-0615 Wafer Carriers
4" tray Entegris H22-40-0615 Wafer Carriers
Accretech SS10 dicing saw Accreteck SS10
Acetone Fischer Scientific A18-4
Acetone used in the cleanroom at ORNL JT Baker 9005-05
Apples Grocery store No product number
Arabidopsis thaliana  Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago No product number
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine Oak Ridge National Laboratory  Custom-built
Cobham Green lettuce  Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis No product number Butterhead lettuce
Fluorescein dye Sigma Aldrich F2456-2.5G
Gel-box  Gel-Pak  AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool  Heidelberg DWL 66
ImageJ National Institues of Health  No product number
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL Doe and Ingalls CMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system JEOL 8100
Kimwipes Kimtech Kimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish VWR 11019-554
Layout Editor   juspertor GmbH No product number 
LSM 710 confocal microscope Zeiss No product number
LSM 800 confocal microscope Zeiss No product number
Make-up applicator  Amazon G2PLUS 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS
Merlin field emission scanning electron microscope Zeiss Merlin
MIBK/IPA  (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) Microchem M089025
Onions Grocery store No product number
Oxford FlexAl atomic layer deposition Oxford FlexAl
PMMA 495 A4 Microchem M130004
PMMA 950 A4 Microchem M230004 Can dilute down to A2
Polyethylene terephthalate (PET) Amazon KS-6304-21-11 Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc
Precision tweezers Aven Inc.  18032TT
pUBQ10:YFP-GW Arabidopsis Biological Resource Center CD3-1948
Silicon etcher (used for descum)  Oxford Plasmalab
Silicon rubber kit Smooth-On Inc Ecoflex 00-20
Silicon wafers Pure Wafer 4N0.001-.005SSP-INV
Spin coater Brewer Sciences Model 100CB
SPR 955cm 0.7  Megaposit 10018314
Strawberries Grocery store No product number
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 Series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 developer Microchem SU-8 2000 Series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Suss MicroTec contact aligner Suss MicroTec MA6/BA6
Table top microscope Phenom XL used for checking Ni catalysts after metal deposition
Thermionics VE-240 e-beam evaporator Thermionics VE-240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
  2. Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
  3. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
  4. Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).
  5. Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
  6. Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).
  7. Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).
  8. Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).
  9. Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).
  10. Nelson-Fitzpatrick, N. Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).
  11. Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
  12. Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. Processing of thin SU-8 films. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020 (2008).
  13. Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).
  14. Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527 (2011).
  15. Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
  16. Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008 (2019).
  17. Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
  18. Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Crafts, A. S. Translocation in plants. Plant Physiology. 13 (4), 791 (1938).
  21. Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
  22. Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
  23. Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).
  24. Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
  25. Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
  26. Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
  27. Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
  28. Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).

Tags

Vertikalt justerede kulstofnanofiberarrays stift substrat fleksibelt substrat levering af biomolekyler levering af farvestoffer nanomaterialer DNA-levering til planter mikrofabrikation forbigående transformation fluoresceinlevering VACNF-overførsel SU-8 epoxysubstrat siliciumoxidbelægning hydrofob natur buede planteorganer farvestofopløsning DNA-opløsningslevering
Brug af vertikalt justerede kulstofnanofiberarrays på stive eller fleksible substrater til levering af biomolekyler og farvestoffer til planter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, J. M., Jelenska, J.,… More

Morgan, J. M., Jelenska, J., Hensley, D. K., Li, P., Srijanto, B. R., Retterer, S. T., Standaert, R. F., Morrell-Falvey, J. L., Greenberg, J. T. Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants. J. Vis. Exp. (197), e65602, doi:10.3791/65602 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter