Summary
여기서는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유(VACNF)를 미세 가공하고, VACNF를 유연한 기판으로 전달하고, 생체 분자 및 염료 전달을 위해 식물에 경질 및 유연한 기판 모두에 VACNF를 적용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
생체 분자와 불침투성 염료를 온전한 식물에 전달하는 것은 중요한 과제입니다. 나노 물질은 식물에 DNA를 전달하기 위한 떠오르는 도구입니다. 이러한 새로운 도구는 흥미롭지만 아직 널리 적용되지는 않았습니다. 단단한 기판(지지대)에 제작된 나노 물질은 곡선형 식물 구조에 성공적으로 적용하기가 특히 어렵습니다. 이 연구는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이를 미세 가공하고 단단한 기판에서 유연한 기판으로 옮기는 공정을 설명합니다. 우리는 이러한 섬유(경질 또는 연질 기판)가 식물에 대한 일시적인 변형 또는 염료(예: 플루오레세인) 전달에 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하고 시연합니다. VACNF를 경질 실리콘 기판에서 연질 SU-8 에폭시 기판으로 옮겨 유연한 VACNF 어레이를 형성하는 방법을 보여줍니다. SU-8의 소수성 특성을 극복하기 위해 플렉시블 필름의 섬유는 얇은 실리콘 산화물 층(2-3nm)으로 코팅되었습니다. 구부러진 식물 장기에 전달하기 위해 이러한 섬유를 사용하기 위해 VACNF 필름의 섬유 쪽에 1μL의 염료 또는 DNA 용액 방울을 증착하고 10분 동안 기다린 다음 필름을 식물 기관에 놓고 면봉을 롤링 동작으로 사용하여 섬유를 식물 세포로 밀어 넣습니다. 이 방법을 통해 우리는 곡면이 있는 식물 기관에서 염료와 DNA 전달을 달성했습니다.
Introduction
식물 형질전환(일시적이든 안정적이든)은 아직 모든 식물 조직과 종에서 널리 달성되지 않았습니다. 식물의 일시적 형질전환은 플라스미드에 암호화된 유전자가 일시적으로 식물에 도입되지만 게놈에 안정적으로 통합되지 않는 과정입니다. 입자 충격, 아그로박테리아, 전기천공법 또는 프로토플라스트의 폴리에틸렌 글리콜 처리를 사용하는 기존 방법은 느리거나 번거로울 수 있습니다. 또한 모든 식물 종 1,2,3,4에 적용되는 것은 아닙니다. DNA 전달을 위한 나노 물질의 사용은 아직 초기 단계에 있는 급성장하는 분야입니다5. 나노 물질, 특히 탄소 나노 섬유는 상처 반응을 일으키지 않고 단백질, 덱스 트랜스 및 염료를 식물 잎에 전달하는 데 성공적으로 사용되었습니다6. 이 연구의 목표는 생체 분자 또는 염료를 식물에 전달하기 위해 한 가지 유형의 나노 물질인 탄소 나노 섬유를 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 여기서는 다양한 식물 기관에서 세포의 일시적인 변형을 가능하게 하는 생체 분자로서의 DNA에 초점을 맞춥니다.
이전에 Morgan et al.7 은 양상추, N. benthamiana 및 포플러의 잎과 애기장대의 잎과 뿌리를 일시적으로 변형시키기 위해 단단한 실리콘 기판에 부착된 탄소 나노섬유를 사용하는 것을 시연했습니다. 다양한 장기에서 형질전환이 성공적이었지만 뿌리나 열매와 같이 표면이 구부러진 식물 조직에는 섬유를 적용하기가 더 어려웠습니다. 우리는 나노 섬유에 대한 유연한 지지대가 장기의 모양에 더 잘 순응하여 전달 효율성을 향상시킬 수 있다고 추론했습니다.
여기에서는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유를 제조 및 설계하고, VACNF를 유연한 기판으로 전달하고, 생체 분자 및 염료를 전달하기 위해 식물에 경질 및 유연한 기판 모두에 VACNF를 적용하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. 탄소 나노 섬유는 Ni 촉매와 함께 직류 촉매 플라즈마 강화 화학 기상 증착 (dc C-PECVD)을 사용하여 생산되었습니다. Ni 촉매 도트의 위치, 직경 및 높이는 Melechko et al.8,9에 의해 기술된 바와 같이 전자빔 리소그래피, 금속 증발 및 리프트 오프 공정의 조합을 사용하여 제어되었습니다. 이중층 e-빔 레지스트를 사용하여, 더 두꺼운 Ni 촉매를 기판 상에 증착하여 더 긴 섬유(10)를 수득할 수 있다. 경질에서 연성 기판으로의 섬유 이동은 Fletcher et al.11에 설명된 방법의 수정을 기반으로 하며, 현재 방법은 비정질 탄소층 또는 희생 감광액층의 사용을 전제로 합니다. 섬유 이송을 통한 SU-8 리프트 오프는 SU-812,13,14의 언더베이킹 및 과소 노출로 인한 고유 인장 응력을 활용하여 달성됩니다. 복잡한 중합체인 SU-8은 자연적으로 소수성이기 때문에 DNA 전달을 촉진하는 데 사용하기가 어렵습니다. SU-8의 소수성 특성을 상쇄하기 위해 섬유가 SU-8에 내장된 후 원자층 증착15를 통해 산화규소의 얇은 층을 적용합니다. 생체 분자/염료 전달을 위해 단단한 기판에 섬유를 적용하는 것은 Davern et al.6에 설명된 핀셋 태핑의 충격력과 Morgan et al.7에 설명된 온플랜트 및 온칩 방법을 활용합니다. 유연한 VACNF 필름은 Morgan et al.7의 온칩 방법과 같이 먼저 필름에 DNA 또는 염료 방울을 반건조시킨 다음 작은 메이크업 어플리케이터(16,17)를 사용하여 곡면 식물 표면에 필름을 롤링하여 곡선형 식물 표면에 적용됩니다. 그림 1은 경질 및 연성 기판의 섬유를 식물에 적용하기 위한 다양한 접근 방식을 보여줍니다.
Protocol
1. VACNF 생산(그림 2 및 그림 3)
- 실리콘 웨이퍼에 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 495 A4 레지스트를 4000rpm으로 스핀코팅하고 180°C에서 5분 동안 굽습니다.
알림: 다음 단계로 진행하기 전에 웨이퍼를 10초 동안 식히십시오. - 레지스트(PMMA 950 A2)의 두 번째 층을 스핀코팅하고 180°C에서 5분 동안 굽습니다.
- 전자빔 리소그래피를 사용하여 3mm x 3mm 어레이에서 지정된 측면 간격(피치: 10μm 또는 35μm)에서 직경이 300nm인 촉매 도트를 정의합니다.
- 30-40 mL의 1:3 메틸-이소부틸 케톤: 이소프로필 알코올(IPA)을 1.5분 동안 살포한 후 IPA로 헹구고N2로 건조시킨다.
참고: 명시야 현미경(20x 대물렌즈)을 사용하여 점 배열을 확인합니다. - 실리콘 에칭기의 산소 플라즈마(descum)에 6초 노출하여 잔류 레지스트의 웨이퍼를 청소합니다.
- 전자빔 증발을 사용하여 먼저 금속 접착층(Ti 또는 Cr, 10nm)을 증착한 다음 Ni 촉매(130nm 또는 150nm)인 두 번째 층을 증착합니다. Ti 또는 Ni 금속 증착 중에 10kV에서 전류를 0.2A 미만으로, 압력을 5 x 10-6Torr 미만으로, 가시선 증착을 위해 증착 속도를 ~1A/s로 유지합니다.
- 순차 수조 초음파 처리를 사용하여 기본 레지스트 층에 증착 된 금속 (Ni)을 제거하고 Ni를 실리콘 웨이퍼에 직접 증착시킵니다. 이 과정을 리프트 오프라고 합니다.
- 이를 위해 아세톤으로 3 개의 용기를 준비하고 웨이퍼를 아세톤으로 1 분 동안 수조합니다. 실온(RT, 20°C)에서 3kHz의 주파수로 35회 반복합니다. IPA로 헹구고 N2로 건조시킵니다.
알림: 웨이퍼에서 아세톤을 건조시키지 마십시오. 마지막 아세톤 초음파 처리 후 즉시 IPA로 헹구고 N2 가스로 건조시킵니다. 웨이퍼가 조기에 건조되면(IPA 헹굼 전) 과도한 금속과 레지스트가 모두 제거되지 않고 아세톤이 잔류물을 남길 수 있습니다.
- 이를 위해 아세톤으로 3 개의 용기를 준비하고 웨이퍼를 아세톤으로 1 분 동안 수조합니다. 실온(RT, 20°C)에서 3kHz의 주파수로 35회 반복합니다. IPA로 헹구고 N2로 건조시킵니다.
- 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 촉매 형상의 형상을 확인합니다. VACNF 칩의 SEM 이미지를 캡처하려면 스테이지를 30° 각도로 기울이고 빔 전류가 ~100pA이고 작동 거리가 ~5mm인 1-3kV의 전압을 사용합니다.
참고: 촉매는 하키 퍽(소형 실린더)처럼 보여야 합니다(그림 4). 소형 실린더의 높이는 실리콘 웨이퍼에 증착된 Ni의 두께를 반영해야 합니다. Ni 도트의 프로파일이 길고 화산과 유사한 상단이 오목한 것처럼 보이면(그림 4) 촉매가 여러 Ni 방울로 탈축되어 탄소 나노섬유9가 분기될 가능성이 더 높습니다(그림 4 및 그림 5). 이러한 문제는 긴 증착 시간 또는 리프트 오프 절차의 문제로 인해 금속 증발 중 레지스트 용융으로 인해 발생할 수 있습니다(그림 4 및 그림 5). - 실리콘 웨이퍼를 4등분하고 아세틸렌/암모니아 혼합물과 함께 직류 플라즈마 강화 화학 기상 증착 챔버(dc-PECVD)에 넣습니다. 성장 파라미터를 최적화하여 나노섬유의 길이와 테이퍼를 제어합니다(팁 <200nm).
- 1-1.5A의 전류와 440-560V의 전압 범위를 사용하십시오. 섬유를 재배할 때 기계와 기판이 최대 620°C까지 가열되는 동안 암모니아 흐름이 있는 전처리 단계를 사용하십시오. 플라즈마를 시작하기 전에 탄소원(아세틸렌)을 10초 동안 켜야 합니다.
참고: 쿼터 웨이퍼는 PECVD 기계 실행 매개변수를 최적화해야 하는 경우에 사용됩니다. 길이가 40μm 이상이고 팁이 직경이 200nm 미만인 섬유를 생산하려면 Ni 촉매 두께가 130nm인 경우 전류 1.75A, 성장 시간 70분 및 아세틸렌 : 암모니아 비율이 분당 표준 입방 센티미터(sccm) 45 : 100sccm입니다. Ni 두께가 150nm인 경우 전류 1.5A, 성장 시간 80분, 아세틸렌 : 암모니아 비율 48sccm: 100sccm을 사용합니다. 촉매 두께에 관계없이 VACNF를 성장시키려면 620°C의 성장 온도, 플라즈마 중 10torr의 압력, 20mm의 샤워 헤드 높이를 사용합니다(그림 6).
- 1-1.5A의 전류와 440-560V의 전압 범위를 사용하십시오. 섬유를 재배할 때 기계와 기판이 최대 620°C까지 가열되는 동안 암모니아 흐름이 있는 전처리 단계를 사용하십시오. 플라즈마를 시작하기 전에 탄소원(아세틸렌)을 10초 동안 켜야 합니다.
- 1kV의 가속 전위로 30° 기울기에서 SEM을 사용하여 결과 섬유의 형상을 평가합니다.
알림: 최적의 섬유는 직선이며 분기되지 않습니다. 전자빔 증발기로 Ni 촉매의 결정 방향을 제어하는 것은 불가능합니다. 결과적으로, 촉매 탈습윤9 때문에 분기되는 일부 섬유가 있을 것이다. 또한 결정 배향으로 인해 VACNF가 다른 높이로 성장하므로 모든 VACNF에서 균일한 높이가 어렵습니다. - 포토레지스트 층(SPR955)을 1000rpm으로 섬유에 45초 동안 스핀코팅합니다. 그런 다음 다이싱 톱을 사용하여 1/4 웨이퍼를 3mm x 3mm 배열로 깍둑썰기합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 시점에서 섬유를 보관하십시오.
알림: 섬유를 유연한 기판으로 옮기려는 경우 1.11단계를 수행하지 마십시오.
2.유연한 기판에 VACNF를 랜스퍼링하는 T(그림 7 및 그림 8)
- 섬유가 합성된 후, 스핀코트 SU-8 2015 포토레지스트를 4000rpm으로 웨이퍼 또는 쿼터 웨이퍼에 45초 동안 감광합니다.
- 웨이퍼를 95°C에서 3분 동안 소프트베이킹합니다.
- 접촉 정렬기를 사용하여 95mJ/cm2에서 전자빔 리소그래피에서 정의된 패턴과 정렬되는 3mm 3mm 어레이 패턴 마스크로 웨이퍼를 노출시킵니다.
알림: 가장 높은 섬유보다 20μm 더 큰 노출 간격이 있는 근접 접촉 모드를 사용하십시오. 공정의 이 단계에서 섬유가 넘어질 가능성이 있습니다. - 95°C에서 6분 동안 노출 후 베이킹을 수행합니다.
- SU-8 현상액에서 웨이퍼를 15초 동안 현상하고 IPA로 헹구고N2로 웨이퍼를 위에서 아래로 이동하면서 건조시킵니다.
알림: 웨이퍼를 현상할 때 웨이퍼가 완전히 잠겼는지 확인하십시오. - 3000rpm에서 45초 동안 얇은 포토레지스트(SPR 955 CM 0.7)의 보호층이 있는 스핀코트 패턴 웨이퍼와 90°C에서 30초 동안 소프트베이크.
- 얇은 실리콘 산화물 층을 웨이퍼 (2-3 nm)에 증착하여 100 °C에서 22 사이클 동안 원자 층 증착에 넣습니다.
- 다이싱 톱을 사용하여 웨이퍼를 3mm x 3mm 정사각형으로 자릅니다. 다이싱 쏘를 웨이퍼의 기존 패턴에 맞춥니다.
- 3kV의 가속 전위로 30° 기울기에서 SEM을 사용하여 결과 섬유의 형상을 평가합니다.
- 장기간 사용(>1주)을 위해 칩을 보관하는 경우 여기서 중지하십시오. 칩을 어둠 속에 보관하십시오.
- 단단한 기판에서 유연한 기판을 분리하려면 개별 칩을 아세톤에 30분 동안 또는 SU-8이 말리기 시작할 때까지 놓습니다.
- SU-8 필름(단단한 기판에 부착되거나 분리됨)을 IPA로 5분 동안 세척한 다음 물로 5분 동안 세척합니다. 칩을 운반할 때 접착 패드가 있는 상업용 상자에 칩을 넣으십시오.
- 선택 사항: SU-8 필름의 섬유가 없는 면을 수용성 테이프 또는 얇은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)(12.5μm 두께) 뒷면이 있는 얇은 실리콘 고무 위에 놓습니다.
- 핀셋을 사용하여 SU-8 필름을 전사합니다. SU-8 사각형의 가장자리를 눌러 테이프/실리콘 고무-PET에 달라붙도록 합니다. 이것은 섬유가 끊어지는 것을 방지하기 위한 것입니다. 이 시점에서 VACNF 필름은 즉시 사용할 수 있습니다.
- 실리콘 고무/PET 홀더를 준비하려면 다음을 수행하십시오: 실리콘 고무용 2파트 키트를 사용하여 두 파트(엘라스토머 및 가교제)를 함께 혼합합니다. 다음으로 PET를 정사각형으로 잘라 투명한 플라스틱 접시에 테이프로 붙입니다. PET 위에 매우 얇은 실리콘 고무 층을 붓고 80°C에서 1-2시간 동안 경화시킵니다.
3. 단단한 기판의 섬유를 사용하는 온플랜트 방법(전달할 용액 한 방울을 플랜트 표면에 놓는 방법)(그림 1A)
- 사용하기 전에 아세톤(100%, 5분), IPA(100%, 5분) 및 ddH2O(5분)를 증분 세척하여 포토레지스트를 제거합니다.
- 지지대를 위해 단단한 표면에 찔릴 식물 조직을 놓습니다.
- 염료 또는 DNA(200ng)의 1μL 방울을 식물 조직 표면에 놓습니다.
- 단단한 기판이 있는 VACNF 칩을 액적 상단에 놓고 섬유가 액적과 접촉하도록 방향을 지정합니다.
참고: 칩의 방향은 웨이퍼의 "광택"에 의해 결정될 수 있습니다. 칩의 반짝이는 면에는 섬유가 있고 불투명한 면에는 섬유가 없습니다. - 핀셋의 평평한 면을 사용하여 칩을 탭합니다. 팁이 부드러운 마커를 사용하여 칩이 접촉한 식물 영역을 표시하십시오. 배송 후 VACNF 칩을 제거하십시오.
알림: 탭할 때 가해지는 힘의 양은 사용된 식물 조직의 유형에 따라 다릅니다. 섬유를 찔러넣기 전에 칩을 두드리는 연습을 하는 것이 좋습니다. 식물 조직의 손상을 피하십시오. 손상은 식물 조직에서 VACNF 칩의 윤곽을 볼 수 있을 때 명백합니다. - 대조군(+염료/DNA, -섬유, -염료/DNA, +섬유 및 -염료/DNA, -섬유)에 대해 3.1-3.5단계를 반복합니다. -섬유는 칩의 섬유가없는 면입니다.
- 필요한 경우 온전한 식물 또는 절제된 식물 기관을 긴 낮 조건(16시간 조명, 8시간 어두움)의 습한 챔버에 보관하십시오. 절제된 장기의 경우 젖은 종이 타월이 있는 플라스틱 페트리 접시를 사용하십시오.
4. 온칩 방법(전달할 용액 한 방울을 VACNF 칩에 놓는 경우), 경질 기판(그림 1B)
- 사용하기 전에 아세톤(100%, 5분), IPA(100%, 5분) 및 ddH2O(5분)를 증분 세척하여 포토레지스트를 제거합니다.
- 1μL의 염료 또는 플라스미드 DNA(200ng) 방울을 단단한 기판이 있는 VACNF 칩의 섬유 쪽에 드롭캐스트합니다. 방울을 칩 중앙에 놓고 여러 섬유를 덮으십시오. 물방울을 15분 동안 건조시킵니다.
참고: 칩의 방향은 웨이퍼의 "광택"에 의해 결정될 수 있습니다. 칩의 반짝이는 면에는 섬유가 있고 불투명한 면에는 섬유가 없습니다. - 나뭇잎이나 다른 절제된 장기로 작업할 때는 단단한 표면 위에 놓으십시오. 온전한 식물로 작업할 때는 VACNF가 적용되는 기관 아래에 단단한 표면을 놓으십시오.
- 15분 건조 단계 후 섬유 쪽이 식물 조직과 접촉하도록 VACNF 칩을 배치합니다. 핀셋의 뒤쪽 끝으로 칩을 탭합니다.
알림: 탭할 때 가해지는 힘의 양은 사용된 식물 조직의 유형에 따라 다릅니다. 칩을 두드리는 연습을 하는 것이 좋습니다. - 플랜트 분석법의 3.6-3.7단계를 반복합니다.
5. SU-8 필름의 VACNF를 온칩 방법을 사용하여 식물 조직에 적용(그림 1C)
- 염료 또는 DNA(200ng)의 1μL 방울을 SU-8 필름의 섬유 쪽에 놓고 10분 동안 건조시킵니다. 칩 중앙에 물방울을 놓아야 합니다.
알림: 사용된 기판에 따라 건조 시간이 다릅니다. - 날카로운 핀셋을 사용하여 VACNF 필름을 식물 표면에 놓습니다.
알림: SU-8 필름을 공중에 오래 방치할수록 필름이 더 부서지기 쉽습니다. SU-8 필름의 손실 위험을 제한하려면 모든 식물/샘플 및 장비를 SU-8 필름 근처에 두십시오. - VACNF 필름 위에 작은 메이크업 어플리케이터를 부드럽게 롤링합니다. 유연한 기판이 배치되는 영역을 부드러운 마커로 표시하십시오. 테이프를 사용하여 식물 표면에서 유연한 기판을 제거합니다.
알림: 메이크업 어플리케이터를 굴릴 때 가해지는 힘의 양은 사용하는 식물 조직에 따라 다릅니다. 생체 분자 또는 염료 전달을 수행하기 전에 VACNF 필름을 적용하는 연습을 합니다. 식물 조직의 눈에 띄는 손상은 식물 조직에서 VACNF 필름의 윤곽을 볼 수 있을 때 분명합니다. - on-plant 방법의 5.1단계에서 언급한 대로 대조군에 대해 5.3-3단계를 반복하고 식물을 저장합니다.
6. 모든 납품 방법에 대한 현미경 검사 및 이미지 분석
- 전달된 형광 프로브/리포터에 적합한 방출 및 여기 파장을 사용하여 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.
참고: 일시적인 변환에 필요한 시간은 식물 종과 전달된 마커에 따라 다릅니다. 예를 들어, 형광 마커의 발현은 애기장대에서 48시간 후에 검출된 반면 상추 잎에서는 96시간 후에검출되었습니다 7. - 이미징할 때 섬유가 분리된 영역에 초점을 맞추십시오. 섬유는 방향이 다릅니다. 배송의 성공은 부서진 섬유의 외관에 달려 있지 않습니다.
알림: 섬유는 PECVD18의 섬유 형성으로 인한 질화규소 층의 형성으로 인해 가장 일반적인 여기/방출 설정으로 형광이 됩니다. - 각 샘플에 대해 최소 5개의 이미지를 캡처합니다. 결과 신호는 다양합니다.
- ImageJ19를 사용하여 20 μm x 20 μm 컨포칼 이미지 영역7에서 총 형광(통합 밀도)으로 형광 값을 측정합니다.
Representative Results
경질 또는 연성 기판에서 VACNF 칩의 뚜렷한 장점은 생체 분자 또는 염료를 식물의 특정 위치로 전달할 수 있다는 것입니다(그림 1). 여기서는 전달을 평가하기 위해 형광 판독을 사용했습니다. 다양한 식물, 기판 및 전달 방법(온칩 또는 온플랜트)을 사용하면 염료 플루오레세인이 나타나는 시기에 차이가 있을 수 있습니다. VACNF 칩/필름이 전달에 적합한지 여부를 확인하기 위한 빠른 접근 방식은 염료 전달에 섬유를 사용하는 것입니다(그림 9). 그림 9에서 서로 다른 시간으로 라벨링된 이미지는 동일한 샘플에서 서로 다른 시야를 나타냅니다. on-plant 방법을 사용하는 경우 형광 현미경을 사용하여 전달 직후 플루오레세인 염료를 관찰할 수 있습니다. 또한 플루오레세인 염료를 식물에 전달한 후 시간이 지남에 따라 동일한 시야를 이미지화하면 시간이 지남에 따라 신호 강도가 낮아집니다(그림 10). 플루오레세인 염료는 잠재적으로 플라스모데스마타20,21을 통해 시야에서 잎의 다른 영역으로 이동할 수 있습니다. 온플랜트 분석법과 비교했을 때, 단단한 기판에 섬유를 사용하는 온칩 분석법에서는 염료가 찔린 영역 전체에서 더 느리게 움직입니다(그림 9). 이는 염료가 섬유에서 분리되거나 세포에서 재수화되어 이동하는 데 더 많은 시간이 걸리기 때문일 수 있습니다.
유연한 기판의 섬유는 딸기 및 사과와 같은 곡면으로의 염료 전달에 적합했습니다(그림 11 및 그림 12). 딸기가 있는 유연한 기질을 사용하면 강한 플루오레세인 신호가 즉시 관찰된 반면(그림 11), 사과에서는 강한 플루오레세인 신호를 보는 데 2시간이 걸렸습니다(그림 12B,D). 형광 마커를 인코딩하는 플라스미드의 성공적인 전달은 형광 현미경을 사용하여 결과 신호를 찾는 데 사용할 수 있습니다(그림 12F, 그림 13 및 그림 14). 선택한 식물에 섬유로 전달하려는 형광 마커와 유사한 자가형광이 없는지 여부를 결정하기 위해 제어가 필요합니다. 섬유를 단독으로 사용하면 핀셋에 가해지는 충격력이 식물 조직에 손상을 주는지 또는 시료 내에서 관찰된 형광이 질화규소 층18로 인해 본질적으로 형광을 내는 VACNF에 의한 것인지 확인하는 데 도움이 됩니다(그림 13C-D). 식물 조직에 찔린 섬유는H2O2생산 6에 의해 평가된 바와 같이 상처 반응을 유도하지 않는다. 마지막으로, +DNA의 제어를 사용하여 -섬유는 DNA가 탭핑만으로 식물에 들어가지 않는다는 것을 확인하고 섬유가 식물 세포로 전달되는 데 필요하다는 것을 확인하는 데 필요합니다(그림 13E-F). 경질 기판에서 VACNF를 사용하는 온플랜트 또는 온칩 전달 방법을 사용할 때 형광 값에 큰 차이가 없다는 점에서 뚜렷한 차이가 없어야 합니다(그림 13I). 온칩 DNA 전달과 함께 유연한 VACNF 필름을 사용한 결과 상점에서 구입한 사과와 양파에서 표피 세포의 일시적인 변형이 성공적으로 이루어졌습니다(그림 12F 및 그림 14).
실패한 실험은 다른 시야에서 섬유가 끊어질 수 있지만 플라스미드 DNA 또는 염료를 전달하려는 시도에서 발생하는 형광 신호는 없습니다. 식물에 너무 많은 압력이 가해지면 명백한 조직 손상이 발생합니다(그림 15). 이러한 기계적 손상은 현미경으로 식물을 볼 때 세포 층이 제거된 것처럼 식물의 작은 구멍이나 투명한 영역처럼 보일 수 있습니다. 때때로 칩의 자국이 보일 수 있습니다. DNA 전달 후 형광 단백질 발현이 검출되지 않는 실험은 품질이 낮은 DNA를 사용하기 때문일 수도 있으므로 새로운 DNA를 제조하는 것이 유용할 수 있습니다.
그림 1: 단단하고 유연한 기판의 섬유를 사용하여 식물 조직에 대한 염료/DNA 전달의 개략도. (A) 식물 내 섬유 매개 염료/DNA 전달. 염료/DNA 용액의 1μL 방울을 잎 표면에 놓고 VACNF 칩을 방울 위에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 칩을 조직에 부드럽게 두드립니다. 단단한 기질이 제거되고 조직 내에 나노 섬유가 남습니다. (B) 온칩 섬유 매개 DNA 전달. 염료 또는 DNA 용액의 1μL 방울을 VACNF 칩에 드롭캐스트하고 15분 동안 건조합니다. 반건조된 DNA가 있는 칩을 잎 표면 위에 놓고 패널 A에서와 같이 조직에 두드립니다. (C) 온칩 SU-8 필름 DNA 전달. 섬유는 단단한 실리콘 기판에서 유연한 SU-8 백킹으로 전달됩니다. 염료/DNA 용액 1μL를 VACNF 필름에 드롭캐스트하고 10분 동안 건조합니다. 그런 다음 반건조된 염료/DNA가 포함된 VACNF 필름을 메이크업 어플리케이터를 사용하여 구부러진 식물 표면에 롤링합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이를 만들기 위한 워크플로. VACNF를 생산하기 위해 폴리메틸 메타크릴레이트의 이중층(PMMA 495 A4 및 PMMA 950 A2)을 실리콘 웨이퍼에 스핀 코팅합니다. 전자빔 리소그래피는 직경 300nm의 도트 어레이를 정의하는 데 사용됩니다. 그런 다음 레지스트를 메틸 이소부틸 케톤/이소프로판올(MIBK/IPA)에서 1.5분 동안 1:3으로 현상합니다. 금속 증발기를 사용하여 Ti(10nm)의 접착층이 웨이퍼에 도포된 후 Ni(130nm 또는 150nm)의 층이 도포됩니다. 나머지 레지스트는 리프트 오프 (아세톤의 수조 초음파 처리)를 통해 제거됩니다. 촉매 도트의 형상은 SEM을 통해 검사됩니다. 촉매가 하키 퍽과 비슷하고 평평하면 플라즈마 강화 화학 기상 증착(PECVD) 기계에 넣고 섬유를 성장시킵니다. 그런 다음 SEM을 사용하여 섬유를 검사했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 수직으로 정렬된 이상적인 탄소 나노섬유의 SEM 이미지. (A) ~35μm 피치와 10-15μm 높이의 VACNF의 전자 현미경 사진, 30° 각도로 이미지화. 이 이미지는 그림 7C에 복제되어 있습니다. (B) ~20μm 피치 및 20-30μm 높이의 VANCF의 전자 현미경 사진, 30° 각도로 이미지화. (C) ~35μm 피치, 50-60μm 높이, 30° 각도로 이미징된 VANCF의 전자 현미경 사진. (D) 직경 <200nm의 VACNF 팁의 전자 현미경 사진. 섬유 팁 직경(150-300nm)에 차이가 있습니다. 섬유가 30° 각도로 이미지화되었기 때문에 높이는 sin(30°)=1/2의 계수만큼 실제 높이보다 작게 보입니다. 패널 A와 B는 Morgan et al.7의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: VACNF를 성장시키기 전 촉매 형상의 SEM 이미지. (A) 리프트오프 후 촉매의 SEM 이미지. 포토레지스트는 촉매의 가장자리 주위에 존재하여 화산 모양을 만듭니다. (나,씨) SEM 이미지는 단층 PMMA 레지스트를 사용한 후 촉매의 화산 모양을 보여줍니다. (D) PMMA의 이중층으로 만든 원하는 하키 퍽 촉매 모양. 패널 A, B, D에서 섬유를 30° 각도로 이미지화했기 때문에 높이는 sin(30°) = 1/2만큼 실제 높이보다 작게 보입니다. 척도 막대는 100nm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 촉매 도트 크기가 섬유 성장에 미치는 영향: 촉매 물질의 최적 직경을 설정하기 위해 섬유를 200-600nm 범위의 도트 크기에서 성장시켰습니다. 400-600nm 범위의 도트 크기는 촉매의 탈습윤과 여러 섬유의 성장으로 이어졌습니다. 최고의 섬유 형상은 300nm 직경으로 생산되었습니다. 점이 작을수록 섬유 높이가 충분하지 않습니다. 섬유를 30° 각도로 이미지화했기 때문에 높이는 sin(30°) = 1/2의 계수만큼 실제 높이보다 작은 것으로 보입니다. 이미지는 주사 전자 현미경 사진을 사용하여 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: Oak Ridge National Laboratory(ORNL)에서 사용되는 직류 플라즈마 강화 화학 기상 증착(dc-PECVD) 시스템의 개략도. ORNL의 맞춤형 시스템에는 공급 가스 및 플라즈마 출력의 반응기 역할을 하는 대형 샤워헤드가 있습니다. 샤워 헤드는 기판의 가열된 스테이지에 대해 300V의 DC 전위로 유지되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 단단한 기판에서 유연한 기판으로 섬유를 옮기는 작업 흐름. 나노 섬유 합성 및 검사 후 각 웨이퍼는 4000rpm에서 SU-8 2015로 45초 동안 스핀 코팅됩니다. 그런 다음 웨이퍼를 95°C에서 3분 동안 소프트 베이킹합니다. 그런 다음 웨이퍼를 UV 광에 노출시키고 95mJ/cm2의 마스크 얼라이너에서 패터닝합니다. 95°C에서 6분 동안 포스트베이킹한 후, 웨이퍼를 SU-8 현상액에서 15초 동안 현상하고, IPA로 헹구고,N2 가스로 건조시킨다. SPR 955 CM 0.7의 보호 레지스트층을 3000rpm으로 웨이퍼에 스핀 코팅하고 90°C에서 30초 동안 소프트베이크합니다. 그런 다음 실리콘 산화물 층 (2-3 nm)을 원자층 증착 (ALD) (100 ° C에서 22 사이클)을 통해 웨이퍼에 첨가하여 유연한 기판을 친수성15로 만듭니다. 그런 다음 웨이퍼를 다이싱 톱으로 3mm x 3mm 정사각형으로 다이싱합니다. 사용 시 SU-8이 말리기 시작하고 오목해질 때까지 개별 칩을 아세톤에 넣습니다(>30분). 이때 대부분의 칩에서 SU-8 층은 날카로운 핀셋으로 가장자리를 잡고 기본 실리콘 기판에서 온전한 3mm 정사각형 필름으로 벗겨낼 수 있습니다. 그런 다음 필름을 IPA와 물로 각각 5분 동안 연속적으로 세척하고 즉시 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 단단한 기판에서 유연한 기판으로 이동하는 섬유의 SEM 이미지. 표시된 이미지는 대표적이지만 다른 샘플에서 가져온 것입니다. (A) PECVD 성장 후의 장섬유( 그림 2C와 동일한 이미지). (나,씨) SU-8 적용 후 섬유. 에폭시는 섬유 바닥 주위로 솟아오릅니다. 노출된 섬유 길이는 5μm에서 30μm 사이였습니다. (D) 이륙 후 Su-8에 내장된 섬유는 형상을 유지했습니다. 섬유가 30° 각도로 이미지화되었기 때문에 높이는 sin(30°)=1/2의 계수만큼 실제 높이보다 작게 보입니다. 패널 A는 Morgan et al.7의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 애기장대 잎에 대한 염료 전달은 단단한 기판에 섬유를 사용한 온칩(on-chip) 및 온플랜트(on-plant) 방법을 사용합니다. (에이피) 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득했습니다. 온칩 방법(AH): 10μM 플루오레세인 염료 1μL를 VACNF 칩에서 15분 동안 건조시킨 다음 핀셋으로 애기장대 잎의 축축면에 칩을 두드렸습니다. (서기-인도) 분만 후 5-15분 이내에 이미지를 촬영합니다. (E-H) 출산 후 1시간 후에 촬영된 잎사귀. (A,E) +염료, +섬유. 제어 : (B, F) -염료, -섬유; (C, G) - 염료, + 섬유; (D, H) + 염료, -섬유. (I-P) 식물 내 방법: 10μM 플루오레세인 염료 1μL를 식물 표면에 놓고 칩을 물방울과 접촉하도록 배치한 다음 핀셋을 사용하여 칩을 애기장대 잎의 축축면에 두드렸습니다. (I-L)은 분만 후 5-15분 이내에 촬영되고 (M-P)는 분만 후 1시간 이내에 촬영됩니다. (I,M) +염료, +섬유. 대조군: (J,N) -염료, -섬유; (K, O) - 염료, + 섬유; (L, P) + 염료, -섬유. 패널 A-P는 z-스택의 단일 평면 이미지입니다. 스케일 바는 20 μm입니다. 섬유의 피치는 35μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 애기장대(Arabidopsis)에서 경질 기판을 사용한 식물 내 방법을 통한 염료 전달 시간 경과. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득했습니다. 온플랜트 방법을 사용하여 플루오레세인 염료 용액(10μM) 1μL 방울을 잎 표면에 놓고 VACNF 칩을 방울 위에 놓았습니다. 핀셋을 사용하여 칩을 조직에 부드럽게 두드렸습니다. 동일한 영역의 +염료, +섬유 이미지가 5분마다 획득되었습니다. 스케일 바는 20 μm입니다. 섬유의 피치는 35μm입니다. 패널은 z-스택의 단일 평면 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: VACNF 필름을 사용하여 딸기 과일에 염료 전달. (AH) 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득했습니다. 온칩 방법을 사용하여 염료 방울을 VACNF 필름에서 건조시킨 다음 메이크업 어플리케이터를 사용하여 과일 표면에 롤링했습니다. 플루오레세인 염료(10μM)를 딸기 세포에 전달하고, (A) 10분 및 (B) 1시간 후 (C,D) 무처리 대조군(-Dye, -Fibers)을 이미지화하였다. (E,F) -염료, +섬유는 각각 10분 및 1시간 후에 제어합니다. (G,H) +염료, -섬유는 각각 10분 및 1시간 후에 제어됩니다. 눈금 막대는 40μm입니다. 패널 AH는 188μm z-스택의 최대 돌출부입니다. 섬유의 피치는 35μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: VACNF 필름을 통한 사과의 염료 전달 및 일시적인 변형. (A-F) 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 생성되었습니다. 온칩 방법을 사용하여 플루오레세인 염료(10μM, B 및 D) 1μL 방울 또는 pUBQ10:YFP(DNA−YFP)(200ng)를 인코딩하는 1μL의 플라스미드 방울을 VACNF 필름에서 건조시킨 다음 메이크업 어플리케이터를 사용하여 과일 표면에 롤링했습니다. 플루오레세인 염료를 사과 표피에 전달하고 (B) 10분 및 (D) 2시간 후에 이미징하였다. (D) 염료는 전달 후 세포로 확산되는 데 약간의 시간이 걸렸다. (F) 48시간 (A,C,E) 후 VACNF 필름을 통한 DNA-YFP 전달 및 발현 처리 대조군 없음(-염료/DNA-YFP, -섬유). 스케일 바는 40μm입니다. 패널 A-D는 z-스택의 단일 평면 이미지입니다. 패널 E와 F는 53μm z-스택의 최대 돌출부입니다. 섬유 피치는 35μm입니다. 화살표는 플루오레세인 또는 YFP 신호를 나타냅니다. *는 섬유를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13: on−plant 또는 on−chip VACNFs 방법을 사용한 애기장대 잎의 일시적인 변형. (ᅡ-H) 이미지는 DNA 전달 후 48시간 후에 컨포칼 현미경을 사용하여 획득하였다. (ᅡ,ᄃ,ᄂ,ᄂ) 식물 내 방법: pUBQ10:YFP(DNA−YFP)(200ng)를 인코딩하는 1μL의 플라스미드를 애기장대 잎의 축방향 측면에 배치했습니다. 칩은 물방울과 접촉하도록 배치되었고, 핀셋 도자기는 칩을 잎 조직에 두드리는 데 사용되었습니다. (비, 디, 에프, H) 온칩 방법: 1μL의 DNA−YFP(200ng)를 VACNF 칩에서 15분 동안 건조시킨 다음 칩을 핀셋으로 애기장대 잎의 축축면에 두드렸습니다. +DNA-YFP, +(A) 온플랜트 및 (B) 온칩용 섬유. 대조군: (C,D) -DNA-YFP, + 섬유; (E, F) + DNA-YFP, -섬유; 및 (G,H) -DNA, -섬유. (I) YFP 채널의 형광을 사용하여 2-3개의 실험에서 결합된 5개의 생물학적 복제 이미지에서 25, 20 × 20μm 영역의 상대 평균 형광 신호 강도 그래프. 기공(*)을 포함하는 영역은 자가형광으로 인해 제외되었습니다. -DNA-YFP, -섬유 조건으로부터의 평균 형광 강도를 각 평균에서 뺐다. 유의성 검정에는 2차 분산 분석(및 Tukey 검정)이 사용되었으며 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 글자가 다르면 처리 간에 유의한 차이가 있습니다(P < 0.0001). 표시된 모든 이미지는 40μm z-stack의 최대 투영입니다. 스케일 바는 20 μm입니다. 흰색 화살표는 이미지의 섬유를 나타냅니다. 섬유 피치는 35μm입니다. 이 그림은 Morgan et al.7의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 14: VACNF 필름을 사용한 양파의 과도 변형. 이미지는 DNA 전달 후 48시간 후에 컨포칼 현미경을 사용하여 획득했습니다. 온칩 방법을 사용하여 pUBQ 10:YFP(DNA-YFP)(200ng) 방울을 인코딩하는 1μL 플라스미드 DNA를 VACNF 필름에서10분 동안 건조시킨 다음 식물 장기 표면에 롤링했습니다. (A) DNA-YFP를 전달하고, 양파 표피에서 YFP를 발현시켰다. (B) 치료 통제 없음; (C) 대조군 (+DNA-YFP, -섬유) 및 (D) 대조군 (-DNA-YFP, +섬유). 눈금 막대는 40μm입니다. 섬유의 피치는 35μm입니다. 이미지는 115μm z-스택의 최대 투영입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 15: VACNF 필름 적용으로 인한 양상추의 조직 손상 . (A-D) 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 생성되었습니다. (A) 온칩 방법은 VACNF 필름을 통해 양상추 잎에 DNA를 전달하는 데 사용되었습니다. pUBQ 10:YFP DNA(200ng) 방울을 VACNF 필름에서10분 동안 건조시킨 후, 분리된 상추 잎의 축면에 말아서 습도 챔버에 4일 동안 보관했습니다. (B) 대조군(-DNA-YFP, +섬유). (C) 대조군(+DNA-YFP, -섬유) 및 (D) 무처리(-DNA-YFP, -섬유). 스케일 바는 40 μm입니다. VACNF의 피치는 35 μm입니다. 화살표는 너무 많은 힘으로 유연한 기판을 굴려 발생하는 식물 손상을 가리킵니다. 양상추에서 성공적인 VACNF 매개 DNA 전달은 다른 실험에서도 달성되었습니다7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 16: 플랜트에서 VACNF 매개 전달의 워크플로우. Stage I에서 SEM을 사용하여 섬유의 형상을 확인합니다. 적절한 전달을 위해 섬유는 직경 <200nm의 팁이 필요합니다. 유연한 기판에 섬유를 사용하는 경우 다음 단계는 섬유가 SU-8로 전달되고 있는지 확인하고 SEM을 통해 노출된 섬유의 높이를 확인하는 것입니다. 2단계에서는 단단하거나 유연한 기질을 사용하여 선택한 식물/기관에 염료를 전달하여 섬유의 유용성을 테스트했습니다. 1μL 방울을 식물 표면에 놓거나 칩/필름에서 잠시 건조시켜 사용합니다. 이 단계와 다른 모든 단계에서 적절한 제어(-Dye,-Fibers; -Dye, +Fibers; 및 +Dye,-Fibers)를 사용하여 신호가 실제 염료 전달에서 온다는 것을 확신하는 것이 중요합니다. III단계에서는 플라스미드에 관심 유전자가 존재하는지 확인하고, 전달할 DNA의 농도를 결정하고, 전달 후 발현을 확인하기 위한 최적의 시간을 테스트합니다. IV단계에서는 전달된 마커의 발현을 확인하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 결과를 평가했습니다. 이 그림은 Morgan et al.7의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 논문에서 우리는 수직으로 정렬된 탄소 나노섬유 어레이를 구성하고, 섬유를 유연한 기판으로 옮기고, 생체분자 또는 염료를 식물에 전달하기 위해 식물에 단단하거나 유연한 기판의 섬유를 적용하는 방법을 제시했습니다. 도입된 물질의 증착을 위한 온칩(on-chip) 및 온플랜트(on-plant) 방법의 두 가지 일반적인 접근 방식을 설명했으며, VACNF 필름을 사용한 온칩 방법뿐만 아니라 경질 기판의 섬유에서 성공적인 결과를 보여주었습니다. 이러한 섬유의 적용은 전통적인 식물 변형 방법(입자 충격, PEG를 통한 원형체 변형 또는 전기천공법)보다 실제와 이론적으로 더 간단하며 Agrobacterium 매개 변형에 난치하는 식물에 사용할 수 있습니다. 그러나 소수의 셀만 변환됩니다.
수직으로 정렬된 탄소 나노 섬유는 사용자 프로그램을 통해 Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences에서 생산되었습니다. 사용자는 VACNF 생산을 위해 이 시설 사용을 신청할 수 있습니다. 대안적으로, VACNF 칩은 탄소원22,23을 갖는 직류 플라즈마 강화 화학 기상 증착 기계를 사용하여 클린룸에서 생산할 수 있습니다. 설명된 방법에는 섬유 생산, 섬유 전달 및 VACNF 칩/필름 적용에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 섬유 적용이 작동하려면 섬유가 직선이어야 하며 식물 세포에 전달되기 위해 팁에서 <200nm의 테이퍼링 직경이 있어야 합니다 6,7(그림 3). 특정 크기와 피치의 탄소 나노섬유를 만들기 위해 도트 크기, 측면 피치 및 증착된 촉매의 양을 포함하여 변경할 수 있는 다양한 매개변수가 있습니다. 탄소 나노섬유 생산에 사용할 최적의 도트 크기를 선택하기 위해 다양한 도트 크기에서 섬유를 성장시켰습니다(그림 5 참조). 300nm 직경에서 최상의 섬유가 생성된다는 것을 발견했기 때문에 이 도트 크기를 선택했습니다(그림 5). 올바른 매개변수를 찾은 후 이상적인 형상(직선 및 팁 직경 <200nm)의 섬유가 >50% 있는 칩을 사용하려고 했습니다. 섬유의 형상을 확인하기 위해 주사 전자 현미경을 사용하여 VACNF 칩/필름 샘플에서 임의의 시야를 이미지화했습니다.
또한 섬유는 식물 세포 내에서 전달을 달성하기 위해 특정 최소 길이를 가져야 합니다. 길이가 다른 섬유를 생산하는 것의 중요성은 더 긴 섬유를 사용하여 더 깊은 조직층을 관통할 수 있다는 것입니다. 더 긴 섬유(길이 >40μm)는 섬유 전달이 베이스에서 섬유를 분리하여 작동하고 섬유 위에 SU-8을 레이어링해야 하기 때문에 유연한 필름에 필수적입니다. 이 프로토콜에 사용되는 SU-8 층의 작업 두께는 20-35 μm입니다. 다양한 식물의 표피 (곡선 또는 평면)에서 전달을 수행하는 데 필요한 최소 높이는 10-15 μm 6,7입니다. 결과적으로 VACNF 필름에는 길이가 >40μm인 섬유가 필요합니다. 탄소 나노 섬유를 생산할 때 고려해야 할 몇 가지 매개 변수가 있습니다 : 촉매 재료, 촉매 형상, 촉매 재료의 두께 및 PECVD 챔버 내 조건 (가스 비율, 압력, 온도, 전류, 샤워 헤드 높이 및 성장 시간) 8,9,24,25. Morgan et al.7 및 Davern et al.6에서 사용하는 25μm 이상의 탄소 나노섬유를 생산하기 위해 Ni 촉매의 양을 늘리고 아세틸렌 : 암모니아 비율을 변경하여 전류 및 성장 시간을 늘렸습니다. 또한 촉매 재료의 형상에 더 많은 관심을 기울였습니다. 키가 큰 직선 섬유를 생산하기 위해서는 증착된 촉매가 화산을 닮은 모양이 아니라 하키 퍽 모양을 가져야 했습니다(그림 4). 화산 구조는 이륙 후 포토레지스트의 잔해에서 발생합니다. 화산의 형성을 방지하기 위해, PMMA의 이중층을 사용하여 전자빔 리소그래피26 동안 언더컷을 생성하였다. 언더컷은 증착된 금속 촉매의 리프트오프를 돕습니다(그림 2). 촉매의 두꺼운 층은 키가 큰 VACNF의 성장에 중요합니다. VACNF의 형태는 Merkulova et al.24에 의해 조사되었습니다. VACNF의 수직 정렬은 Ni 촉매 팁 유형 성장과 기판에 수직인 DC 전위의 정렬에 기인합니다(그림 6). 샤워헤드는 PECVD 반응기(그림 6)의 기하학적 구조를 설명하고, 전기장(27)의 전위(27)에 대한 소스로서 기능한다.
전자빔 리소그래피로 촉매 도트 배열을 정의하기 위해 전자빔 레지스트(폴리메틸 메타크릴레이트)를 적용한 다음 e-빔을 사용하여 웨이퍼의 특정 위치와 특정 모양으로 레지스트에 작은 구멍을 만들었습니다. 원하는 직경의 구멍을 정의된 간격(피치)으로 일반 그리드에 배치하고 기판을 기계에 로드하기 전에 원하는 패턴을 지정하는 파일을 전자빔 리소그래피 도구에 로드했습니다. 섬유 높이 외에도 성공적인 섬유 전달을 위한 또 다른 중요한 매개변수는 아세톤 수조에서 보내는 시간입니다. VACNF 필름은 가장자리가 말리기 시작할 때까지 아세톤 수조에 충분히 오래 두어야 합니다. 아세톤 수조에 너무 짧은 시간 동안 방치하면 칩을 들어 올리기가 더 어렵고 파손될 수 있습니다. 칩이 오래될수록 아세톤 수조에 더 오래 남아 있어야 합니다. 아세톤 배스 후, 필름/칩을 이소프로판올과 물에 넣어 접근 아세톤을 제거하고 섬유의 보호 감광액을 제거했습니다.
스핀 코팅을 수행하기 위해 웨이퍼 또는 웨이퍼 조각을 스핀 코터의 진공 척에 놓고 스핀 코터의 테스트 기능을 사용하여 웨이퍼의 중심 위치를 확인합니다. 레지스트의 작은 웅덩이(직경 ~2.5cm)를 웨이퍼 중앙에 적용하고 회전(45초 동안 3000rpm) 스핀 코팅 전후의 섬유 이미지가 섬유 형상(높이, 방향 및 피치)의 보존을 보여주는 그림 8에 포함되어 있습니다. 섬유의 존재는 섬유의 기초에서 레지스트가 솟아오르게 하고 예상보다 두꺼운 층을 초래합니다. VACNF 성장 후 스핀 코팅은 다른 그룹에 의해 탐구되었습니다11,18.
공정에서 매우 중요한 또 다른 단계는 VACNF 칩/필름에 적절한 양의 힘이 가해지도록 하는 것입니다. 전달 메카니즘은 핀셋의 임펄스력을 통해 세포벽에 작은 구멍을 뚫거나, 단단한 기판(6,7)을 두드리거나, 유연한 기판 상에서 미니-메이크업 어플리케이터로 롤링하는 섬유에 의존한다. 섬유는 분리될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있고 결과에 영향을 미치지 않고 식물 세포에 박혀 있을 수도 있지만(6,7), 적절한 압력을 얻기 위해서는 염료 흡수 및 조직 손상에 대한 검사와 함께 연습해야 합니다. 또한 검출 가능한 발현까지의 시간은 식물 종과 전달되는 벡터 유형에 따라 다르기 때문에 VACNF 칩/필름을 사용한 DNA 전달 후 적절한 이미징 시점을 선택하는 것이 중요합니다7(그림 16).
이 방법은 식물에 광범위하게 적용할 수 있지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, VACNF 필름에 얇은 실리콘 산화물 층을 추가해도 SU-8 위에 포토레지스트 보호층이 추가되기 때문에 필름이 항상 완전히 친수성이 되는 것은 아닙니다. 이 문제가 현실화되면 더 두꺼운 실리콘 산화물 층이 VACNF에 적용될 수 있습니다. 필름이 소수성인지 친수성인지 테스트하기 위해 물에 넣을 수 있습니다. 필름이 가라앉으면 친수성이고 뜨면 소수성입니다. 또한 생산된 섬유 배치 간에 차이가 있을 수 있습니다. dc-PECVD 기계에서 섬유를 성장시킬 때 변경할 수 있는 몇 가지 매개변수가 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 것은 두 가지 다른 양의 Ni 촉매에 대한 파라미터 세트입니다. 또한, Ni 촉매의 결정 배향은 제어될 수 없으며(28 ) 일부 분지화는 필연적으로 섬유를 초래할 것이다.
이 논문에서는 경질 및 연질 기질을 모두 사용하여 식물 세포에 플루오레세인 염료와 DNA를 전달하는 방법을 입증했지만, 이 방법은 다른 생체 분자 및 유전자 변형 접근법(예: 안정적인 형질전환 계통을 생산하는 데 수년이 걸리는 사과 또는 기타 과일과 같은 식물 시스템에 대한 RNAi 침묵)에 광범위하게 적용할 수 있어야 합니다. 또한, 이러한 섬유는 유전자 편집 물질을 전달하거나 식물의 안정적인 형질전환에도 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
나노 섬유 어레이는 과학 사용자 시설의 에너지부 사무소 (제안 ID : CNMS2019-103 및 CNMS2022-A-1182)인 나노 위상 재료 과학 센터에서 제작되었습니다. CNMS의 지원은 동료 심사 제안 시스템을 통해 수여되며 결과를 게시하려는 성공적인 지원자(http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml)에게 무료로 제공됩니다. 나노 섬유 어레이 생산에 도움을 주신 Kevin Lester와 CNMS에 감사드립니다. 실험 설계에 대한 중요한 토론을 해주신 John Caughmen 박사, Timothy McKnight 박사, Amber Webb 박사, Daryl Briggs, Travis Bee 박사에게 감사드립니다. PECVD 기계의 회로도를 설명해 주신 Adam Rondinone 박사님께 감사드립니다. 과학적인 삽화를 제공해 준 Leslie Carol에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 에너지부, 과학, 생물 및 환경 연구실, DE-SC0019104 및 미국 농무부(2021-67013-34835)의 바이오이미징 과학 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. JMM은 미국 농무부: 국립 식량 농업 연구소: 농업 및 식품 연구 이니셔티브 박사 전 펠로우십 2021-67034-35167의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
| 2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
| 4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
| 4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
| Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
| Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
| Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
| Apples | Grocery store | No product number | |
| Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
| Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
| Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
| Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
| Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
| Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
| ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
| Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
| JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
| Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
| Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
| Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
| LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
| Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
| Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
| MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
| Onions | Grocery store | No product number | |
| Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
| PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
| PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
| Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
| pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
| Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
| Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
| Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
| Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
| SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
| Strawberries | Grocery store | No product number | |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
| Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
| Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |
References
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